Manualbiok

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA I.P.N.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FORMACIÓN BÁSICA DISCIPLINARIA

ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I

MANUAL DE LABORATORIOSEMESTRE ENERO – JUNIO 2011

ALUMNO: Grupo: 2CM

PROFESORESTITULAR:LABORATORIO:LABORATORIO:LABORATORIO:

PRÁCTICA AUTORIZACIÓN

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Laboratorio de Bioquímica Médica 1 1


INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FORMACIÓNBÁSICA DISCIPLINARIA

ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I

TITULARES DE GRUPOJUAN GUILLERMO ORDORICA VARGAS

FRANCISCO JAVIER CASTAÑEDA IBARRAMIGUEL ANGEL ORDORICA VARGAS

FELICIANO TAMAY CACHJOSÉ GUADALUPE TRUJILLO FERRARA

ALFREDO MONTIEL MÁRQUEZMARTHA CECILIA ROSALES HERNÁNDEZ

ARTURO DÍAZ MARTÍNEZMARÍA DE LA LUZ VELÁZQUEZ MONROYSANDRA GISSELA MÁRQUEZ RAMÍREZREYNA ELIZABETH BARBOSA CABRERA

JESSICA ELENA MENDIETA WEJEBEIO STEPHANIE ZAMUDIO VEGA

LETICIA ARACELI RAMÍREZ DURÁNEUNICE DALET FARFÁN GARCÍALUZ MARÍA CHIRINO CASTILLO

MARÍA DEL ROSARIO LEÓN REYESLABORATORIO

CLAUDIA CAMELIA CALZADA MENDOZA ERÉNDIRA YADIRA CARRERA GARCÍA

SANDRA CASELÍN CASTROCRISTINA LOPEZ GLORIA

ARGENTINA HERNANDEZ RAMOSMARIA TERESA LÓPEZ VENEGAS

ARTURO RAMIREZ CRUZ ANAYETZIN TORRES RIVERA

Auxiliares de Laboratorio:José Luis Martínez Vásquez

Alex Hernández AguilarJulio César Aguilar Rentería

Manual Versión Enero de 2011Editado por:

Dra. Luz María Chirino Castilloy Dr. Arturo Díaz Martínez



ÍNDICE

No. TEMA Página:

1 INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO 4 2 SOLUCIONES 9 3 ELECTROLITOS Y pH 16 4 SOLUCIONES REGULADORAS 19 5 PROTEÍNAS 24 6 CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS 32 7 CINÉTICA ENZIMÁTICA 40 8 GLÚCIDOS 46 9 OXIDACIONES BIOLÓGICAS 5210 LÍPIDOS 5811 ÁCIDOS NUCLEICOS 62



1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIODE BIOQUÍMICA MÉDICA I

e revisan conceptos y procedimientos de importancia para el trabajo en el laboratorio. El alumno deberá previamente haber leído, entendido, comprendido, estar de acuerdo con, y sujetarse al Reglamento de la

Academia de Bioquímica.S

• Las actividades de laboratorio constituyen una parte importante del aprendizaje de la bioquímica médica y complementan las actividades de la materia impartidas en el aula.

• Es obligación del alumno la asistencia puntual, así como la participación activa, la recolección de resultados de los experimentos y la entrega de reportes de los mismos.

• Es de la mayor importancia cumplir meticulosamente con las medidas de seguridad tanto en comportamiento, uniforme y accesorios como guantes, anteojos de protección o caretas transparentes, cubre bocas, bata larga, y otros como pre pipetas.

DISTRIBUCIÓN DE LOS ALUMNOSEJERCICIO 1Antes de entrar al laboratorio, todos los alumnos deberán portar, debidamente abotonada, su bata de laboratorio y tener listo su material de trabajo.

a)Cuando el profesor lo indique, los alumnos colocarán su mochila en el lugar que les sea asignado.

b)Siguiendo las instrucciones de su profesor, localice su mesa de trabajo e inmediatamente diríjase a ella.

c)En su mesa, localice las tomas de corriente, desagües, tuberías y sitios donde puede trabajar.

d)Ubique la posición de su mesa de trabajo con respecto de la mesa de la campana, instalaciones de seguridad, extintores, zonas de seguridad y rutas de evacuación.

e)Con base en la explicación recibida, identifique el uso de cada una de las tuberías que encuentre en su mesa de trabajo y márquelas con masking tape. Espere a que su profesor confirme que su etiquetado es correcto.

f)Localice la posición de las válvulas de seguridad de cada tubería.

1.Dibuje un esquema de su mesa señalando la posición de las tomas de corriente, desagües y válvulas de flujo.

2.Dibuje un esquema simple del laboratorio e indique en él las zonas de seguridad, la posición del equipo de seguridad y marque la ruta de evacuación desde su mesa.

3.En el esquema de la mesa de trabajo que elaboró en el ejercicio anterior, marque la posición de las válvulas de seguridad.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 4


EL VALE DE MATERIAL DE LABORATORIOEJERCICIO 2

a)Localice en la charola de material de laboratorio el vale, el cual es un documento que enlista el material que se le confía para la realización de cada práctica. De acuerdo con esta lista identifique y revise cuidadosamente cada una de las piezas, indicando en el vale cualquier defecto que encuentre.

b)Rotule cada pieza identificada con una etiqueta de masking tape. Reúna en la charola el material de nombre y/o empleo desconocidos, o de cuyo estado tenga duda, y pregunte a su profesor. Espere a que su profesor compruebe que su identificación del material es correcta.

c)Una vez revisado todo el material, complete los datos solicitados en el vale, (fecha, grupo, equipo, responsable, etc.) y entréguelo al personal técnico de laboratorio.

1.¿Cuál es el uso de cada una de las siguientes piezas de material de laboratorio?

Pipeta MorteroBureta Tubo de ensayoProbeta

MANEJO DEL MECHERO FISHEREJERCICIO 3

a)No encienda el mechero hasta que su profesor se lo indique.b)Si es necesario, conecte el tubo de plástico del mechero a la llave de gas, la

que deberá estar completamente cerrada, con la manija en posición transversal respecto de la salida del gas. Recuerde que la tubería de gas es de color amarillo.

c)Asegúrese que el tornillo de control de flujo de gas esté abierto más o menos a la mitad de su capacidad total. El flujo de gas se disminuye girando el tornillo en el sentido de las manecillas del reloj y se aumenta en sentido contrario.

d)Encienda el mechero aproximando la flama de un cerillo o encendedor al borde de la parte superior del mechero inmediatamente después de abrir la llave de gas, lo cual debe hacerse lentamente, avanzándola hasta que esté aproximadamente a 45 grados con el tubo del gas. Tenga cuidado de no acercar su rostro, pelo u objetos inflamables al mechero al momento de encenderlo ni cuando esté encendido. Al usar el mechero no deberá portar guantes clínicos hechos de látex o polietileno, tenga cuidado, ya que son inflamables.

e)Ajuste la cantidad de aire que entra, usando el arillo de control de flujo de aire, hasta que la flama tenga una zona central de color azul claro rodeada de otra de color azul oscuro o violeta. La parte más caliente se encuentra en la punta de la zona interna. Cuando la combustión es incompleta, por falta de oxigeno, la flama tiene color amarillo.

f)Deje el mechero encendido para usarlo en el ejercicio siguiente.



1) Elabore un esquema del mechero de FISHER, en el que se indique la posición del tornillo de control de flujo de gas, el arillo de control de flujo del aire y la entrada del gas.

COMO CALENTAR UN LÍQUIDO EN UN TUBO DE ENSAYO

EJERCICIO 4

a)Todos los miembros del equipo deben usar los anteojos de protección.

b)Llene el tubo de ensayo hasta un 20% de su capacidad con agua de la llave y sujételo con las pinzas para tubo de ensayo.

c)En caso necesario quitarse los guantes de látex antes de iniciar el calentamiento

d)Coloque el tubo sobre la flama del mechero, inclinado aproximadamente a 70 grados y cuidando que la flama caliente la parte superior del líquido. Nunca caliente un tubo de ensayo en el fondo o en posición vertical porque se puede proyectar su contenido.

e)Mueva el tubo cuidadosamente, sin sacarlo de la flama, para que el líquido se caliente de manera uniforme

f)Durante el calentamiento dirija la boca del tubo hacia un lugar en que no se encuentre ninguna persona o material que se pueda dañar.

g)Jamás mire directamente la boca de un tubo de ensayo que se está calentando, aunque esté fuera de la flama del mechero.

h)Continúe el calentamiento hasta lograr que el agua hierva, sin proyectarse.i)Nunca caliente solventes orgánicos en tubo de ensayo directamente

en la flama del mechero. Hágalo siempre en baño maría.

1.Elabore un esquema de la forma correcta de calentar un líquido en un tubo de ensayo.

MANEJO DE REACTIVOS LÍQUIDOSEJERCICIO 5a

a)Para manejar con seguridad los reactivos líquidos se usa siempre la pre pipeta.

b)Después de abrir un frasco de reactivo, coloque el tapón sobre la mesa en posición invertida, para evitar contaminación.

c)Para extraer el líquido utilice una pipeta o un gotero limpios. Nunca vierta reactivos directamente del frasco para evitar escurrimiento.

d)Usando la pipeta de 10 mL, transfiera 5 mL de agua de un vaso de precipitados a un tubo de ensayo. Repita la maniobra hasta que pueda realizarla con seguridad.

1)Describa la forma como ensambló su pre pipeta.EJERCICIO 5b



a)Prepare una serie de 4 tubos de ensayo. Numere los tubos del 1 al 4. Coloque en el tubo número uno 2.5 mL de agua. En el tubo número dos, 1.25 mL de agua. En tanto que en el tubo número tres deposite 0.8 mL de agua y en el tubo número cuatro, deposite 0.6 mL de agua.

b)Utilice para cada tubo de ensayo una pipeta de capacidad adecuada. Repita este ejercicio hasta que pueda realizarlo con seguridad y precisión.

1.Elabore un esquema que describa este experimento.

EJERCICIO 5ca)Monte el dispositivo de titulación según indicaciones de su profesor y

aprenda a manejar con soltura y seguridad la llave de su bureta. Familiarícese con el procedimiento de dejar gotear el líquido de la bureta, en este caso agua, o dejar salir de la misma cantidades fijas como por ejemplo, de un mL cada vez, de 5 mL cada vez, etc. Asimismo, deberá aprender a leer con precisión la escala de la bureta.

1.Elabore un esquema del dispositivo de titulación.

MANEJO DE REACTIVOS SÓLIDOS

EJERCICIO 6a)Prepare una charola de papel usando una hoja de papel limpio, de preferencia

encerado. Esta charola se prepara doblando el papel aproximadamente a un centímetro de cada borde y colocándolos en ángulo recto para formar una pared en la periferia del papel. El tamaño de la charola depende de la cantidad de reactivo a pesar.

b)Encienda la balanza y espere a que se estabilice la lectura. Coloque la charola de papel en el plato de la balanza. Cuando se estabilice, por medio del botón de tarar, tare a cero la balanza.

c)Abra el recipiente del reactivo y coloque la tapa sobre la mesa, boca arriba, para evitar la contaminación.

d)Por medio de espátula saque el reactivo del recipiente y colóquelo sobre la charola de papel. Si se rebasa la cantidad deseada, regrese el exceso de reactivo al respectivo recipiente usando la espátula. Nunca regrese al recipiente original un reactivo que caiga fuera de la charola de papel o sobre la mesa.

e)Pese la cantidad de cloruro de sodio que le indique su profesor y colóquela en el sobre de papel que se le proporciona. Escriba en el sobre el nombre y la cantidad de reactivo que contiene.

f)Cierre inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate o contamine. Asegúrese de que la mesa y la balanza queden limpias.

1) Elabore un diagrama de la balanza, señalando la posición del botón de encendido y apagado y del botón de tara.

TARAR TUBOS PARA CENTRIFUGAREJERCICIO 7

a)En este ejercicio se usará la balanza de dos platillos.



b)Coloque las pesas de medición en la posición de cero. Asegúrese de que la aguja o fiel de la balanza esté en posición cero. Si no lo está, gire cuidadosamente las pesas de ajuste en el sentido que sea necesario hasta lograr el equilibrio.

c)Coloque un frasco gerber en cada platillo, cuidando que el más pesado quede del lado izquierdo.

d)Deslice las pesas de medición de la balanza hasta lograr que el fiel vuelva a la posición de equilibrio.

e)Coloque en cada frasco una camisa de la centrífuga con un tubo adecuado para centrifugar dentro.

f)Usando una pipeta, añada agua de la llave entre la camisa y el tubo más ligero hasta lograr que el fiel de la balanza regrese al equilibrio.

1) Elabore un esquema de la balanza de platillo señalando la posición de las pesas de ajuste y las de medición.



2. SOLUCIONESna solución es un sistema homogéneo monofásico, formado por dos o más sustancias químicas y presenta las mismas propiedades fisicoquímicas en todas sus partes. Está formada por un solvente (líquido) en el cual se dispersan

molecularmente uno mas solutos (sólidos). Cuando ambos son líquidos miscibles, se acostumbra nombrar solvente al que se encuentra en mayor cantidad.

ULa relación que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una solución

se llama concentración. Para explicar concentración necesitamos la definición de mol.

Un mol se define como el peso molecular en gramos de una sustancia, o sea la masa de una sustancia que contiene el mismo número de átomos o moléculas que hay en 12 g de 12C. (6.022 x 1023 o Número de Avogadro). La masa molecular o peso molecular (PM) de una sustancia es la suma de los pesos atómicos de sus componentes; por ejemplo: PM del ácido sulfúrico (H2SO4): 98 g/mol.

Con un mol podemos preparar una solución 1 molar (1M) la cual contiene un mol de soluto en un litro de solución.Si dividimos los gramos de un mol entre la valencia del compuesto, y diluimos hasta aforar a un litro tendremos una solución 1 normal (1N).

Existen varias formas de expresar la concentración de una solución. Las de uso más frecuente son:

• MOLARIDAD (M). Número de moles de soluto en un litro de solución. Un mol es el peso molecular expresado en gramos.

