Marcadores Moleculares 1)Marcadores genéticos 2)Categorías de preguntas 3)Desde aloenzimas a NGS.
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Marcadores Moleculares
1) Marcadores genéticos
2) Categorías de preguntas
3) Desde aloenzimas a NGS
Marcador Carácter o rasgo detectable, variable y diferenciable
Marcador genético Un carácter de un individuo que se transmite a su descendencia… por lo tanto, permite diferenciar entre individuos/población/taxa
- Difieren en la cantidad de variabilidad que ilustran. Ajustar el tipo de marcador a cada problema y su escala espacial.
- Tipos de marcadores: codominantes (patrones de bandas distinguibles en homocigotos y en heterocigotos), dominantes.
- Los marcadores difieren en el tipo de herencia: . ADN nuclear biparental. ADN citoplásmico (mtDNA; cpDNA) uniparental.
Categorías de preguntas
Entre especies: filogeografía/filogenia
Entre poblaciones: Conectividad, estructura, filogeografía
Individuos: parentesco, endogamia, consanguinidad
Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía
AABB
C
DC
D
1
2
3
4
DNA
CromosomaIndividuo
Alelo a un locus
Población
Especie
Alozimas: Formas alternativas de una enzima que difieren en la secuencia de sus aminoácidos, Se reconoce por electroforesis o alguna propiedad
Marcador Codominante
. Permite indentificar distintos alelos de proteínas (enzimas) en base a su tasa de migración en un gel de almidón
. Cálculo de frecuencias génicas
. Utilizadas para comparar poblaciones
Marcadores Bioquímicos
Preparación y corrida del gel
Inoculación de las muestras previamente preparadas que contienen el universo total de proteínas presentes en un tejido
Corrida electroforética
Corte y tinción específica del gel
Análisis: Distintos paquetes computacionales
(Biosys, Genepop, Popgene, Arlequin, Genetix, etc)
Las distintas proteínas migran según:
. Su carga neta
. Su peso molecular
Locus: ESTERASA
DIVERSIDAD GENÉTICA:
Número de alelos
Frecuencia de cada alelo
Heterocigocidad
Locus: ESTERASA
DIVERSIDAD GENÉTICA:
Número de alelos 2
Frecuencia de cada alelo
A1: 24/50 A2: 26/50
Heterocigocidad 12/25
A1
A2
Proteína dimérica
Proteínas monoméricas conformada por dos loci
L1
L2
Categorías de preguntas
Entre poblaciones: Conectividad, estructura, filogeografía
Individuos: parentesco, endogamia, consanguinidad
Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía
1
2
3
¿Una técnica del pasado?
Ventajas: • Relativamente sencilla e implementable
Desventajas: • Proteínas fácilmente se denaturan (mantenerlas a –70°C)
• Menor grado de variación que la secuencia de DNA
• A pesar de ser genes funcionales se asume su “Neutralidad”
• Muchas mutaciones pueden pasar inadvertidas (código genético degenerado o Aa con igual carga y tamaño)
¿Una técnica del pasado?
Marcadores Moleculares
Marcadores genéticos basados en la secuencia del ADN, permiten detectar varición genética.
Ventajas:
- Muestras fijadas en alcohol (Nitrógeno liquido, -80°C)
- Distintos tipos de muestras/muestreos
Marcadores Moleculares
COLECTAS DE ORGANISMOS ACUÁTICOS
BAHAMAS
Antarctica
COLECTAS DE ORGANISMOS NO ACUÁTICOS
TECNICAS DE MUESTREO
• MUY invasivo (= muerto)
• Invasivo (= sangre, biopsias, trocitos de tejidos)
• No invasivo
MUESTREO MUY INVASIVO
MUESTREO NO MUY INVASIVO
* Cotones de algodón comercial, esterilizadas mediante autoclave.MUESTREO CASI NO INVASIVO
TECNICAS DE MUESTREO NO INVASIVO
• Muestra de museo• Carcasas• Pelos• Plumas• Cáscara de huevo• Fecas
¡Confirmar especie!
Contaminación
COLECTAS BOTÁNICAS
Material para extracción de ADN
Sílica geloSecar rápido
Conservar en frío -N2 líquido
Material para extracción de ARN-Proteinas
http://lem.dm.cl
¡Por fin en el laboratorio!
