Manuale Pratico PCR Guida Per Risolvere i Problemi Più Comuni

7/24/2019 Manuale Pratico PCR Guida Per Risolvere i Problemi Più Comuni

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Maurizio Autunno & Giuseppe Bonapace

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MANUALE PCRGuida pratica per risolvere i problemi piùcomuni.





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Questo manuale è stato pensato e redatto in costante

collaborazione con il dr. Giuseppe Bonapace .

Senza il suo aiuto fraterno, non avrebbe mai potuto vedere

la luce.





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Maurizio Autunno e Giuseppe Bonapace





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SOMMARIO

Introduzione……………………………………………………………………………………7

Quali sono i componenti di una reazione di PCR ?...............................10

Alcuni consigli utili per cominciare……………………………………………..13

Cinque consigli per un uon risultato………………………………………...1!

"a prima PCR……………………………………………………………………………..1#

Il controllo dell$ampli%icato……………………………………………………….&1

Prolemi tecnici e loro risoluzione…………………………………………..&!





MANUALE PRATICO PCR

Introduzione'

Il primo problema da risolvere, per chi opera nel campo della biologia

molecolare, è quello relativo alla necessità di estrapolare da un contesto

genomico complesso il singolo gene di interesse o una sua parte specifica. I

genomi sono entità estremamente grandi. Per avere un’ idea di tale complessità

basti ricordare che un semplice batterio contiene 3 milioni di coppie di basi che

gli conferiscono la capacità di codificare 3000 proteine differenti e che tale

complessità aumenta enormemente spostandoci lungo la scala evolutiva fino ad

arrivare ai mammiferi e all’uomo con oltre 3 miliardi di coppie di basi (Fig1). Per

affrontare e risolvere tale problema, sulla base delle conoscenze attuali sulla

struttura dei principali genomi vegetali e animali e per disporre di quantità di

materiale sufficientemente elevate per studi di diagnostica e/o caratterizzazione

genetica è stata messa a punto la tecnica della Polymerase Chain Reaction

(PCR) o amplificazione a catena mediata da polimerasi.





Fig 1




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Che cos’è la PCR ?

La PCR è una reazione di polimerizzazione mediante la quale una specifica

sequenza di acido nucleico può essere amplificata esponenzialmente in vitro. Lo

stesso tipo di reazione può anche essere utilizzato per modificare il contenuto

informativo di una specifica sequenza o per aggiungere dello specifico

contenuto di informazione. Il requisito fondamentale per il successo della PCR

in termini di specificità del prodotto ottenuto è che siano conosciute le sequenze

esterne che fiancheggiano la zona di interesse allo scopo di disegnare i primers

di innesco della reazione. Questo è oggi possibile grazie all’esistenza di banche

genomiche estremamente accurate nelle quali sono riportate e costantemente

aggiornate le sequenze complete di interi genomi ed alle quali si può accedere

in rete allo scopo di acquisire le conoscenze necessarie per il disegno dei

primers di innesco.




www.maurizioautunno.com Pagina 1!

Quali sono i componenti i una !ea"ione i PCR?

Dna Genomico, plasmidico, fagico (100-200 ng)

Primers di innesco (02-05 µM)

dNTP (150-250 µM)

Tampone di reazione (50mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl2 )

Dna polimerasi (Taq, Pfu, 5U/100 µl reazione)

Additivi (DMSO, glicerolo, Formamide BSA)





Come #un"iona la !ea"ione i PCR?

Fondamentalmente si tratta di una reazione in tre fasi che vengono ripetute

ciclicamente, dove un ruolo fondamentale è giocato dalla temperatura di

reazione e dal tempo di esposizione. In ogni ciclo la prima fase è detta di

denaturazione,lo scopo è quello di ottenere la completa separazione dei due

filamenti che rappresentano il target per i primers di innesco. Tale scopo viene

ottenuto mediante una esposizione della miscela di reazione ad un passaggio di

denaturazione iniziale la cui durata va da 5 a 10 minuti. La seconda fase, che è

per alcuni versi quella più delicata, è quella detta di annealing nella quale

mediante un repentino abbassamento della temperatura fino a valori che

dipendono dal templato e dai primers si facilita l’interazione tra le zone

bersaglio e gli inneschi. La terza fase è quella di attivazione della polimerasi

mediante esposizione della miscela di reazione alla temperatura di 68 o 72°C

che è quella ottimale per l’azione della DNA polimerasi che utilizza i gruppi OH

liberi sui due primers come punto di partenza per ricopiare i filamenti su cui si

sono posizionati. Come si può osservare (Fig 2) alla fine del primo ciclo avremo

filamenti figli che superano il limite della zona di interesse. A partire dal secondo

ciclo ognuno dei filamenti nuovi ottenuti nel primo ciclo funge da stampo, ed





avendo una estremità definita dal primer del primo ciclo a seguito

dell’interazione con l’altro primer, produce il primo prodotto specifico limitato alla

zona di interesse. Dal terzo ciclo in poi si assiste alla crescita esponenziale dei

prodotti specifici che alla fine della reazione ( dopo un numero standard di 30,35

cicli) saranno il prodotto prevalente.

Fig2





Alcuni consi$li utili pe! comincia!e

(%atiamo prima di tutto alcune leggende metropolitane.

A) La maggior parte dei manuali ufficiali di biologia molecolare raccomanda

caldamente di lavorare in ambienti separati e dedicati rispettivamente

all’estrazione del DNA, all’esecuzione della reazione e al controllo del

prodotto finale allo scopo di evitare fastidiose contaminazioni da DNA

estraneo proveniente da precedenti manipolazioni. In definitiva questo

verrebbe a significare che solo chi dispone di spazi sufficienti potrebbe

eseguire una PCR in ragionevoli condizioni di sicurezza. In realtà il





problema delle contaminazioni può facilmente essere tenuto sotto controllo

con qualche piccolo accorgimento:

• Usare un set di pipette dedicato e non destinato ad altri usi

• Usare puntali sterili non necessariamente autoclavati. In alternativa vanno

bene anche puntali non sterili e mantenuti sotto UV per almeno 24 ore

• Procedere ad un’accurata pulizia delle pipette e del posto di lavoro con

NAOH 0,5M prima di eseguire la reazione

B) Occorre utilizzare tubi di reazione sterili o autoclavati :

Ricordiamo che i tubi per PCR in commercio sono gia’ sterili (PCR Clean)

e che se correttamente manipolati e conservati non necessitano di

trattamenti aggiuntivi

C) Occorre utilizzare solo acqua sterile BM grade:

Comuni fialette di acqua bidistillata sterile per iniezione vanno altrettanto

bene e sono meno costose.





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