• MOLALIDAD (m). Número de moles de soluto en 1000 g de solvente.• NORMALIDAD (N). Número de equivalentes químicos de soluto en un litro

de solución.• FRACCIÓN MOLAR (Xi). Número de moles de una sustancia en una solución

entre la suma de los moles de todos los componentes de la misma.

PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solución. Existen diferentes tipos:

• Porciento en peso (% p/p). Número de gramos de soluto en 100g de solución.

• Porciento en volumen (% v/v). Número de mililitros de soluto en 100 mL de solución.

• Porciento en peso-volumen (% p/v). Número de gramos de soluto en 100 mL de solución.

PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONESSe pueden dividir en tres categorías: Constitutivas, Aditivas y Coligativas.

Constitutivas:• Dependen de la constitución química de sus moléculas, como la presencia de grupos

funcionales, tipo y disposición de los átomos, etc.• Son propiedades constitutivas el carácter ácido, básico, oxidante, reductor, radioactivo,

dulce, insípido, colorido, etc.



Aditivas:• Dependen de la suma de las propiedades correspondientes a los constituyentes de la

solución.• como la concentración, densidad, viscosidad.

Coligativas:• Dependen del número de partículas por unidad de volumen.• Son muy importantes para los procesos biológicos e incluyen:

a) Elevación del punto de ebulliciónb) descenso de la presión de vapor y/o del punto de congelaciónc) presión osmóticad) así como las constantes crioscópica, y ebulloscópica, etc.

DIFUSIÓN, ÓSMOSIS, DIÁLISIS.

Difusión es el proceso físico químico por el cual las moléculas, ya sea en estado de gas o líquido, tienden a distribuirse uniformemente por todo el espacio de que disponen formando un medio homogéneo.

En el caso de los gases, la difusión está sujeta a la “Ley General de la Energía”, la cual establece que la velocidad con que se mueve una partícula es inversamente proporcional a la raíz cuadrada de su masa.

Las propiedades dinámicas de las soluciones son:• Difusión Simple• y Difusión a través de membranas (Ósmosis y Diálisis).

En los líquidos la velocidad de difusión es afectada por varios factores. Entre ellos tenemos:

a)Naturaleza de la sustancia que difunde b) Área de difusión

c)Tamaño y concentración de las partículas d) Temperatura

Graham hizo notar estos factores que influyen sobre la difusión y Fick, de acuerdo con los mismos estableció la siguiente relación:

dm dcv = ---- = KQ ---- dt ds

v = velocidad de difusión K = Constante de Difusión dm = cantidad de sustancia que difunde dt = tiempo que tarda en efectuarse la difusión dc = concentración de la sustancia que difunde ds = espacio que recorre la sustancia al difundir.

Así, la velocidad de difusión es directamente proporcional al gradiente de concentración y al área de sección. A temperatura, gradiente de concentración y área constantes, cada sustancia tiene una velocidad de difusión característica con



relación al peso molecular por lo que se incluye una constante K llamada constante de difusión.

DIFUSIÓN SIMPLE (En líquidos)EXPERIMENTO 1

Llene casi completamente una probeta de 100 mL con agua de la llave y luego espolvoree, con un aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno sobre la superficie del agua y observe que ocurre. Anote sus observaciones.

A continuación caliente ligeramente la probeta en cualquier punto y nuevamente observe que ocurre al agregar calor. Anote sus observaciones. Una vez homogeneizado el colorante, la difusión se ha efectuado.

1)¿Es uniforme el descenso del colorante por la columna de agua? 2)¿Qué sucede si se calienta ligeramente un punto de la probeta?3)¿Qué es disolución, convección y difusión?

DIFUSIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANAS

Cuando se interpone en el sistema una membrana dialítica, permeable al agua y a solutos cristaloides pero no a coloides, la sustancia sigue difundiendo como si la membrana no existiera dependiendo de los factores ya señalados, pero la naturaleza de la membrana será un factor adicional. En estos casos, K recibe el nombre de constante de permeabilidad. Esta difusión es inversamente proporcional a su peso molecular.

ÓSMOSIS Y PRESIÓN OSMÓTICA

Si dos soluciones de diferente concentración están separadas por una membrana semipermeable, el solvente de la solución menos concentrada difunde a la de mayor concentración. Esto se explica termodinámicamente porque la solución diluida tiene una tendencia de escape o presión de vapor muy grande. Esta tendencia de escape o presión de vapor es muy baja cuando la solución está concentrada. Este fenómeno es conocido como ósmosis y ejerce una presión osmótica, propiedad coligativa de gran importancia fisiológica ya que interviene en la regulación del volumen de sangre circulante, así como en la formación o eliminación de edemas tisulares, y es la razón por la cual el paciente diabético elimina frecuentemente grandes cantidades de orina (poliuria). Esta última está ocasionada por la alta concentración de glucosa en sangre y forma parte de la triada sintomática clásica del diabético: Polifagia, Polidipsia y Poliuria.

MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICAMÉTODO DIRECTO

EXPERIMENTO 2Esta medición se lleva a cabo mediante el dispositivo llamado OSMÓMETRO. Este requiere de una membrana semipermeable y aunque las que más se acercan a la perfección son las de ferrocianuro de cobre y las de pergamino, por ser más fácil de conseguir, se utilizará una membrana dialítica de colodión (celulosa) que nos dará una medida aproximada de la presión osmótica.



El osmómetro consiste en un compartimiento que contiene una solución de sacarosa 1M teñida con rojo neutro y el cual es el cuerpo de una jeringa hipodérmica de 5 mL de capacidad y la cual presenta una banda de hule inferior que permite la fijación de una membrana de celofán, humedecida previamente durante 5 a 10 minutos. Mientras que la banda superior sirve para sellar el orificio de llenado de la cámara. Por la parte correspondiente al pivote, se le agrega el trocar metálico de un catéter el cual se introduce en el extremo de un capilar de polietileno. El extremo de esta cámara se sumerge en un vaso de precipitados con agua.

• Una vez hecho esto se marca el nivel de la sacarosa en el tubo capilar,• leyendo cada 15 minutos el nivel ascendido hasta que se detenga el proceso.• Anote sus resultados en la tabla.

Nota: cualquier error en el montaje del osmómetro se manifestará por salida de solución coloreada del dispositivo.

Tiempo min.

Altura mm

15

30

45

60

75

90

105

120

1)Grafique tiempo en las abscisas (eje x) y altura en milímetros en las ordenadas (eje y).

CÁLCULO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA



La columna de sacarosa ejercerá finalmente una presión que se opone al paso del agua (Presión Hidrostática). Calculando ésta, se puede conocer la presión osmótica ya que ambas son iguales.

Esto se hace mediante la fórmula: π = hρgπ = presión osmóticah = altura a la que asciende la solución de sacarosa (en metros)ρ = densidad de la solución de sacarosa (1.088 g/mL), (convertirla a kg/m3)g = aceleración debida a la gravedad (9.81 m/s2)

Efectuando esta operación encontramos la presión osmótica en Pascales. Para obtener atmósferas usamos la siguiente equivalencia:

1Pa1Atm = ---------------

1.013 x 105

1)¿Cuándo deberá detenerse el proceso osmótico?2)¿Depende sólo de la altura la presión osmótica? Explique.3)¿Influye el radio del capilar en la presión osmótica? Explique.4)¿La sacarosa y el colorante dializan?

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PORCENTUALES

Experimento 3 Utilice la cantidad de NaCl que se proporciona en un sobre con el material,

(rotulado en miligramos), prepare una cantidad determinada de solución de NaCl al 2% considerando que la pureza del reactivo es de 100%.

1)Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer la cantidad de agua destilada que es necesario añadir al NaCl del sobre para que la solución sea al 2%.

2)Conserve esta solución ya que se utiliza en el experimento 4

Considerando que la solución de NaCl es al 2% calcule las concentraciones siguientes:

Molaridad

Normalidad

MEq/ml

mg/ml

moles %

Osmolaridad

DIÁLISIS

Ejemplo de membranas dialíticas son el celofán y el colodión. Se deberá poner particular atención al hecho de que este experimento es la base del tratamiento de pacientes renales descompensados por medio de diálisis, la cual es útil también para



eliminar sustancias nitrogenadas, medicamentos en exceso o exceso de acidez en sangre. Médicamente se refieren diversos tipos de diálisis de los cuales mencionaremos la Hemodiálisis y la Diálisis peritoneal.

EXPERIMENTO 4Como antecedente de este experimento prepare dos tubos de ensayo,

• coloque en uno de ellos 2 mL de NaCl al 2% y 5 gotas de AgNO3 (nitrato de plata).

• Al otro tubo agréguele 2 mL de solución de almidón al 1% y 2 gotas de solución de Lugol.

• Observe la reacción que ocurre en cada tubo.• Rotúlelos como testigo de cloruros y testigo de almidón respectivamente.

Humedezca por inmersión en agua destilada durante 10 minutos la sección del tubo de colodión o celofán de aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm de diámetro y cierre un extremo atándolo con hilo de algodón.

• Llénelo con una mezcla de 1 mL de solución de NaCl al 2% preparado en el experimento 3 y 10 mL de solución de almidón al 1%.

• Ate cuidadosamente el otro extremo del saco y suspéndalo en un vaso de precipitados con agua destilada.

• Se determinará la presencia de almidón y de cloruros en el líquido del vaso de precipitados que rodea al saco, a tiempo cero, a la hora y a las dos horas.Pasado este tiempo repita las dos pruebas en el líquido contenido en el

saco.1)¿Ha dializado el almidón a través de la membrana?2)¿Dializó el cloruro de sodio?3)Explique este fenómeno.

PREPARACION DE SOLUCIONES

EXPERIMENTO 5Prepare 100 mL de solución 0.5M de ácido acético (CH3-COOH) tomando como

base los siguientes datos: El ácido acético tiene un peso molecular de 60, la pureza del reactivo es de 99.7% y la densidad a 20°C es de 1.06 g/mL.

Una vez preparada consérvela para utilizarla en el experimento siguiente.

1)Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer el volumen de ácido acético concentrado que utilizó para preparar los 100 mL de dicha solución.

R = _________ mL de CH3-COOH.2)Considerando que la solución es 0.5M calcule las concentraciones siguientes:

% (p/v) =

Normalidad =

mmoles/L =



gramos/L =

mEq % =

Os molaridad =

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN POR TITULACIÓN

EXPERIMENTO 6En este experimento se utilizará la solución de ácido acético (CH3-COOH)

(solución problema) que se preparó en el experimento 5.

• En un matraz Erlenmeyer de 250 mL coloque 10 mL de la solución de ácido acético problema, midiéndolos con la mayor exactitud posible.

• Añada 2 gotas de fenolftaleína y titule utilizando solución de NaOH 0.2N. Recuerde que el punto de titulación se observará cuando persista por más de un minuto un ligero color rosa.

1)¿Cuántos mL de NaOH 0.2N gastó para neutralizar los 10 mL de la solución de ácido acético? R = _________ mL

2)De acuerdo con los resultados que obtuvo y considerando que la solución de NaOH es exactamente 0.2N. ¿Cuál es la verdadera normalidad del ácido acético problema?

3)Escriba el concepto de titulación ácido-base.



3. ELECTRÓLITOS y pH

uando una corriente eléctrica circula por una solución acuosa de cloruro de sodio (NaCl), hay una transferencia de materia, la cual consiste en partículas con carga llamadas iones. Los iones que se mueven hacia el ánodo (polo

positivo) son los aniones, los que migran hacia el cátodo (polo negativo) son los cationes y hay liberación de hidrógeno y cloro, evidencia de la descomposición del agua, proceso al cual se le llama electrólisis.

CLas sustancias que permiten el paso de la corriente se conocen como

electrólitos y a los que no manifiestan esta propiedad como no electrólitos. A esta capacidad de dar paso a la electricidad se le conoce como conductancia.

Los electrólitos de clasifican en fuertes y débiles según su potencia para conducir la corriente eléctrica.

• Los electrólitos fuertes son los muy disociables como las sales minerales, los hidróxidos de metales alcalinos, y los ácidos minerales. En los líquidos del organismo encontramos como ejemplo de electrolitos fuertes al cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl) y cloruro de calcio (CaCl2), entre otros.

• Son electrólitos débiles la mayor parte de los compuestos orgánicos (como los ácidos láctico, pirúvico, etc.), y los compuestos nitrogenados.En el agua corporal hay muchos ejemplos de compuestos no electrólitos como

glucosa, urea y creatinina.CONDUCTIVIDAD

La conductividad de las soluciones electrolíticas depende exclusivamente de las moléculas disociadas, y por lo tanto depende del grado de disociación y de la concentración de los electrólitos presentes. Entre mayor sea la concentración, mayor será la conductividad, hasta un límite determinado en el cual se hace constante y luego disminuye, explicándose esto porque cuando la concentración de cationes y aniones es grande, interfieren entre sí y en tal caso los cationes tienen una menor libertad para desplazarse debido a la interacción con los aniones cercanos en la solución y viceversa.

Esta explicación se puede aprovechar para explicar la fuerza iónica de una solución, ya que al no desplazarse libremente las moléculas en la solución, la “concentración activa” o “actividad” de las soluciones es menor que la concentración real, por lo tanto:

∑Cz2

I = --------- 2

La fuerza iónica (I) es la semisuma del producto de la concentración

(C) del ión por la valencia (z)al cuadrado.Se sabe que las fuerzas de atracción entre iones de carga con signos contrarios

disminuye rápidamente al crecer las distancias. En las soluciones concentradas, en Laboratorio de Bioquímica Médica 1 16


las que los iones se encuentran más cercanos, se hacen mayores y por lo tanto la actividad se hace menor, en las soluciones muy diluidas la actividad y la concentración efectiva son equivalentes entre sí.

ELECTRÓLISIS DEL AGUAEXPERIMENTO 1

Coloque un cristalizador sobre un fondo blanco y agregue 50 mL de solución de NaCl al 10%.

• Introduzca en la solución electrodos de carbón conectados a una fuente de energía como el puente de Wheatstone o una pila.