Preparación de DNA
Las metodologías de extracción de DNA buscan:
• Maximizar la recuperación de DNA• Remover inhibidores• Remover e inhibir las nucleasas• Maximizar la calidad del DNA obtenido
Cuanto DNA se puede obtener:
• Célula diploide humana 6pg de DNA• Espermatozoides contienen 3pg de DNA
Lisis celular
Remoción de proteínas
Precipitación
• SDS, sarcosyl• CTAB
• Proteinasa K• Lisozimas
• Frío• Sonicación• Molienda
Química
Enzimática
Mecánica
Alcoholes • Ethanol• Iso-propanol
• Fenol• Cloroformo
• Cloruro de sodio• Acetato de Sodio
• Membrana
Solventes orgánicos
Salt
Unión al ADN
Preparación de ADN
ADN PCR
Métodos basados en PCR
Polymerase Chain Reaction
Problema: ¿como conseguir suficientes copias de un gen para
poder manipularlo y observarlo?
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.
Reacción de extención de partidores (cebadores, primers) utilizada para amplificar regiones específicas del ADN.
95ºC 95ºC 72ºC 72ºC
50-65ºC
4ºCx 35 (ciclos)
5’ 30’’
45’’
1’ 4’
8
G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
5’3’
5’T G C G C G G C C C A
3’
. Polimerasa
. Nucleótidos (A, T, C, G)
. Primers
95ºC 95ºC 72ºC 72ºC
50-65ºC
4ºCx 35 (ciclos)
5’ 30’’
45’’
1’ 4’8
G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
5’3’
5’T G C G C G G C C C A
3’
95ºC 95ºC 72ºC 72ºC
50-65ºC
4ºCx 35 (ciclos)
5’ 30’’
45’’
1’ 4’8
Denaturación
G T C T T G G G C T A G C G C
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’
5’T G C G C G G C C C A
3’
95ºC 95ºC 72ºC 72ºC
50-65ºC
4ºCx 35 (ciclos)
5’ 30’’
45’’
1’ 4’8
Denaturación
G T C T T G G G C T A G C G C
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’
5’T G C G C G G C C C A
Anealing
5’T G C G C G G C
Primer 3’
3’C G A T C G C G
Primer
3’
5’
95ºC 95ºC 72ºC 72ºC
50-65ºC
4ºCx 35 (ciclos)
5’ 30’’
45’’
1’ 4’8
Denaturación ExtensiónAnealing
G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
5’3’
5’T G C G C G G C C C A
3’
G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
5’3’
5’T G C G C G G C C C A
3’
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
Electroforesis
Microsatelites
Secuencias simples repetidas en tandem a nivel del ADN sin función conocida extremadamente variables
También conocidos como SSR (Simple Sequence Repeats)
SSR Mononucleotídica (A)11 ctgttgAAAAAAAAAAAtgagag
SSR Dinucleotídica (GT)6 ccaagtGTGTGTGTGTGTtgaat
SSR Trinucleotídica (CTG)4 cagagtCTGCTGCTGCTGgtaat
SSR Tetranucleotídica (ACTC)4 actgtACTCACTCACTCACTCtgaat
Microsatélites (SSR)
Secuencia de microsatélite (CA)5 Alelo A
Secuencia de microsatelite (CA)3 Alelo B
Dir
ecció
n d
e la
el e
ctr
ofo
resis
Especímen A
Especímen B
Homocigotos:…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)7
…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)7
Heterocigotos:…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)7
…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… (CT)9
TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7
TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7
TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7
TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9
TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9
TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9
TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7
TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7
TTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)7
TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9
TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9
TTCTCTCTCTCTCTCTCTCTAT (CT)9
(CT)7(CT)9
(CT)7
(CT)9
Ventajas• Marcador codominante
• Uso relativamente simple
• En general son “neutros” al efecto de la selección natural
• Alta precisión en la determinación de alelos
• Altamente variables Muchos alelos por locus (polimórficos)
Desventajas• Requieren diseño de partidores especie-específicos (seq masiva)
• Requieren de un secuenciador para el análisis de fragmentos
• Dinámica evolutiva desconocida
• Bandas stutter y alelos nulos complican su análisis
• Exhiben significativos niveles de Homoplasia
Categorías de preguntas
Entre poblaciones: Conectividad, estructura
Individuos: parentesco, endogamia, consanguinidad, analisis forense
Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía
1
2
3
RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA)
Polimorfismo de secuencia en el sitio del partidor
Especímen A Especímen B
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 01 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
Matriz de datos es llevada a al programa TFPGA
. Amplificación al azar de partes del genoma (partidores universales cortos al azar, 8 a 10 pb). Se detecta polimorfismo sólo en donde no amplifica (no hay banda) Cambios en las zonas donde se pegan los partidores. Permite amplificar fragmentos entre 200-2000pb. Permite amplificar varios loci al mismo tiempo. Marcador dominante (presencia/ausencia)
Homocigoto Heterocigoto Homocigoto
X XX
Marcador Dominante
Ventajas• Fácil y barato• Aproximación multilocus• No requiere el diseño de partidores específicos• Permite analizar un gran número de loci a nivel genómico• Su variabilidad es neutra a los efectos de la selección natural
Desventajas
• Baja diversidad alélica (sólo 2 alelos)• No se pueden detectar heterocigotos Dominante• Alto nivel de Homoplasia:
. Dos bandas de igual tamaño pueden tener distintas secuencias
. Ausencia de banda puede ser producto de una o varias mutaciones
• Exhibe graves problemas de reproducibilidad y poco comparables• En muchos casos son imprecisos• Técnicas y analíticas
Categorías de preguntas
Entre poblaciones: Conectividad, estructura
Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía
2
3
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
. Técnica popular que permite detectar una gran cantidad de marcadores de ADN polimórficos rápidamente.