• Observe la formación de gas, agregue entre los electrodos 5 gotas de azul de bromofenol como indicador

• y observe los cambios de coloración en la solución cercana a los electrodos.• Intente captar el olor en cada electrodo y descríbalo.

a)Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos. b)Esquematice el proceso de la electrólisis del agua.

CONDUCCIÓN DE CORRIENTE EN ELECTRÓLITOS FUERTES Y DÉBILESEXPERIMENTO 2

• Coloque la solución de ácido clorhídrico (HCl) 0.5M en un vaso de precipitados en cantidad suficiente para que tenga contacto con los electrodos en una tercera parte de su longitud.

• Introduzca los electrodos conectados a una fuente de energía y observe el paso de la corriente eléctrica manifestado por la intensidad de la luz emitida por el foco.

• Observe también la intensidad luminosa con relación a la distancia entre los electrodos, sin ponerlos en contacto.

Repita el experimento usando ácido acético (CH3COOH) 0.5M.• Anote sus resultados.

SoluciónIntensidad luminosa

Variación con la distancia

HCl 0.5M

CH3COOH 0.5M

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE pH CONOCIDOCON ELECTRÓLITOS FUERTES Y DÉBILES

Los ácidos o las bases se clasifican en débiles o fuertes según su grado de disociación, así los electrólitos fuertes son los que están más disociados y por lo tanto la concentración molar del ión hidrógeno o del ión hidroxilo en sus soluciones será igual a la normalidad, lo que simplifica el cálculo de su pH.

pH = -log [H+] y pOH = -log [OH-]



Además en toda solución acuosa: pH + pOH = 14Pero en el caso de los ácidos y bases débiles, los cuales están parcialmente

disociados, además de conocer la normalidad del ácido o base, deberá conocerse el grado de disociación de la sustancia, o sea, la constante de disociación ácida Ka o básica Kb, la cual es diferente para cada sustancia. En el cálculo del pH se deberá aplicar la fórmula en la que se toman en cuenta la constante K de disociación respectiva y la molaridad C de la solución.

pH = 1/2pKa – 1/2log C y pOH = 1/2 pKb – 1/2log C

EXPERIMENTO 3Empleando la fórmula que corresponda, calcule las cantidades adecuadas para preparar 250 mL de cada una de las siguientes soluciones:

• De ácido clorhídrico a partir de HCl al 37% de pureza y densidad de 1.18 g/mL.

• De pH = 1.3, 1.6 y 2

• De ácido acético a partir de CH3-COOH al 99.7% de pureza, densidad de 1.06 g/mL y pKa = 4.74.

• De pH = 3.02, 3.17 y 3.37• Prepare el par de soluciones que le indique su profesor y consérvelas para el

siguiente experimento.

ACIDEZ VERDADERA Y ACIDEZ DE TITULACIÓN

EXPERIMENTO 4Determine colorimétricamente (con papel indicador) el pH de cada una de las

soluciones que preparó en el experimento anterior. A continuación determine el pH potenciométrico de cada una de ellas.

• Posteriormente, mida exactamente 20 mL de la solución de HCl que preparó, colóquelos en un matraz Erlenmeyer,

• añada 2 gotas de solución de fenolftaleína y titúlela con NaOH 0.1N.• A continuación mida exactamente 20 mL de la solución de CH3-COOH que

preparó, colóquelos en otro matraz Erlenmeyer,• añada 2 gotas de solución de fenolftaleína y titúlela con NaOH 0.1N.

Con los datos obtenidos llene la tabla

Solución

PHTITULACIÓN

Gasto de NaOH 0.1N mL concentración

teórico

Colorimétrico

Potenciométrico

teórico

Experimental

(N tit x gasto)/V prob

HCl

CH3COOH



4. SOLUCIONES REGULADORAS

las soluciones reguladoras se les pueden añadir cantidades relativamente grandes de ácidos o álcalis sin alterar de manera significativa su pH. Esta acción amortiguadora se debe a la presencia en la solución de un sistema

formado por un ácido o una base débil y su sal correspondiente.A

Si se toma como ejemplo una solución que contenga un ácido débil, al que representaremos por HA y su sal, representada por BA los hidrogeniones existentes en ella procederán únicamente de las moléculas ácidas, que se disocian como sigue:

HA -- H+

+ A-

El equilibrio de la reacción está dado por la siguiente ecuación:

[H+

] [A- ]

--------------------- = Ka

[HA]

Donde Ka es la constante de disociación del ácido. De esta ecuación se deduce que la concentración de hidrogeniones es:

Ka [HA] [H+] = ------------------

[A- ]

La relación entre estas dos constantes es, sin embargo, tan sensiblemente constante en condiciones ordinarias que podemos afirmar que la concentración de A-

es igual a la concentración de la SAL. Sustituyendo una expresión por otra en la ecuación anterior tenemos:

[Ácido]

[H+

] = Ka --------------- [Sal]

Si se toman logaritmos negativos en ambos términos de la ecuación, (manipulación matemática para manejar números muy pequeños o muy grandes), queda así:

[Ácido]

- log [H+

] = - log Ka – log --------------- [Sal]

Ahora bien, si -log [H+

] es igual a pH, por analogía podemos decir que –log de Ka es igual a pKa por lo que:



[Ácido] pH = pKa – log ---------------

[Sal]

Por otra parte por las leyes de los logaritmos, las expresiones –log de ([Ácido]/[Sal]) y + log de ([Sal]/[Ácido]) son iguales y la segunda puede reemplazar a la primera, de tal modo que hechas todas las modificaciones la ecuación queda finalmente como sigue:

[Sal]pH = pKa + log ---------- [Ácido]

Esta ecuación se conoce con el nombre de Ecuación de Henderson–Hasselbalch y nos indica que el pH de una solución que contenga un ácido débil y su sal está determinado por el valor de pKa (constante para cada ácido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentración de la sal entre la concentración del ácido.

Por ejemplo, el valor de la constante de disociación Ka del ácido acético es de 1.8 x10-5. El valor de su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solución reguladora que posea iguales cantidades de ácido acético y acetato de sodio en concentración 0.1N, el pH de esa solución sería de:

0.1NpH = 4.74 + log ---------- = 4.74

0.1NAdemás de servir para la preparación de soluciones de pH conocido, las

soluciones reguladoras tienen dentro del organismo un papel de importancia capital que es el de evitar que aumente o disminuya de manera importante la concentración de iones hidrógeno, ya que la vida humana es posible en límites muy estrechos de pH, es decir, para la sangre arterial un pH de 7.40 y para sangre venosa y líquidos intersticiales 7.35.Este último es menor por tener mas CO2 y por lo tanto mas H2CO3 producido metabólicamente. Se sabe que los límites máximos de pH en los que por algunos minutos puede permanecer el organismo sin sufrir muchas alteraciones son de 7.0 a 7.8. En los líquidos donde existen y actúan al mismo tiempo varios sistemas amortiguadores, como sucede en la sangre, el ácido o la base que entra es amortiguado por todos los sistemas presentes de manera proporcional a la eficacia de cada uno de ellos.

La regulación fisicoquímica tiene lugar en todos los medios que contienen reguladores, constituidos principalmente por ácidos o bases débiles y sus sales. Por ejemplo el de fosfatos H2PO4

-/HPO4= con un pKa2 de 7.2 (o de 6.8 a la

temperatura corporal), es el principal amortiguador intracelular.El principal amortiguador extracelular en la sangre y líquidos intersticiales es

el sistema bicarbonato H2CO3/HCO3- con un pKa de 6.1.



En el interior del eritrocito, además del bicarbonato, el amortiguador de mayor importancia es el de hemoglobina reducida / oxihemoglobinato (HHb/HbO2). Otros sistemas son los de proteínas y aminoácidos.

Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existen excesos de álcali ó ácido ya que un cambio del pH afecta la estructura y la actividad de las proteínas, la distribución de otros iones entre las células y el líquido extracelular, la actividad de hormonas y fármacos, etc.

APRECIACIÓN DEL PODER REGULADOR Y EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN

EXPERIMENTO 1• Disponga 3 series de 4 tubos de ensayo cada una.• Numere los tubos de cada serie del 1 al 4.• Coloque en los tubos número 1 de cada serie 5 mL de agua destilada hervida.

• En los tubos número 2 coloque 5 mL de solución de cloruro de potasio (KCl) 0.5M

• En los tubos número 3 ponga una mezcla formada por 2 mL de solución de fosfato diácido de potasio (KH2PO4) 0.01M y 3 mL de solución de fosfato monoácido disódico (Na2HPO4) 0.01M.

• En los tubos número 4 ponga 2 mL de solución de KH2PO4 0.1M y 3 mL de solución de Na2HPO4 0.1M.

1. A continuación compruebe en la serie 1 que el pH de las soluciones es aproximadamente neutro, para ello agregue cinco gotas de indicador rojo de fenol (rosa), a cada uno de los tubos de la serie y observe el color característico amarillo o rojo correspondiente a un pH de 6.8 a 8.2.

2. A los cuatro tubos de la serie 2 adicione cinco gotas de verde de bromocresol, indicador de zona ácida. A continuación agregue 10 gotas de HCl 0.01M al tubo número 1 y observe el cambio de color que se opera (de verde a amarillo).

3. Enseguida vea el número de gotas de la misma solución de HCl 0.01M que es necesario agregar al tubo 2 de la serie en cuestión para igualar la coloración (aunque no la intensidad) con el tubo número 1.

4. Ahora, cuente el número de gotas de solución de HCl 0.1M que es necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloración con el tubo número 1. (Cada una de estas gotas de HCl 0.1M equivale a 10 gotas de HCl 0.01M)



1. Adicione a los cuatro tubos de la serie 3, cinco gotas de azul de timol, indicador de zona alcalina que vira de amarillo a azul fuerte correspondiendo a un pH 8.0 a 9.6).

2. A continuación agregue 10 gotas de solución de NaOH 0.01M al tubo número 1 y observe también el cambio de coloración (de amarillo a azul).

3. Determine el número de gotas de la misma solución de NaOH 0.01M que es necesario agregar al tubo número 2 de esta serie para que adquieran el mismo color del tubo número 1, (amarillo a azul).

4. A continuación, cuente el número de gotas de solución de NaOH 0.1M que es necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloración con el tubo número 1.

1)¿Qué indica el cambio de color en cada una de las series?

2)¿Cómo explicaría usted la diferencia en las cantidades de ácido y base que deben agregarse a los tubos 2, 3 y 4 de las series correspondientes para igualar la coloración con el tubo 1?

3) Recuerde que cada gota de las soluciones 0.1M equivale a 10 gotas de las soluciones 0.01M.

CURVAS DE TITULACIÓN

Existen sustancias de mucha importancia en bioquímica como son los aminoácidos y las proteínas los cuales tienen grupos titulables y que actúan como anfolitos aceptando iones H+ o iones OH-. En este experimento se determinarán las curvas de titulación de glicina con HCl y con NaOH.

EXPERIMENTO 2• En un vaso de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solución de glicina

0.1N, agregue una barra magnética y colóquela sobre el agitador, tómeles el pH y titule, como se indica en la tabla, con NaOH 0.1N.

• En otro vaso de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solución de glicina 0.1N, agregue una barra magnética y colóquela sobre el agitador, tómeles el pH y titule, como se indica en la tabla, con HCl 0.1N.



Agregar HCl 0.1N Glicina 0.1N 30 ml

Agregar NaOH 0.1N Glicina 0.1N 30 ml

ml Acumulativo pH ml Acumulativo PH

0 0 0 0

2 2 2 2

3 5 3 5

4 9 4 9

5 14 5 14

5 19 5 19

5 24 5 24

1 25 1 25

1 26 1 26

1 27 1 27

1 28 1 28

0.5 28.5 0.5 28.5

0.5 29 0.5 29

Grafique dando a los valores acumulativos de HCl signo negativo y a los de NaOH signo positivo, en el eje de las x y el pH en el eje de las y.

1)En su gráfica, identifique los valores de pK1 y pK2.2)Calcule el punto isoeléctrico sabiendo que:

pK1 + pK2 pI = -------------

2

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES REGULADORAS

EXPERIMENTO 3Empleando la fórmula de Henderson Hasselbalch, calcule los volúmenes

necesarios para preparar soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le indique su profesor, empleando fosfato diácido de potasio (KH2PO4) 0.1M y fosfato monoácido de sodio (Na2HPO4) 0.1M (pK2 = 7.2); posteriormente prepárelas y compruebe sus resultados midiendo el pH potenciométrico.

Explique la coincidencia o no, entre sus resultados y el cálculo teórico.



5.PROTEÍNAS

rincipales componentes del protoplasma y las membranas celulares, su nombre deriva del griego protos que significa “primero”, “primordial” o fundamental, contienen en su molécula C, H, O, N y en ocasiones P y S.P

El nitrógeno constituye aproximadamente el 16%; por hidrólisis dan como producto final αα aminoácidos, los cuales varían en número, cantidad y posición en cada proteína. La proteína está determinada por cuatro niveles estructurales

• La estructura primaria depende del número y secuencia de aminoácidos unidos por enlace peptídico (-CO-NH-) covalente.

• En la estructura secundaria la cadena polipeptídica puede enrollarse formando estructuras helicoidales u otro tipo de conformación, estabilizadas por puentes de hidrógeno

• La estructura terciaria es una cadena polipeptídica ya enrollada que adopta la conformación más estable, o sea, sufre un súper enrollamiento.

• La estructura cuaternaria puede estar constituida por más de una cadena polipeptídica y en la asociación de estas cadenas participan todos los tipos de enlaces químicos, fuertes o débiles, debido a lo cual adoptan una estructura tridimensional característica que les da actividad biológica.

Existen muchos tipos de proteínas en el organismo, cada una con una función específica; algunas son estructurales, otras actúan como catalizadores u hormonas, generan presión oncótica para mantener el balance hidroelectrolítico, son mecanismos genéticos, de defensa, transportan gases, electrones, solutos a través de la membrana, etc.

La actividad de una proteína depende de su conformación espacial, por lo que agentes físicos y químicos que alteran los diferentes enlaces son capaces de anularla. Algunos de los agentes desnaturalizantes más comunes son ácidos o bases, detergentes, metales pesados, solventes orgánicos, alcaloides, calor, radiaciones ultravioleta, rayos x, ondas ultrasónicas, sales inorgánicas, sustancias orgánicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc.

Las proteínas desnaturalizadas pierden su actividad, modifican su solubilidad y precipitan. Tal como existen en la naturaleza se denominan proteínas nativas.

ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

Las propiedades fisicoquímicas y biológicas características de las proteínas se deben a los aminoácidos que las constituyen y las reacciones coloridas que se utilizan para su análisis en realidad detectan la presencia de un aminoácido específico.

Ensayaremos a continuación algunas de ellas.



REACCIÓN DE MILLÓNEs específica para el grupo fenólico y por lo tanto, la dan positiva todas las

sustancias que poseen esta función, como el fenol, ácido salicílico, timol, tirosina y todas aquellas proteínas que contengan tirosina.

EXPERIMENTO 1Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno,

2 mL de una de las soluciones siguientes:

Tubo Proteína (al 2%)1 Peptona2 Caseína3 Gelatina4 Albúmina

• Posteriormente añada 5 gotas del reactivo de Millón.• Caliente ligeramente hasta que la solución hierva. ¡Precaución!.• La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparición de un

precipitado blanco el cual por acción del calor se vuelve rojo.La presencia de sales, así como soluciones muy alcalinas, pueden interferir en esta reacción.

1)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo.2)Explique en qué consiste el reactivo de Millón y cuál es el mecanismo que se

ha propuesto para esta reacción.

REACCIÓN DEL BIURET

Todas las moléculas que contengan dos o más uniones peptídicas, por lo tanto todas las proteínas y péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva la reacción del biuret. El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba.

Cuando una proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre (CuSO4) en solución alcalina se produce un color característico púrpura o violeta.

El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar las proteínas y péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrólisis proteica, la reacción será negativa cuando la hidrólisis sea completa.

EXPERIMENTO 2Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 1 mL

de las siguientes soluciones:



Tubo Proteína (al 2%)1 Peptona2 Caseína3 Gelatina4 Albúmina

• Añada 2 mL de solución de NaOH al 10% ¡Precaución!• y 3 a 5 gotas de solución de sulfato de cobre CuSO4 al 1%.

Agite los tubos y observe la reacción que se produce en cada caso. La aparición de una coloración violeta o rosa en no más de 20 minutos debe considerarse como prueba positiva.

1)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo.2)¿Se puede considerar la reacción del biuret como característica para todas las

proteínas? ¿Por qué?3)Escriba la reacción.

REACCIÓN XANTOPROTÉICA

Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por reacción del ácido nítrico sobre grupos bencénicos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptófano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos aromáticos en su molécula.

EXPERIMENTO 3Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL

de una de las siguientes soluciones:

Tubo Proteína (al 2%)

1 Peptona2 Caseína3 Gelatina4 Albúmina

• Añada 1 mL de ácido nítrico (HNO3) concentrado °con cuidado!,• caliente ligeramente y observe una coloración amarilla característica.• Deje enfriar esta solución y añada cuidadosamente gotas de hidróxido de

amonio (NH4OH) concentrado, haciéndolas resbalar cuidadosamente por las paredes del tubo, para estratificar.

• En la interfase se observará un anillo naranja.



1)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo.2)¿Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas?3)Explique por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO3.

REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Las proteínas que contengan los aminoácidos cisteína y cistina cuando se tratan con álcalis concentrados, desprenden ácido sulfhídrico H2S, el cual se puede reconocer por su olor fuertemente desagradable y característico, o bien, por la formación de un precipitado negro de sulfuro de plomo (PbS).

EXPERIMENTO 4Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL de una de las siguientes soluciones:

Tubo Proteína (al 2%)

1 Peptona2 Caseína3 Gelatina4 Albúmina

• Agregue 2 mL de hidróxido de sodio (NaOH) al 10%. ¡Precaución!• Caliente ligeramente.• Añada a todos los tubos 0.5 mL de solución de acetato de plomo

(Pb(CH3COO)2).• Coloque los tubos en baño maría a ebullición por 5 min.

El oscurecimiento de la solución o la formación de un precipitado negro indica la presencia de aminoácidos azufrados.

1)Anote sus resultados en la tabla al final del capítulo.2)Escriba la reacción química que se ha efectuado.3)¿Qué sustancias pueden interferir en esta reacción?

REACCIÓN DE NINHIDRINA

Es una de las reacciones más sensibles para identificar aminoácidos en general, ya que detecta una parte de aminoácido en 1 500 000 partes de agua. Aminoácidos y muchas aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina da coloración amarilla. Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos por colorimetría. La valoración de aminoácidos en orina, por ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en algunas enfermedades como hepatopatías, infecciones agudas o diabetes mellitus en las que se presenta hiperaminoacidemia, estas se ven acompañadas por aminoaciduria



paralela. Algunas enfermedades metabólicas congénitas dan lugar a la eliminación anormal de algunos aminoácidos en la orina (p. ej. fenilcetonuria).

EXPERIMENTO 5Se utilizarán cuadros de papel filtro Whatman no. 1 de 2 x 2 cm, sobre los cuales se colocarán gotas de las siguientes soluciones:

cuadro Sustancia:

1 Glicina2 Peptona3 Gelatina4 Caseína5 Albúmin

a

• ¡Precaución! Use guantes o pinzas para manipular el papel.• Anote debajo de cada muestra el nombre del compuesto y• añádale una gota de solución de ninhidrina en butanol al 0.1%.• Coloque el papel en el horno a 110 °C durante 5 minutos.• Describa el aspecto de la reacción

1)Anote sus resultados en la tabla al final del capítulo.2)Escriba la reacción química que se ha efectuado.3)¿Qué sustancias dan positiva la reacción de la ninhidrina, además de las

proteínas, péptidos y aminoácidos?

Tabla de resultados de algunas propiedades químicas de las proteínas:

SUSTANCIA REACCIÓNMILLON

BIURET

XANTOPROTÉICA

AMINOÁCIDOS

AZUFRADOS

NINHIDRINA

GLICINAPEPTONAGELATINACASEÍNA

ALBÚMINA

ALGUNAS DE LAS PROPIEDADES FÍSICO – QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

Muchas de las propiedades químicas de las proteínas son comunes a varias especies por que contienen el mismo tipo de aminoácidos, por lo que para caracterizar una proteína es necesario estudiar sus propiedades fisicoquímicas las



cuales dependen del peso molecular, de su carga eléctrica neta y de la conformación que adopte la molécula.

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

Cuando la estructura altamente ordenada de una proteína se somete a la acción de agentes fisicoquímicos desnaturalizantes, queda reducida al llamado polímero estadístico o cadena de aminoácidos y además pierde toda actividad biológica.

A continuación se consideran algunos de los agentes desnaturalizantes más importantes como son los metales pesados, los ácidos fuertes y el alcohol.

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS

Las proteínas cuando se encuentran en solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinatos insolubles. Tomaremos como ejemplo dos proteínas, la peptona y la gelatina y observaremos su reacción, en forma simultánea frente a los metales pesados : Hierro (Fe), Plata (Ag), Mercurio (Hg), y Plomo (Pb).

EXPERIMENTO 6• Prepare una serie de 4 tubos de ensayo conteniendo 1 mL de peptona al 2% y

rotúlelos como P1 – P4 (por peptona).

• Prepare otra serie de 4 tubos, ésta vez con gelatina al 2%. Rotúlelos como G1 – G4 (por gelatina)

• y agregue lo que se indica en la tabla.

Anote sus observaciones en la misma, evaluando por medio de cruces (de x a xxx según la turbiedad del precipitado).

Serie P

Serie G Metal Pesado:

Observaciones:

Precipitado: Con exceso:Tubos: Agregar 2 gotas de

solución al 2% de:Serie

PSerie

GSerie

PSerie

G1 1 FeCl32 2 AgNO3

3 3 HgCl24 4 Pb(CH3COO) 2

1)¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las proteínas?

2)¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las proteínas?



PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES

Los ácidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las proteínas formando productos de desnaturalización insolubles conocidos como metaloproteínas.

EXPERIMENTO 7aColoque en 4 tubos de ensayo numerados, 3 mL de las siguientes soluciones:

peptona, gelatina, caseína y albúmina al 2% y añada un volumen igual de ácido tricloroacético (CCl3COOH) al 5%.

1)Anote sus resultados al final del capítulo.2)¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del ácido tricloroacético y en

general de cualquier ácido?

EXPERIMENTO 7bPrepare dos tubos de ensayo y márquelos como orina normal y orina de

paciente nefrótico, coloque en ellos 3 mL de la orina correspondiente. Agregue enseguida, resbalando cuidadosamente por la pared del tubo, para estratificar, 2 mL de la mezcla HNO3 – metanol.

1)Observe lo que ocurre en la interfase y describa2)¿Qué explicación le da al fenómeno?

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DEL ALCOHOLEXPERIMENTO 8

Coloque en tubos de ensayo numerados, 2 mL de las siguientes soluciones: peptona, caseína, gelatina y albúmina al 2%, estratificando cuidadosamente, agregue 3 mL de alcohol de 96° (CH3CH2OH) y observe que ocurre en la interfase.

1)¿Observa turbidez en todos los tubos?2)Anote sus resultados en la tabla:

AgenteSustancia

Ácido tricloroacético (CCl3COOH) al 5%

Alcohol de 96° (CH3CH2OH)

PeptonaGelatinaCaseína

Albúmina

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICOLas proteínas al igual que los aminoácidos son moléculas anfotéricas. Es decir,

pueden reaccionar con ácidos o con álcalis. En medio ácido las proteínas se combinan con los iones hidrógeno y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberan protones y quedan con carga negativa. El pH en el cual una proteína no posee carga Laboratorio de Bioquímica Médica 1 30


eléctrica neta se denomina punto isoeléctrico, a este pH la proteína presenta su mínima solubilidad y generalmente precipita, teniendo además una viscosidad máxima, propiedades que tomaremos en cuenta para el siguiente experimento.EXPERIMENTO 9

Prepare una serie de 9 tubos de ensayo siguiendo las instrucciones de la tabla:• Añada primero la caseína, posteriormente el agua y al final el ácido

acético.• Agite todos los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitación que se

produce en cada tubo• inmediatamente y después de 15’ y 30’.

1)Anote sus observaciones en la tabla valorando con cruces.2)Calcule el pH teórico de cada tubo, aplicando la ecuación de Henderson -

Hasselbalch y anótelo en la tabla.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Caseína al 5% en acetato de sodio 0.1N ml

1 1 1 1 1 1 1 1 1

Agua destilada ml

8.4

7.8

8.8

8.5

8.0

7.0

5.0

1.0

7.4

Ácido acético 1N ml

- - - - - - - - 1.6

Ácido acético 0.1N ml

- - 0.2

0.5

1.0

2.0

4.0

8.0

-

Ácido acético 0.01N ml

0.6

1.2

- - - - - - -

pH teórico

Observación a los 15 minutos

Observación a los 30 minutos



6. CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS

e acuerdo con la Ley de Acción de Masas, la velocidad de una reacción química depende de la concentración de las sustancias que intervienen en la reacción. Esta Ley establece que: “La magnitud de una reacción es

proporcional a la masa activa de las sustancias reaccionantes presentes en ese momento”.

DEl término masa activa significa la concentración molecular o sea, la cantidad

presente por unidad de volumen. Si reaccionan: V1

A + B C + D V2

La velocidad V1 con que reaccionan A y B para producir C y D depende de la concentración de cada reactivo y de la afinidad que tengan para reaccionar entre sí, pero como esto se puede considerar constante, podemos decir que:

V1 = k1[A][B]

La velocidad V2 con que reaccionan C y D para producir A y B depende a su vez, de la concentración de C y D y de la afinidad. Por lo tanto podemos decir también que:

V2 = k2[C][D]

Cuando se alcanza el equilibrio químico, las dos velocidades son iguales. Es decir:

V1 = V2

Sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos:

k1[A][B] = k2[C][D]

k1 [C][D]---- = --------- k2 [A][B]

Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante podemos decir que:

[C][D]keq = --------- [A][B]

Que es la expresión matemática de la Ley de Acción de Masas y keq se conoce como Constante de Equilibrio.



COMPROBACIÓN DE LA LEY DE ACCIÓN DE MASAS

EXPERIMENTO 1En un vaso de precipitados de 600 mL de capacidad, añada 100 mL de agua

destilada, 1 mL de solución de sulfocianuro de amonio (NH4SCN) 0.2M y 1 mL de solución de cloruro férrico (FeCl3) 0.2M en HCl 0.1N mezclando hasta lograr la homogeneidad.

Observará la aparición de una coloración roja, debida a la formación de sulfocianuro férrico (Fe(SCN)3).

En cuatro vasos gerber, coloque en cada uno 25 mL de la mezcla reaccionante anterior, después de haber agitado hasta completa homogeneidad, enseguida agregue a cada vaso los reactivos descritos en la tabla siguiente:

ReactivoVaso

FeCl3 0.2M en HCl 0.1N ml NH4SCN 0.2M ml NH4Cl ml

1 0.5 0.5 --

2 1.0 1.0 --

3 -- -- 5.0

4 Testigo --

1)Escriba la reacción química que se ha efectuado.2)Observe la intensidad de la coloración en cada vaso y de acuerdo a la Ley de

Acción de Masas y al principio de Le Chatelier trate de explicar sus resultados.

VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA

El orden de la reacción, tiene mas importancia que el tipo, cuando se estudia la cinética, ya que nos indica la relación entre la velocidad y la concentración de los reactivos, por lo que se clasifican en:

Reacciones de orden cero. Su velocidad no es afectada por la concentración.• Está determinada por algún otro factor limitante como absorción de luz, velocidad de

difusión, etc.Reacciones de primer orden. Su velocidad de reacción es directamente proporcional

• a la concentración de una de las sustancias reaccionantesReacciones de segundo orden. Su velocidad de reacción es proporcional

• a la concentración de dos sustancias reaccionantes.Reacciones de tercer orden. Su velocidad de reacción es proporcional

• a la concentración de tres sustancias reaccionantes.