. Involucra una digestión con enzimas de restricción y dos rondas de PCR
. Permite detectar presencia-ausencia de fragmentos de restricción.
ADN
C G T A A C C G C A T T G G
C A A T T C C G T T A A G G
AATTC
G
T
AATTTAA
Adaptador EcoR I
TA
Adaptador Mse I
Ventajas
• Aproximación multilocus• No requiere el diseño de partidores específicos• Permite analizar un gran número de loci a nivel genómico• Su variabilidad es neutra a los efectos de la selección natural
Desventajas
• Baja diversidad alélica (sólo 2 alelos)• Marcador dominante No se pueden detectar heterocigotos• Alto nivel de Homoplasia
- Dos bandas de igual tamaño pueden tener distintas secuencias- Ausencia de banda puede ser producto de una o varias
mutaciones en la zona de corte de la enzima de restricción• Requiere de ADN de alta calidad y pureza
Categorías de preguntas
Entre poblaciones: Conectividad, estructura
Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía
2
3
Marcadores asociados a la secuenciación del ADN
Reacción de secuenciación de Sanger
Es similar a una PCR:
• Utiliza un sólo primer y a la polimerasa para producir secuencias de hebra simple de DNA
• Incluye nucleótidos normales (A, C, G, T) para extensión y dideoxinucleótidos (terminación).
A
A
AA
A A
AG
A
T
CC
C
C
CC
CT
TT
T
TG
G
G
G
G
G
Regular Nucleotides Dideoxy Nucleotides
AA
AA AT
CC
CT
TT
TG
G
G
G
G
1. Marcados2. Terminadores
Sanger Sequencing
5’T G C G C G G C C C A
Primer
A C G C G C C G G G T ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5’3’
Sanger Sequencing
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’
5’T G C G C G G C C C A
Primer
G T C T T G G G C T
Sanger Sequencing
G T C T T G G G C T A G C G CA C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G
5’3’
5’T G C G C G G C C C A
Primer
G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp
Sanger Sequencing
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’
G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A
G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp
26 bp
5’T G C G C G G C C C A
Primer G T C T T G G G C T A
Sanger Sequencing
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’
G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A
G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp
26 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp
5’T G C G C G G C C C A
Primer G
Sanger Sequencing
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’
G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A
G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp
26 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp
5’T G C G C G G C C C A G 12 bp
5’T G C G C G G C C C A
Primer G T C T T G G G C
Sanger Sequencing
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’
G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A
G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp
26 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp
5’T G C G C G G C C C A G 12 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C 20 bp
5’T G C G C G G C C C A
Primer G T C T T
Sanger Sequencing
A C G C G C C G G G T C A G A A C C C G A T C G C G 5’3’
G T C T T G G G C T A G C G C5’T G C G C G G C C C A
G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp
26 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp
5’T G C G C G G C C C A G 12 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C 20 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T 16 bp
A C G C G C C G G G T ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5’3’
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? C5’T G C G C G G C C C A
? ? ? ? ? ? ? ? ? T5’T G C G C G G C C C A 21 bp
26 bp
5’T G C G C G G C C C A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? A 22 bp
5’T G C G C G G C C C A G 12 bp
5’T G C G C G G C C C A ? ? ? ? ? ? ? ? C 20 bp
5’T G C G C G G C C C A ? ? ? ? T 16 bp
Sanger Sequencing
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G 19 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C T A 22 bp