La mayor parte de las reacciones enzimáticas se caracterizan por seguir el modelo correspondiente a las reacciones de primer orden. Matemáticamente la reacción puede representarse así:

dc



----- = Ke

dtdt = tiempo dc = concentración del material Ke = constante específica de velocidad de reacción

Si representamos por a la concentración inicial de material y por x la cantidad que ha reaccionado en el tiempo t, la expresión a-x significa concentración del material en el tiempo t. La ecuación anterior puede expresarse en función de a, x y t y al integrarla nos queda:

2.303 aKe =------------ x log -------- t (a – x)

Cuando se ha completado la descomposición de la mitad del material, la ecuación se simplifica y queda: 2.303 (log 2)

Ke =------------------------- t1/2

Donde t1/2 es el período de vida media, es decir, el tiempo necesario para que se descomponga la mitad de una cantidad dada de material reaccionante.

VELOCIDAD DE DESCOMPOSICIÓN DEL H2O2 EXPERIMENTO 2

• Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, 5 mL de una solución problema de peróxido de hidrógeno (H2O2)y 2 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) (1:6).

• Caliente la mezcla hasta casi ebullición ¡PRECAUCIÓN!• y así en caliente, titule con una solución de permanganato de potasio (KMnO4)

0.01M.El punto final de la titulación lo observará cuando persista un ligero color rosa, por exceso de la solución de permanganato. El H2SO4 y el calentamiento tienen por objeto impedir la formación de MnO2. Haga esta determinación por duplicado y haga el promedio de las dos determinaciones.

• A continuación prepare una mezcla de 50 mL de sangre desfibrinada al 0.06% y 50 mL de la solución problema de peróxido de hidrógeno.

• A los 5, 10, 20, 30 y 40 minutos tome alícuotas de 10 mL y transfiéralos a un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad,

• añada 2 mL de solución de H2SO4 (1:6) caliente hasta casi ebullición• y titule con una solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0.01M en la

forma ya explicada.1)Escriba las reacciones químicas que se han efectuado.2)Resuma sus resultados en la siguiente tabla:



Tiempo/s KMnO4 0.01M/mL (a – x) moles/L log a/(a-x) Ke

0

300

600

1200

1800

2400

Para calcular la Ke a cada tiempo debe utilizar la ecuación:

2.303 aKe = ------------ x log -------- t (a – x)

1)Determine el orden de reacción gráficamente.

INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA

Desde hace muchos años se sabía en forma empírica que la velocidad de muchas reacciones aumenta al aumentar la temperatura. Arrhenius encontró una relación que expresa matemáticamente la forma como la temperatura afecta la velocidad de una reacción, la cual está dada por la siguiente ecuación:

d(ln K) E----------- = ----------

dt RT2

La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de velocidad de una reacción es inversamente proporcional al cuadrado de la temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases. E es la energía de activación. Actualmente se considera que para que las moléculas puedan reaccionar deben ser primero activadas, es decir, requieren una cantidad de energía E. Integrando entre límites la ecuación de Arrhenius:

K2 E (t2 - t1) log ------- = ------------- K1 2.3 (R t1 t2)

K2 E (t2 - t1) log ----- = ---------------------

K1 2.3 (1.99) (t1 t2) K2 0.219E (t2 - t1)



log ------- = ---------------------- K1 (t1 t2)

Si consideramos que E = 1200 calorías al aumentar la temperatura de 22°C a 32°C, tendríamos: K2 0.219 x 1200 x (305 - 295)

log ------ = --------------------------------------- = 0.29 K1 (295 x 305)

K2

antilog log ------- = antilog 0.29 K1

K2

------- = 2 K1

Esto quiere decir que por cada 10°C de aumento la velocidad de la reacción se duplica. En la mayor parte de las reacciones se observa este aumento bajo ciertas temperaturas límites.

EXPERIMENTO 3• Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad 0.25 g de yoduro de

potasio (KI) y añada 25 mL de solución de H2SO4 1:6.• Agite hasta disolución completa y agregue agua destilada hasta completar 50

mL.Esta solución se denominará Solución de ácido yodhídrico HI y se utilizará en este experimento y en el siguiente.

Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL y agregue los reactivos según la tabla que se muestra a continuación:

vasosolución

1 2 3 4 5

HI ml 5 5 5 5 5

Na2S2O3 0.02N ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Almidón gotas 5 5 5 5 5

Preincubar 5 minutos a: 5 °C 25 °C

40 °C

60 °C

90 °C

H2O2 al 0.2% ml 2 2 2 2 2

Deberá medir con la mayor precisión posible el tiempo desde el momento de añadir el H2O2 al 0.2% hasta el momento en que aparece súbitamente un color azul intenso.

1)Escriba las reacciones químicas que se han efectuado.2)Resuma sus resultados en la siguiente tabla:

Temperatura °C Tiempo de aparición del color azul en segundos:



3)Trace la gráfica de 1/tiempo de reacción en las ordenadas contra la temperatura en las abscisas.

EFECTO DE LA [H+] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA

Se sabe que muchas reacciones químicas son afectadas por el pH del medio, las moléculas deben ser activadas para que puedan reaccionar, el pH ácido favorece la ionización y el estado iónico se puede considerar como un estado activado.

EXPERIMENTO 4Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL de capacidad y

numérelos del 1 al 5 y agregue los reactivos según se indica en la tabla siguiente:

VasoSolución

1 2 3 4 5

HI ml 5 5 5 5 5

Na2S2O3 0.02N ml 1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

Almidón gotas 5 5 5 5 5

H2O destilada ml 5

HCl 0.01N ml 5

HCl 0.1N ml 5

HCl 1N ml 5

HCl 2N ml 5

H2O2 al 0.2% ml 2 2 2 2 2

1)Resuma sus resultados en la siguiente tabla:

[H+]Tiempo de reacción

en segundos:1 x 10-7

1 x 10-2

1 x 10-1

1

2

2)Según sus resultados trace una gráfica con el 1/tiempo en segundos en las ordenadas y la concentración de H+ en las abscisas.

VELOCIDAD DE REACCIÓN Y CATALIZADORES



La velocidad de una reacción química es afectada por la presencia de “sustancias extrañas”, catalizadores, que son capaces de acelerar la reacción al disminuir la cantidad de energía de activación necesaria. Actualmente se considera que el catalizador se combina con el sustrato formando un complejo intermediario inestable y altamente reactivo. Supongamos la reacción:

A + B ABEsta reacción en condiciones normales se efectúa muy lentamente pero si se

añade un catalizador C apropiado, tenemos:A + B + C (AC) + B AB + C

Estas reacciones son rápidas y el catalizador puede ser usado una y otra vez. Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgánica o bien sustancias orgánicas complejas producidas por las células que son denominadas enzimas.

EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGÁNICO SOBRELA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

La sacarosa es un disacárido no reductor, pero al hidrolizarse, cada molécula libera una molécula de glucosa y una de fructosa, ambas reductoras. Basándose en esto es posible visualizar y cuantificar la hidrólisis de la sacarosa midiendo la concentración de azúcares reductores con algún reactivo apropiado.

EXPERIMENTO 5Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solución de

sacarosa al 0.05M.• Un tubo quedará como testigo• y al otro se agregarán 3 gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) (1:6).• Se ponen ambos tubos en baño maría a ebullición durante 15 minutos,

complete el volumen si es necesario.Emplearemos el reactivo de Fehling para lo cual

• el tubo que contiene el H2SO4 se neutraliza con 1 ml hidróxido de sodio (NaOH) al 10%

• y posteriormente se añaden 2 mL de la solución “A” y 2 mL de la solución “B” del reactivo de Fehling mezclándolos perfectamente

• y se colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos• al cabo de los cuales se sacan del baño y se dejan enfriar• y se observa si existe un precipitado rojo de óxido cuproso (Cu2O) en ambos

tubos.

1)¿Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador? ¿Por qué?EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLOGICO (ENZIMA) SOBRE

LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA

Una de las principales diferencias entre los catalizadores inorgánicos y las enzimas es que los primeros solo son capaces de acelerar un proceso con



temperaturas altas, mientras que las enzimas son capaces de hacerlo a temperaturas considerablemente más bajas.

Para esta práctica emplearemos sacarasa, también conocida como invertasa o fructofuranosidasa la cual es una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas. Actúa hidrolizando los azúcares que contienen fructosa. Así hidroliza la estaquiosa (tetrasacárido), la rafinosa (trisacárido), y alcanza su máxima velocidad con la sacarosa (disacárido). Se puede medir la hidrólisis observando el cambio en la rotación óptica o valorando el poder reductor de los productos obtenidos.

EXPERIMENTO 6Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solución de

sacarosa 0.05M y 1 mL de solución reguladora de acetato de sodio 0.05M a pH de 4.7

• Un tubo quedará como testigo• y al otro se le agregan 0.2 mL de la solución de invertasa (solución enzimática).• Después de mezclar bien el contenido de ambos tubos se colocan en baño maría

a 40°C durante 15 minutos;• cuando se ha completado el tiempo se les agregan a ambos tubos 2 mL de la

solución A y 2 mL de la solución B del reactivo de Fehling, mezclándolos perfectamente.

• Se colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos al cabo de los cuales se sacan del baño y se dejan enfriar.

• Observe si existe un precipitado rojo de óxido cuproso Cu2O en ambos tubos.

Compare este experimento con el anterior y explique que sucede.



7. ENZIMASFACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

a vida depende de diversos catalizadores orgánicos denominados enzimas: (del griego en = en, zymo = fermento). La mayor parte de las reacciones biológicas serían cinéticamente insignificantes si no fuera por ellas. De naturaleza

proteica, son muy sensibles a cualquier cambio en temperatura, pH, fuerza iónica, adición de sales, presencia de agentes oxidantes o reductores, presencia de metales pesados, etc. Al desnaturalizarse se inactivan.

LNATURALEZA QUÍMICA DE LAS ENZIMAS

Son proteínas simples o complejas. Su parte proteínica se denomina apoenzima. Si su parte no proteinica se separa fácilmente se le denomina coenzima. Las coenzimas están relacionadas con las vitaminas y no catalizan por sí mismas, ya que se transforman durante la reacción en que intervienen y requieren de otra enzima para regenerarse. Por otra parte, cuando se encuentra firmemente unida por enlace covalente, no es posible separarla por diálisis y se le denomina grupo prostético.

Varios factores afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas. Algunos de ellos son: temperatura, pH, concentración de sustrato, concentración de enzima e inhibidores.

TemperaturaAl incrementar la temperatura, se incrementa la energía cinética, lo que ocasiona una

mayor probabilidad de colisiones efectivas. La velocidad de las reacciones químicas aumenta. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura óptima, en la cual catalizan con una velocidad máxima.PH

La actividad de la mayoría de las enzimas depende del pH debido a la participación de iones [H+] o iones [OH+] en las reacciones, además que se afecta la carga de los grupos funcionales. La mayoría de las enzimas tienen un pH óptimo en el cual su actividad es máxima.Concentración de la enzima

La velocidad de una reacción aumenta en proporción directa a la concentración de la enzima que la cataliza. La interacción enzima – substrato cumple la Ley de Acción de Masas. Se emplea con frecuencia la velocidad de una reacción como medida de concentración de la enzima manteniendo fija la concentración de substrato.Concentración de sustrato

Si se trabaja con una concentración fija de enzima la velocidad inicial de reacción aumenta al incrementar la concentración del sustrato. Con el tiempo se alcanza un máximo cuando la enzima se satura y la adición de más sustrato ya no influye sobre la velocidad.Inhibidores



EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La temperatura óptima para la gran mayoría de enzimas de animales homeotermos, está alrededor de 37°C. Por cada 10 grados centígrados de incremento en la temperatura se duplica la velocidad, esto se conoce como la relación de van´t Hoff, o coeficiente de temperatura QT10. Pero esto ocurre únicamente si no se rebasa la temperatura de desnaturalización, ya que cerca de los 60 °C la mayor parte de las enzimas se inactivan y se ocasiona una disminución marcada en la actividad catalítica, hecho que se aprovecha en la técnica de pasteurización.

EXPERIMENTO 1Se prepara una serie de siete tubos como sigue:

TuboReactivos 1 2 3 4 5 6 7

Sustrato almidón 8 mg/mL mL

--- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Solución reguladora de fosfatos 0.02M, pH = 7

mL

--- 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Agua destilada mL

5 3 3 3 3 3 3

Preincubar 5 minutos a 25°C 5°C 25°C

40°C

50°C

60°C

92°C

Enzima (sol. de amilasa) mL

--- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Conserve la solución de amilasa en baño de hielo.• Todos los tubos se agitan muy bien y se colocan en sus respectivos baños

dejándolos durante 15 minutos al final de los cuales se les agrega, 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico (este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares reductores).

• Se agitan bien y se colocan en baño maría a ebullición por 10 minutos después de lo cual se enfrían y se leen en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo no. 1 como blanco.

Con los datos obtenidos grafique la densidad óptica en las ordenadas y la temperatura en las abscisas.

EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Tubo Temperatura Absorbancia1 25 °C Blanco2 5 °C3 25 °C4 40 °C5 50 °C6 60 °C7 90 °C

EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICALaboratorio de Bioquímica Médica 1 41


El pH es uno de los factores que más afectan la actividad de las enzimas, por desnaturalización, o bien afectando su carga eléctrica. El pH óptimo es aquel en el cual ciertos grupos funcionales poseen la carga apropiada para asegurar la formación del complejo ES. Para la mayoría de las enzimas la activi dad óptima se encuentra entre los valores de pH de 6 a 8. Sin embargo, para la pepsi na del jugo gástrico es máxima a un pH de 1.5 que es muy ácido, o para la fosfatasa alcalina que se encuentra en huesos y otros órganos y cuyo pH optimo es de 9.5.

EXPERIMENTO 2Prepare una serie de 6 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla:

Reactivos Tubo1 2 3 4 5 6

Sustrato (sol de almidón 8 mg/mL) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5Sol. reguladora al pH indicado 7 5 6 7 8 9

mL 4.5 4 4 4 4 4Enzima (sol de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezcle e incube a 40°C por 15 minutos

• Terminado este lapso todos los tubos se agitan y se les agrega 1 mL de reactivo de ácido dinitrosalicílico. Caliéntelos en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares reductores.

• Determine la concentración del azúcar reductor liberado, leyendo la densidad óptica en el espectrofotómetro a 540 nm (Puede ser necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 veces con agua antes de leer).

1)Basándose en sus resultados diga ¿Cuál es el pH óptimo de la amilasa?2)¿Qué azúcar se libera en la hidrólisis de este polisacárido?3)Resuma sus resultados en la siguiente tabla y trace con ellos la gráfica

correspondiente (D.O. contra pH)

pH y ACTIVIDAD ENZIMÁTICATUBO pH D.O.

1 72 53 64 75 86 9

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA Y DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN



Actualmente se acepta que la reacción enzimática se efectúa a través de la formación de un complejo enzima – sustrato, lo cual puede representarse en forma muy simplificada así: S + E [ES] P + E

Si [E] es la concentración total de enzima y [ES] es la enzima combinada, entonces [E – ES] es la concentración de enzima libre. Recordando la Ley de Acción de Masas, tenemos:

V1 = K1 – [E – ES] [ES]; V2 = K2 – [ES]; V3 = K3 – [ES]

La velocidad de formación (Vf) del complejo [ES] depende de V1 mientras que la velocidad de degradación (Vd) depende de V2 + V3. Por lo tanto en el equilibrio tenemos: Vf = Vd es decir: V1 = V2 + V3

Sustituyendo sus valores nos queda:K1[E – ES] [S] = K2[ES] + K3[ES]

Dividiendo ambos miembros entre K1 y [ES] nos queda: K1[E – ES] [S] (K2 + K3)[ES]

---------------------------- = ------------------------------K1[ES] K1[ES]

Simplificando: [E – ES] [S] (K2 + K3)

--------------------- = ------------------ = KM constante de Michaelis [ES] K1

La constante de Michaelis – Menten se utiliza como una medida de la afinidad entre la enzima y el sustrato, aunque no es propiamente la constante de afinidad. La constante de Michaelis – Menten (KM) se define como la concentración de sustrato cuando la reacción adquiere la mitad de su velocidad máxima. Cuando esto sucede:

[E – ES] = [ES]Y por lo tanto, sustituyendo: KM = [S]

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATOSi en una reacción enzimática se mantiene constante la concentración de la

enzima y todos los demás factores que pueden modificar la actividad, se observa experimentalmente que al aumentar la concentración del sustrato, aumenta progresivamente la velocidad de la reacción hasta llegar a un máximo (velocidad máxima) después del cual ya no se afecta la velocidad aunque se trabaje a concentraciones más altas de sustrato. En algunas enzimas se observa incluso una disminución en la actividad si se aumenta demasiado la concentración de sustrato.

EXPERIMENTO 3Prepare una serie de 8 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla:

TuboReactivos 1 2 3 4 5 6 7 8Sustrato (almidón 8 mg/mL) mL 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 7.5 7.5



Sol reguladora de fosfatos 0.02M pH = 7 mL 7.0 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 0.0 0.5Sol de enzima (amilasa) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0

Mezcle bien los tubos e incube a 40°C por 15 minutos

Transcurrido este tiempo añada a todos los tubos, con objeto de detener la reacción enzimática, 1 mL del reactivo del ácido 3,5 dinitrosalicílico; caliente por 10 minutos en baño maría a ebullición para desarrollar color. Enfríe y lea cada tubo en el espectrofotómetro a 540 nm empleando el tubo no. 8 como blanco.

1)Anote sus lecturas en la siguiente tabla:

tubo [sustrato] mg/mL

Absorbancia

1 0.5

2 1

3 2

4 3

5 4

6 5

7 7.5

1)Basándose en sus resultados, trace la gráfica correspondiente: actividad contra concentración de sustrato en mg

2)Determine el valor de KM para el sistema almidón/amilasa en estas condiciones. KM = __________ mg de almidón/mL

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA

Durante mucho tiempo se pensó que los catalizadores eran sustancias que actuaban por presencia debido a las concentraciones tan pequeñas necesarias y a que podían recuperarse inalterados al final de la reacción. Sin embargo, se sabe que la velocidad de reacción de acuerdo a la Ley de Acción de Masas depende de su concentración de tal manera que la velocidad es directamente proporcional a la concentración de enzima, lo que se expresa como: V = K[E]

Así que la gráfica que se obtiene al expresar la velocidad de reacción en función de la concentración de enzima es una recta con pendiente positiva.

EXPERIMENTO 4Prepare una serie de 6 tubos siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla:

Reactivo Tubo1 2 3 4 5 6

Sustrato de almidón 8 mg/mL mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5Sol reguladora de fosfatos 0.02M pH = 7 mL 1 1 1 1 1 1



Agua mL 5 4.9 4.8 4.6 4.2 3.4Preincubar a 40°C durante 5 minutos

Sol enzima (amilasa) mL - 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6Después de mezclar el contenido de los tubos, se colocan a baño maría a 40°C por 15 minutos. Pasado este tiempo añada a cada tubo 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico. Se colocan los tubos en baño maría a ebullición por 10 minutos. Enfríe y lea la intensidad del color como densidad óptica en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo no. 1 como blanco.

1)Con sus resultados trace una gráfica con los valores de Absorbancia en las ordenadas y la concentración de enzima expresada en mg/mL en las abscisas, según la siguiente tabla:

Concentración de enzima mg/mL

Absorbancia

00.10.20.40.81.6

2)Interprete la gráfica obtenida.



8. GLÚCIDOS

os glúcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehídicos o cetónicos reales o en potencia de alcoholes polivalentes que poseen en su molécula uno o más carbonos asimétricos. Estos compuestos se encuentran presentes en

todos los seres vivos, en cantidades variables, desempeñando importantes funciones estructurales y energéticas. Debe recordarse que todas las propiedades químicas de los glúcidos dependen de sus grupos funcionales, o sea, grupos alcohol y grupo carbonilo (aldehídico o cetónico).

LLos glúcidos se clasifican, según el número de compuestos hidrocarbonados

simples que los constituyen, en 3 grupos; monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

• Los monosacáridos no se pueden desdoblar por hidrólisis en compuestos más sencillos. A su vez se subdividen, según el número de carbonos que contengan, en: triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, etc.

• Los oligosacáridos, por hidrólisis, dan pocas moléculas de monosacáridos. En la naturaleza existen varios disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa etc.) y unos cuantos trisacáridos, tetrasacáridos y pentasacáridos libres. Se pueden obtener por síntesis química en el laboratorio o por degradación hidrolítica de polisacáridos. Los oligosacáridos poseen propiedades físicas similares a las de los monosacáridos.

• Los polisacáridos, por hidrólisis dan muchas moléculas de monosacáridos. Desde el punto de vista fisiológico se dividen en dos grupos; polisacáridos estructurales y polisacáridos de reserva. Entre los primeros tenemos en vegetales: la celulosa, los ácidos pécticos y las hemi celulosas. En animales los más importantes son los llamados mucopolisacáridos, tales como el ácido hialurónico y el condroitin sulfato, abundantes en varios tejidos y líquidos como el cuerpo vítreo del ojo, el cordón umbilical, el líquido sinovial, tendones, cartílagos, etc.Entre los polisacáridos nutrientes o de reserva los más importantes son, en

vegetales, los almidones e inulina y en animales, el glucógeno.

PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS GLÚCIDOS

Los glúcidos reciben este nombre debido a que la mayor parte de ellos se caracterizan por tener sabor dulce. Sin embargo, esta propiedad la presentan solamente los mono y oligosacáridos, ya que los polisacáridos son generalmente insípidos. Otras propiedades que nos permiten diferenciar glúcidos de bajo peso molecular (monosacáridos y oligosacáridos) de los de elevado peso molecular (polisacáridos), son su solubilidad en agua y su capacidad para cristalizar.

ESTRUCTURA CRISTALINAEXPERIMENTO 1

Examine al microscopio los siguientes glúcidos: glucosa, sacarosa, almidón y celulosa y haga los esquemas respectivos.



1) ¿Cuáles de estos glúcidos tienen estructura cristalina? ¿Por qué?

PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS GLÚCIDOSLas propiedades químicas de los glúcidos dependen de sus grupos funcionales.

Todos los glúcidos poseen en su molécula grupos alcohol y grupos carbonilo, ya sean aldehídicos o cetónicos. Sin embargo, en algunos glúcidos estos grupos pueden estar bloqueados y por lo tanto, su reactividad química estará ausente. Una característica química de los aldehídos y cetonas es su carácter reductor, todos los monosacáridos u oligosacáridos que tengan libre el grupo aldehídico o cetónico serán reductores, mientras que los polisacáridos y oligosacáridos que tengan bloqueados estos grupos serán no reductores.

Todos los glúcidos formados por varios azúcares (oligo o polisacáridos) se pueden hidrolizar por acción enzimática o de ácidos dando como producto final los monosacáridos y liberando los grupos reductores bloqueados. Existen varias reacciones químicas que se utilizan para la identificación de los glúcidos, algunas son generales y otras son específicas para determinar tipo o incluso específicas para cada azúcar. Entre las más utilizadas tenemos:

FORMACIÓN DE OSAZONAS

Esta reacción es una de las de mayor utilidad para la identificación de azúcares por ser específica para cada azúcar. La dan positiva tanto los monosacáridos como los disacáridos reductores sirviendo para identificarlos el tiempo que tardan en formar la osazona correspondiente, la forma cristalina de ellas, la solubilidad en caliente o en frío y los puntos de fusión.

EXPERIMENTO 2• Se colocan en un tubo de ensayo 0.1 g del carbohidrato problema que

corresponda a su equipo, el cual encontrará en su material de la charola o bien será proporcionado por su maestro,

• se agregan 0.2 g de clorhidrato de fenilhidracina, 0.3 g de acetato sódico cristalizado y 4 mL de agua, se agita y se tapa el tubo con un tapón de papel procurando que no quede muy cerrado y

• se coloca en baño maría hirviendo, agitando ocasionalmente y observando el tiempo que tardan en aparecer los precipitados y si lo hacen en frío o en caliente.

La glucosa, fructosa y galactosa precipitan en caliente, pero la maltosa y la lactosa en frío por lo que después de 20 minutos de calentamiento se deben retirar del fuego.

1)Observe al microscopio los cristales de la osazona preparada por usted y las preparadas por sus compañeros de grupo.

2)Haga un esquema de los cristales.3)¿Por qué la glucosa, la manosa y la fructosa dan la misma osazona?4)Escriba la reacción que se efectúa.



REACCIÓN DE MOLISCH – UDRANSKY

Es una reacción general para todos los glúcidos, ya que el ácido sulfúrico concentrado que contiene, hidroliza y deshidrata a los azúcares obteniéndose furfural o hidroximetil furfural como producto final. Estas sustancias son capaces de reaccionar con el alfa naftol formando un compuesto colorido (violeta). Esta prueba es una de las más sensibles, la dan positiva soluciones de glucosa al 0.001%. Sin embargo, la reacción no es específica, ya que la dan positiva los aldehídos, las cetonas, y algunos ácidos orgánicos tales como el fórmico, oxálico, cítrico, etc.

EXPERIMENTO 3Coloque en una gradilla 6 tubos de ensayo, ponga en cada uno 3 mL de cada una de las siguientes soluciones:

Tubo Solución Resultado: color

violeta

Clasificación

1 Formaldehído

2 Glucosa

3 Fructosa

4 Arabinosa

5 Sacarosa

6 Almidón

Añada a todos los tubos, 2 gotas de reactivo de Molisch (solución de alfa – naftol al 5% en alcohol). Mezcle bien.• Posteriormente añada a todos los tubos, 1 mL de ácido sulfúrico concentrado,

estratificando (inclinando el tubo y dejando resbalar el ácido por las paredes).• La reacción es positiva si aparece en la interfase un anillo de color violeta.

1)Diga cual de estas soluciones da positiva la reacción.2)¿Se puede considerar como una reacción útil para diferenciar un glúcido de

otro? ¿Por qué?3)¿Qué utilidad puede tener la reacción de Molisch–Udransky?4)Escriba la reacción que se efectúa.

REACCIÓN DE FEHLINGLa mayor parte de las pruebas para el análisis cualitativo y cuantitativo de

azúcares se basan en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no sea específica de ellos. Se sabe que los azúcares reductores son capaces de reducir diversos iones metálicos como el cobre, bismuto, mercurio, plata, etc. , cuando se encuentran en solución alcalina.



Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los reactivos son estables, existe poca interferencia con otras sustancias, las reacciones son sensibles y puede usarse la misma reacción para un análisis cualitativo o cuantitativo.

EXPERIMENTO 4En 5 tubos de ensayo se colocan 2 mL de la solución A y 2 mL de la solución B del reactivo de Fehling, y a cada tubo se le agregan 3 gotas de cada uno de los siguientes azucares:

Tubo Solución Resultado: Clasificaciónrojo azul reductor no reductor

1 Glucosa2 Fructosa3 Arabinosa4 Sacarosa5 Almidón

• Se colocan los tubos en baño maría a ebullición y se mantienen por 3 minutos, al cabo de los cuales se dejan enfriar (no deben enfriarse con agua fría) y se observan.

El mecanismo de reacción se lleva a cabo debido a que algunos compuestos orgánicos que contienen uno o más grupos alcohólicos en su molécula, en este caso el tartrato de sodio, reaccionan en solución alcalina con los hidróxidos metálicos, formando un complejo soluble, el cual se disocia muy poco, pero los iones que deja en libertad son suficientes para que produzcan las reacciones de coloración. La formación de este complejo es esencial para que se produzca un precipitado con la mayor parte de los metales pesados.

1)¿Qué azucares dan positiva la reacción de Fehling?2)Explique por que algunos azúcares dan negativa la reacción.3)Mencione 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la reacción de

Fehling y no sean azúcares.4)Escriba la reacción que se efectúa.

REACCIÓN DE BARFOED

El reactivo de Barfoed es una solución de acetato cúprico en ácido acético y, una vez más, se determina la capacidad de los azúcares para reducir el ión cúprico a cuproso (Cu2O).