G T C T T G G G C T5’T G C G C G G C C C A 21 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G G C 20 bp
5’T G C G C G G C C C A G 12 bp
5’T G C G C G G C C C A G T 13 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T 16 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C 14 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T 15 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G 17 bp
5’T G C G C G G C C C A G T C T T G G 18 bp
Lase
r R
eader
Sanger Sequencing
GTCTTGGGCTA
Método automático de secuenciación
ResultadoCada reacción de secuenciación nos entrega un cromatograma, ~600-1000 bp:
Variabilidad de la secuencia de ADN
ATTCGCTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG
ATTCGTTATCGAACGCTACGCTGCGAACGGG
ATTCGCTATCGAA- - -TACGCTGCGAACGGG
ATTCGCTATCGAACGCCGCTACGCTGCGAACGGG
ATTCG- - - -CGAACGCTACGCTGCTATCGAACGGG
Sustitución
Deleción
Repetición
Transposición
Además:
• Errores de apareamiento de cromosomas• Ruptura / fusión de cromosomas (o partes)
Mitosis y Meiosis Transmisión bi-parental(mutaciones (fusion de gametos)y recombinación)
Solo Mitosis Transmisión mono-parental(solo mutaciones) (maternal)
Dos grandes diferencias entre ADN nuclear y ADN cytoplasmatico
Tipo de herencia
Tasa de mutación Menor Mayor
Análisis ComplejoTransformación yClonación
Simple
DNA Nuclear (nucDNA) vs DNA Mitocondrial (mtDNA)
nucADN mtADN
Forma Linear Circular
Número de copias 2 por célula Miles por célula
Tamaño Variable (6x109) 16,5Kbp
Tipo de herencia Biparental‘H’ de machos y hembras. Ventaja en estudios (filopatria)
Uniparental‘H’ linajes maternos
Número de alelos Diploide *Más de un locus
1 haplotipoVentaja en coalescencia
Recombinación SiVarios locus
No1 Locus
Estabilidad Baja Alta
Categorías de preguntas
Entre especies: filogeografía/filogenia
Entre poblaciones: Conectividad, estructura, filogeografía
Dentro de poblaciones: Tamaño poblacional, demografía
AABB
C
DC
D
2
3
4
Usos potenciales de los distintos tipos de marcadores en ecología, filogeografía y filogenia
Nivel Jerárquico
Identidad genética
Parentesco
Poblaciones coespecíficas
Especies relacionadas
Niveles taxonómicos intermedios
Separaciones profundas
Electroforesis Secuencia Secuenciación DNA fingerprintde proteinas DNA/RNA mtDNA, scnDNA, intrones, RAPD, AFLP
Adecuado, altamente informativo
Marginalmente informativo
No apropiadoTomado de Sunnucks, 2000 TREE
Desarrollo de nuevas técnicas en Biología Molecular
• Avances en Bioinformática y de los tiempos requeridos para el análisis de una enorme cantidad de datos
Se asocia a la identificación-caracterización de genes transcritos y traducidos que responden a presiones de selección.
Han aumentado la capacidad de comprensión de los mecanismos de adaptación y especiación.
Aproximaciones “OMICAS”
NGS “Next generation sequencing”
Genómica: estudio de la función de los genomas.
Transcriptómica: estudia el conjunto de moléculas de ARNs (mARN, rARN, tARN y ARN no codificante), en una célula o un conjunto celular. Permite obtener un perfil de la expresión génica global bajo condiciones específicas.
Proteómica: se encarga de caracterizar el conjunto de proteínas, en especial sus estructuras y funciones.
Metabolómica: estudio sistemático de las huellas químicas o metabolitos que dejan los procesos celulares específicos.
Ventajas
• Permite la búsqueda y obtención de partidores para:- Microsatélites- Genes
• Aumentan la cantidad de loci para trabajar
• Permite ampliar las preguntas y grupos a estudiar
Desventajas• Precio
• Bioinformatica avanzada
• Capacidad de análisis numérico
Comparación de métodos de secuenciación NGS
Video!
Dos técnicas interesantes
• RAD sequencing
• RNA seq Transcriptoma
RAD sequencing
SNPs = Single Nucleotide Polimorphism
• Un SNP es un cambio en una base dentro de una secuencia
• Se estima 1 SNP por 1000 bases en un genoma
• Puede o no alterar la estructura de la proteina (posición codón)
• Base de datos SNP para humanos (http://www-genome.wi.mit.edu/snp/human/)
RNA seq
RNA seq
Dos aspectos pueden ser estudiados
• Variaciones en genes expresados
• Expresión diferencial entre individuos