Esta reacción sirve para diferenciar un monosacárido de un disacárido, ya que los primeros a los tres minutos reducen el reactivo y los disacáridos necesitan mas tiempo para que se lleve a cabo la reacción de reducción, mas o menos unos 15 minutos.

EXPERIMENTO 5



Se colocan 4 tubos de ensayo y a cada uno se le agregan 3 mL del reactivo de Barfoed y 1 mL de una de las siguientes soluciones de glúcidos:

Tubo Solución Resultado minutos

Clasificaciónmonosacárido disacárido

1 Glucosa2 Arabinosa3 Lactosa4 Maltosa

• Se colocan en baño maría observando y anotando el tiempo que tarda en aparecer el precipitado rojo de óxido cuproso.

1.) Escriba la reacción que se efectúa.

REACCIÓN DE BIALEsta reacción sirve para diferenciar pentosas de hexosas, este reactivo consiste

en una solución de orcinol (5-metilbenceno-1,3-diol) en ácido clorhídrico (HCl) concentrado con una pequeñísima cantidad de cloruro férrico (FeCl3). El fundamento de esta reacción, igual que la reacción de Molisch, la de Seliwanoff y otras, se basa en la producción de furfural o hidroximetil furfural cuando se calienta con ácidos concentrados y la reacción de estos con otras sustancias dando productos coloridos, en este caso las pentosas dan color azul y las hexosas dan color amarillo o café.

EXPERIMENTO 6En tubos de ensayo se colocan 3 mL del reactivo de Bial ¡PRECAUCIÓN!

Añada 0.2 mL de las siguientes soluciones:

Tubo Solución Resultado ClasificaciónAzul amarillo pentosa hexosa

1 Glucosa2 Arabinosa3 Agua

• Caliente los tubos ligeramente sobre la llama del mechero, hasta que se inicie la ebullición, retire de la flama,

• diluya cada tubo con 10 mL de agua destilada y agregue 2 mL de butanol.• Agite los tubos, deje reposar y haga su observación.

1)Explique las diferencias observadas.

REACCIÓN DE SELIWANOFF



Esta reacción sirve para diferenciar aldosas de cetosas. Las cetosas reaccionan rápidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El reactivo es una solución de resorcinol (Benceno-1,3 diol) 0.05% en HCl 1:3 recién preparado. Este compuesto es el que se condensa con el furfural o sus derivados dando productos coloridos.

EXPERIMENTO 7En 3 tubos de ensayo se coloca 1 mL de los azúcares que se mencionan abajo y

agregue a cada tubo 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff y caliente en baño a ebullición exactamente 60 segundos. Anote sus resultados y continúe calentando observando el cambio de color a intervalos de 1 minuto durante 5 minutos.

Tubo Solución Resultado minutos Clasificación - de 5 + de 5 cetosa Aldosa

1 Glucosa2 Fructosa3 Agua

Las cetosas dan una coloración rojo fuego y las aldosas la dan muy débil y muy lentamente

1)¿Observó alguna diferencia en las soluciones?2)Escriba la reacción que se efectúa.

REACCIÓN DEL LUGOL

El reactivo de lugol es una solución de yodo en yoduro de potasio. Este reactivo reacciona con algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por ser colorido, dando un color diferente según las ramificaciones que presenta la molécula.

EXPERIMENTO 8• En un tubo de ensayo se colocan 2 mL de solución de almidón,• en otro se colocan 2 mL de glucógeno.• Añádales una gota de lugol y anote el color producido en cada uno de los

tubos.• El tubo que contiene el almidón se calienta a ebullición y se deja enfriar

nuevamente observando lo que ocurre con la coloración.

1)¿Por qué el complejo almidón – yodo es termolábil?1)¿Se puede considerar la reacción del Lugol característica para cualquier

polisacárido?



9. OXIDACIONES BIOLÓGICAS

l ser vivo utiliza y transforma la energía del medio ambiente. A estos procesos químicos y físicos se les denominaba respiración. Sin embargo para evitar ambigüedades con el proceso de entrada y salida de aire a y desde los

pulmones, se aplica el concepto bioquímico de bioenergética, incluyendo este termino los procesos fotosintéticos.

ETodos los procesos químicos que constituyen la bioenergética conducen a la

oxidación de sustancias denominadas metabolitos hasta CO2 y H2O. Por regla general todas las reacciones de oxidación son exergónicas, es decir, liberan energía y lo hacen en forma violenta como cuando se quema un pedazo de madera. Sin embargo un organismo viviente debe poseer un mecanismo que le permita capturar y almacenar esta energía liberada de forma gradual y controlada a temperaturas corporales. Una de las maneras en que se aprovecha involucra la participación de enzimas específicas capaces de catalizar la conversión del ADP en ATP (reacción endergónica).

REACCIONES DE OXIDO REDUCCIÓNUn compuesto químico puede oxidarse de diferentes maneras. La oxidación

típica es aquella en la cual el oxígeno se une a un compuesto (oxigenación). Otra forma de oxidación es la pérdida de hidrógeno (deshidrogenación). También se oxida un compuesto cuando pierde electrones o cuando gana valencias positivas.

Ejemplos de oxidacionesOxigenación 2Cu + O2 2CuODeshidrogenación H2S S0 + H2

Pérdida de electrones o ganancia de valencia positiva

-1eFe++ Fe+++

Siempre que se efectúa una oxidación, simultáneamente se efectúa una reducción. Es decir, cuando un compuesto se oxida, otro forzosamente debe reducirse. Como son fenómenos que ocurren simultáneamente se denominan fenómenos de óxido reducción o reacciones REDOX.



OXIDACIÓN POR PÉRDIDA DE ELECTRONES

EXPERIMENTO 1• Coloque en un matraz provisto de tapón con válvula de BUNSEN, 0.5 g de

fibra de hierro (Fe°) y 5 mL de H2SO4 al 10%.• Caliente a ebullición y observe la disolución parcial del Fe.• Deje enfriar y diluya el sulfato ferroso (FeSO4) obtenido, con 50 mL de agua

destilada.La válvula deja escapar el hidrógeno, pero impide la entrada de aire evitando así la oxidación de la sal ferrosa formada mediante la siguiente reacción:

Fe° + H2SO4 FeSO4 + H2 ↑Para comprobar la presencia de sales ferrosas

• Se coloca en una cápsula de porcelana 1 mL de solución de sulfato ferroso y unas gotas de ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]).

• La obtención de una coloración o precipitado de color azul indicará la presencia de sales ferrosas.

• En otra cápsula de porcelana coloque 1 mL de la solución de sulfato ferroso y unas gotas de sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5%.

• La aparición de un color rojo intenso indicará la presencia de sales férricas.A continuación se oxidará la sal ferrosa a sal férrica,

• Para lo cual se colocan en un matraz erlenmeyer 10 mL de la solución de sulfato ferroso y 3 mL de H2SO4 al 10%,

• caliente a ebullición y, en caliente, agregue gota a gota una solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0.1M

• hasta que persista un color rosa pálido.

Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal férrica, repita las reacciones con ferricianuro de potasio K3[Fe(CN)6] al 0.5% y sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5%.

1) Resuma sus resultados (color observado) en la siguiente tabla:

Solución K3[Fe(CN)6] KSCN

Sulfato ferroso

Sulfato férrico

2)Escriba las reacciones de identificación que se han efectuado en cada caso.3)Si el KMnO4 es capaz de oxidar al sulfato ferroso, ¿Qué compuesto se

reduce?.4)Escriba la reacción de oxido – reducción que se ha efectuado.



OXIDACIÓN POR DESHIDROGENACIÓNEXPERIMENTO 2

La acción de una sustancia reductora como el hidrosulfito de sodio (NaHSO3), forma leucobases (incoloras) cuando actúa sobre colorantes oxidados como el azul de metileno (indicador de oxido – reducción). El proceso inverso (oxidación por pérdida de hidrógeno) se puede realizar en diferentes condiciones y determinar el tiempo de reacción.

• Prepare una serie de 5 tubos de ensayo y numérelos.• Añada a cada uno 5 mL de una solución diluida de azul de metileno.• A todos los tubos agrégueles gota a gota una solución recién preparada de

hidrosulfito de sodio• y cuente el número de gotas necesario para decolorar completamente la

solución de azul de metileno.•• El tubo 1 quedará como testigo en reposo, hasta que recupere su color.• El tubo 2 se colocará en baño maría a ebullición, hasta que recupere su

color.• El tubo 3 se agitará enérgicamente a temperatura ambiente, hasta que

recupere su color.• Debe anotarse, de los tubos 1 a 3, el tiempo necesario para recuperar el color

azul• Al tubo número 4 sin agitarlo y a temperatura ambiente, se le agregarán gotas

de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 0.4%.• Y finalmente al tubo número 5 se le agregarán gotas de cloruro férrico (FeCl3)

al 1%• Debe anotarse, de los tubos 4 y 5 el número de gotas necesario para reoxidar al

azul de metileno.

1)Resuma sus resultados en la siguiente tabla

Tubo 1 testigo 2 calor 3 temp. amb. 4 H2O2 5 FeCl3

Tiempo de reoxidación del azul de metileno o número de gotas

2)Escriba la reacción química que se ha efectuado en cada caso.

REACCIONES DE OXIDO – REDUCCIÓN BIOLÓGICAS

La rapidez y la suavidad con que se realizan las oxidaciones biológicas, llevándose a cabo en medio acuoso, a pH generalmente neutro y a bajas temperaturas, son características de procesos catalizados por enzimas.

Warburg fue uno de los primeros investigadores que trató de explicar las oxidaciones biológicas suponiendo una activación del oxígeno. Actualmente se sabe



que en los tejidos existe un sistema de enzimas que contienen hierro, mediante el cual el oxígeno molecular se activa y actúa como un agente oxidante.

Wieland Consideraba que el proceso básico en la oxidación de los metabolitos es la activación del hidrógeno por la acción de enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales transportan el hidrógeno a diferentes aceptores que pueden ser el oxígeno u otros agentes oxidantes.

Szent Györgyi concilió las dos teorías al suponer que es necesaria la activación del hidrógeno y también la del oxígeno.

Keilin supuso que interviene como eslabón intermediario el citocromo.Sin embargo, las oxidaciones biológicas no son tan sencillas, pues se ha

comprobado que en la oxidación de cada metabolito interviene una gran cantidad de aceptores de hidrógeno.

La glucosa es el más común de los metabolitos debido a que es una molécula altamente reducida. Cuando se oxida y pierde sus hidrógenos, la liberación de energía de oxidación no se realiza en forma brusca, sino que intervienen varios transportadores de hidrógeno y se inicia por la acción de una deshidrogenasa específica que no reacciona directamente con el oxígeno sino que requiere de intermediarios como el NAD+, flavoproteínas y citocromos.

DESHIDROGENASA SUCCÍNICA (DHS)La deshidrogenasa succínica cataliza la siguiente reacción:

OBTENCIÓN DE LA FRACCIÓN MITOCONDRIALDEL HÍGADO DE RATÓN

EXPERIMENTO 3Cuando el tejido hepático se dispersa en soluciones isotónicas, el núcleo y las

mitocondrias permanecen relativamente inalterados y pueden separarse con facilidad por centrifugación diferencial.

Al ratón recién sacrificado se le extrae el hígado y se mantiene en hielo hasta el momento de utilizarlo. Pese el hígado obtenido y fracciónelo finamente con las tijeras y prepare cuidadosamente un homogeneizado en un mortero previamente enfriado, añadiendo 6 volúmenes de cloruro de potasio (KCl) 0.15M frío, por cada gramo de hígado.

• Utilizando la centrifuga automática refrigerada, centrifugue el homogeneizado en frío a 500 rpm por 15 minutos

• Separe el sobrenadante y centrifúguelo a 3000 rpm por 15 minutosLaboratorio de Bioquímica Médica 1 55


• Separe este segundo sobrenadante y consérvelo en frío anotando en la etiqueta “SOBRENADANTE DE HÍGADO”.

• El residuo se suspende en 6 mL de KCl 0.15M y se conserva también en frío anotando en la etiqueta correspondiente “SUSPENSIÓN DE HÍGADO”.

Prepare una serie de tubos de ensayo, numérelos y añada los reactivos correspondientes de acuerdo con las instrucciones de la siguiente tabla.

TuboReactivo

1 2 3 4 5 6

Azul de metileno 0.002M ml

0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

Succinato de sodio 0.1M ml

--- 0.5 0.5 --- 0.5 0.5

Malonato de sodio 0.1M ml

--- --- 0.5 --- --- 0.5

Agua destilada ml

1.5 1.0 0.5 1.5 1.0 0.5

Suspensión de hígado ml

0.5 0.5 0.5 --- --- ---

Sobrenadante de hígado ml

--- --- --- 0.5 0.5 0.5

Mezclar bien el contenido de cada tuboVaselina m

l0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Incubar por 30 minutos a 37°C – 40°C

Una vez agregada la vaselina no agitar el contenido de los tubos e incubar en baño maría a 37°C y hacer lecturas en los tiempos señalados, anotando en el siguiente cuadro el grado de coloración, con cruces (de una a tres).

1)Resultados

TuboTiempo

1 2 3 4 5 6

0 min.

10 min.

20 min.

30 min.

2)¿En cual de las fracciones de hígado deben encontrarse las mitocondrias y por qué?

3)Describa como actúa el malonato de sodio en esta reacción.

4)Explique sus resultados sobre la base del análisis del contenido de cada tubo.



LOCALIZACIÓN Y DEMOSTRACIÓN DE LAACTIVIDAD DE LA CITOCROMO - OXIDASA

La citocromo – oxidasa es la última enzima de la cadena respiratoria y es la responsable de la “activación del oxígeno” para oxidar a los citocromos. Tanto los citocromos como la citocromo – oxidasa son metaloproteínas (porfirinas). La citocromo – oxidasa se caracteriza por su elevada sensibilidad al cianuro (CN) y al monóxido de carbono (CO).

En el año de 1885 Ehrlich reportó la reacción del indofenol. Observó que inyectando alfa naftol y dimetil-para-fenilendiamina en animales se formaba en los tejidos una sustancia azul llamada azul de indofenol. La enzima se denominó indofenol-oxidasa, pero posteriormente se ha podido comprobar que esta enzima sólo oxida al citocromo c, el cual a su vez oxida al indofenol; por lo cual ahora se le conoce como citocromo – oxidasa

EXPERIMENTO 4Prepare una serie de 10 tubos de ensayo y numérelos. Añada a cada uno los

reactivos de acuerdo a las instrucciones de la tabla siguiente:

Reactivo Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Alfa naftol al 0.15% en etanol al 10% m

l0.5

--- 0.5

0.5

0.5

0.5

--- 0.5

0.5

0.5

Dimetil-para-fenilendiamina al 0.15% ml

0.5

0.5

--- 0.5

0.5

0.5

0.5

--- 0.5

0.5

Agua destilada ml

1.0

1.5

1.5

2.0

0.5

1.0

1.5

1.5

2.0

0.5

KCN al 0.01% NO PIPETEAR 0.5 mL = 10 gotas

ml

---

--- --- --- 0.5

--- --- --- --- 0.5

Sobrenadante de hígado ml

1.0

1.0

1.0

--- 1.0

--- --- --- --- ---

Suspensión de hígado ml

---

--- --- --- --- 1.0

1.0

1.0

--- 1.0

Agite los tubos ocasionalmente, observe la aparición del azul de indofenol y anote sus resultados en la siguiente tabla:

TuboTiempo min. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

10

20

30

1)Escriba la reacción de formación del azul de indofenol.



2)Explique por qué no se usó vaselina en este experimento.3)Explique sus resultados sobre la base del análisis del contenido de cada tubo



10. LÍPIDOS

ste es un conjunto heterogéneo de moléculas orgánicas cuyas propiedades comunes son su insolubilidad en agua y solubilidad en solventes no polares como el benceno, cloroformo, éter, etc. Por lo que este grupo incluye

sustancias de muy diversa estructura. Suelen ser moléculas de número relativamente alto de átomos de carbono e hidrógeno y bajo en átomos de oxígeno; ciertos lípidos también poseen átomos de fósforo, nitrógeno y azufre en su molécula.

ECualquier clasificación presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede

producir falsas interpretaciones ya que idéntica terminología ha sido empleada por diferentes autores para denominar a distintos grupos de lípidos. Los lípidos más recientemente estudiados, (prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc.), que hasta hace poco se consideraban de poco interés han demostrado tener propiedades especiales como actuar a dosis muy bajas, intervenir en procesos como la coagulación, inflamación tisular, vasodilatacion, dolor, etc.

Las funciones de los lípidos son muy variadas y las más aceptadas actualmente son las siguientes:

1.Función estructural, principalmente en las membranas celulares.2.Actúan como material energético y de reserva.3.Intervienen en el transporte de compuestos energéticamente activos.4.Componentes protectores de la pared celular de ciertas bacterias, plantas,

insectos y vertebrados.5.Sustancias de gran actividad biológica como vitaminas y hormonas. Las

cuales se consideran como verdaderos reguladores metabólicos.6.Actúan como aislante térmico y protección alrededor de determinados

órganos.Para estudiar los lípidos se llevan a cabo diferentes reacciones como:

REACCIÓN DE HANUS

El grado de insaturación de los ácidos grasos que forman parte de un lípido es uno de los factores determinantes de sus propiedades físicas, químicas y fisiológicas. Se ha observado que aparecen más dobles enlaces en los triacilgliceroles de almacenamiento y en los lípidos estructurales cuando la temperatura ambiente disminuye.

Los dobles enlaces disminuyen el punto de fusión por lo que se cree que sea un mecanismo del organismo para impedir la cristalización de los lípidos en los tejidos. El reactivo de Hanus es una solución de yodo y bromo que nos permite determinar el grado de insaturación de un lípido midiendo la capacidad que tiene para fijar halógenos en su molécula.EXPERIMENTO 1

• Coloque en tubos de ensayo limpios y secos 6 mL de soluciones clorofórmicas al 10% de aceite de algodón, aceite de cártamo y monoestearilglicerol. Añada a cada tubo 5 gotas del reactivo de Hanus y agite vigorosamente.



• Anote cada 30 minutos el grado de decoloración de cada tubo protegiéndolo de la luz.

Anote sus resultados (por medio de cruces de XXX a X o cero) en la tabla:

Lípido Tiempo minutos30 60 90 120

Aceite de algodónAceite de CártamoMonoestearilglicerolAceite de ricino

EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS DE CEREBRO

EXPERIMENTO 2 • Pese 5 g de cerebro y tritúrelos perfectamente en un mortero con 20 mL de

una mezcla 200:100:1 de cloroformo - metanol – ácido clorhídrico por 10 minutos.

• Una vez obtenido el homogeneizado agregue 2 mL de HCl 1N, mezcle y centrifugue a 2000 rpm por 10 minutos.

• Separe el paquete celular, la fase clorofórmica y la metanólica. Deseche el sedimento.

Se obtienen dos fases:• Metanólica, situada en la parte superior del centrifugado, de color

transparente, que servirá para la identificación de cerebrósidos.• Clorofórmica, ubicada en la parte inferior, de color pardo rojizo que se usará

para la identificación del colesterol, la separación cromatográfica de fosfolípidos y la formación de membranas.

• PM del metanol (CH3OH) = 32, del cloroformo (CHCl3)=119.4

IDENTIFICACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS DE CEREBROPOR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Como una aplicación del fenómeno de adsorción, se desarrollará la técnica de cromatografía en placa fina para separar los diferentes fosfolípidos extraídos del cerebro.EXPERIMENTO 3

• Diluya 1:1 con cloroformo (CHCl3), un volumen pequeño (0.5 o 1 ml) del extracto clorofórmico obtenido en el experimento no. 2.

• Utilizando una pipeta Pasteur aplique una gota de esta dilución en tres puntos equidistantes en una cromatoplaca previamente preparada, aproximadamente a 2 cm de altura de la base.

• Permita que el cloroformo se evapore y entonces introduzca la placa en una cubeta de vidrio que contenga como solvente de elución, una mezcla de cloroformo – metanol – ácido acético – agua (65:25:8:4).

• Deje desarrollar el cromatograma hasta el frente del solvente ya marcado; saque la placa de la cubeta y déjela secar.



En esta forma se tendrán 3 cromatogramas idénticos en la misma placa, los cuales se van a revelar con diferentes reactivos. Esto se puede hacer cubriendo con una placa de vidrio los cromatogramas que no se deseen revelar.

El cromatograma se revelará por separado con Yodo y con ninhidrina que pondrá de manifiesto a los fosfo aminolípidos. Esta reacccion se lleva a cabo al calentarse a 100°C por 10 minutos.

REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOSIDENTIFICACIÓN DE CEREBRÓSIDOS

EXPERIMENTO 4Utilizando 1 mL del extracto metanólico obtenido en la extracción de lípidos

de cerebro, trate de demostrar la presencia de cerebrósidos utilizando la reacción de Molisch–Udransky cuya técnica y fundamento ya han sido descritos anteriormente.

REACCIÓN DE LA ACROLEÍNA

Una de las reacciones más usadas para la identificación de acilglicéridos es la formación de acroleína o aldehído acrílico, el cual se puede obtener por deshidratación del glicerol o de cualquier glicérido y se reconoce fácilmente por su fuerte olor acre característico.

EXPERIMENTO 5• Coloque en dos tubos de ensayo secos, un poco de bisulfato de potasio

(KHSO4)• y añada de 3 a 5 gotas de glicerina en uno de los tubos• y en el otro 5 gotas de aceite de algodón, cártamo o girasol.• Caliente cuidadosamente y huela los vapores indirectamente. ¡PRECAUCIÓN!

1)¿Se puede considerar esta reacción general para cualquier lípido? ¿Por qué?2)Escriba la reacción que se ha efectuado.

REACCIÓN DE LIEBERMANN – BURCHARDS

El anhídrido acético se puede condensar con los grupos –OH en posición 3 de los esteroles como en el colesterol y dar los correspondientes ésteres. Si el esterol tiene un doble enlace en posición 5, se produce además una epimerización y una deshidratación en presencia de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, dando como resultado una serie de compuestos de estructura desconocida que se caracterizan por tener colores que van del rojo al azul y del azul al verde. Esta reacción es por lo tanto específica para todos los esteroles que contengan un OH en posición 3 y un doble enlace en posición 5.

EXPERIMENTO 6Prepare 2 tubos de ensayo.Laboratorio de Bioquímica Médica 1 61


• En el tubo no. 1 coloque 3 mL de solución clorofórmica de colesterol puro• y en el tubo no. 2, coloque 3 mL de solución clorofórmica de colesterol obtenido

en la extracción de lípidos de cerebro en el experimento 2.• Añada a los 2 tubos, 1 mL de anhídrido acético y mezcle bien, finalmente

añada lentamente, resbalándolo por las paredes del tubo, 1 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado.

1)Observe y describa los cambios de coloración que se producen.

PERMEABILIDAD DE LA BICAPA LIPÍDICAEn este capítulo de lípidos no podemos dejar de mencionar a las membranas ya

que hacen posible la existencia de organismos complejos porque separan las células en el interior de los tejidos y los organelos celulares dentro de las células, formando compartimientos con propiedades fisicoquímicas diferentes, lo que permite una diferente organización; y cada compartimiento se vuelve una parte individual de un conjunto más complejo. Se ha comprobado que las membranas son complejos lipoprotéicos que contienen de 60% a 75% de proteína y de 25% a 40% de lípidos.

En este experimento usaremos monocapas lipídicas como modelos de membrana. Al estratificar butanol sobre agua y agregar un lípido, éste se situará en la interfase, orientandose la parte polar lipídica a la fase acuosa, y la parte hidrofóbica a la fase orgánica. Si ahora se coloca un colorante se puede observar la difusión pasiva a través de la membrana.

EXPERIMENTO 7Preparar 4 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla colocando las

soluciones con mucho cuidado resbalando por las paredes del tubo para estratificar.

Reactivo TUBO1 2 3 4

Agua destilada ml 5 5 5 5 Azul de metileno mas monoestearato de glicerilo en butanol ml 2 --

----

---

Azul de metileno mas fosfolípidos en butanol * ml ---

2 ---

---

Azul de metileno mas colesterol en butanol ml ---

---

2 ---

Azul de metileno en butanol ml ---

---

---

2

* 2 mL del extracto clorofórmico obtenido en el experimento 2 se evaporan a sequedad (cuidando que no se queme), al residuo se le re disuelve con 2 mL de azul de metileno en butanol y se agrega este contenido al tubo no. 2 de la serie.Deje los tubos en reposo procurando moverlos lo menos posible y haga

observaciones a las 2, 4, y 24 horas.1)¿Observó el paso del colorante en todos los tubos?2)Explique a qué se debe esa diferencia.



11. ÁCIDOS NUCLÉICOS

l control estricto y coordinado de todos los procesos vitales depende de proteínas específicas, fundamentalmente enzimas. Estas dirigen la bioenergética, el transporte a través de membranas, la formación de nuevas

células, la diferenciación celular y la creación de nuevos seres. Sin embargo, las moléculas que poseen la información necesaria para la biosíntesis de proteínas son los ácidos nucléicos: ribonucléico (RNA) y desoxirribonucléico (DNA) Además, algunos RNA pueden funcionar como catalizadores.

EEn 1871 Friedrich Miescher logró aislar del núcleo celular una sustancia que

llamó nucleína, la cual debido a su carácter ácido se denominó posteriormente ácido nucléico. El DNA se encuentra en el núcleo y sin abandonarlo, puede transmitir su información por medio del ácido ribonucléico mensajero (RNAm) hasta el ribosoma, constituido por el ácido ribonucléico ribosomal (RNAr), al cual es transportado el material para la síntesis de proteínas por medio del ácido ribonucléico de transferencia (RNAt). RNAm tiene un peso molecular de 300,000. El RNAr

constituye el ribosoma y su peso molecular es de 2,000,000. El RNAt tiene un peso molecular de 25,000 a 30,000, mientras que el DNA es una de las biomoléculas más grandes que se conocen hasta ahora y su peso molecular va de 1,000,000 a 1,000,000,000 (uno a mil millones).

Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con proteínas fuertemente básicas (histonas o protaminas) formando las llamadas nucleoproteínas.

• Los ácidos nucléicos están constituidos por bases púricas, bases pirimídicas, pentosa y ácido fosfórico.

• El DNA tiene como bases púricas adenina y guanina, como bases pirimídicas, citosina y timina, como pentosa la 2-desoxirribosa y ácido fosfórico H3PO4.

• Los ácidos ribonucléicos tienen como bases púricas: adenina y guanina y como bases pirimídicas: citosina y uracilo, como pentosa la D – ribosa y H3PO4.

Los ácidos nucléicos son macromoléculas formadas por la unión de varios nucleótidos. Un nucleótido se puede considerar como un éster fosfórico de un nucleósido, que es la unión de una base púrica o pirimídica con una pentosa. Los mononucleótidos se unen entre sí por medio de un enlace fosfodiester 3’- 5’, formando los polinucleótidos.

OBTENCIÓN DEL DNA DE BAZO

Cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las células o tejidos que se van a utilizar como materia prima. En el caso del DNA esta selección es en especial importante porque el contenido de DNA es pequeño en la mayor parte de las células. La célula ideal será aquella que tenga una relación núcleo/citoplasma



alta, como en los linfocitos y células del tumor ascítico de Ehrlich. Sin embargo, no es fácil obtener este tipo de células por lo que frecuentemente se usan órganos típicamente linfoides como el timo y el bazo.

El primer paso en la extracción del DNA es la homogeneización del tejido. Este paso puede degradar en parte la molécula del DNA si no se toman las precauciones necesarias, la solución reguladora es de citrato 0.01M y NaCl 0.14M, a pH de 7.2 a 7.4; la fuerza iónica de esta solución hace insoluble a la desoxirribonucleoproteína. Si se centrifuga este homogeneizado, en el residuo quedarán los restos celulares y las desoxirribonucleoproteínas insolubles. En el sobrenadante se encuentran compuestos solubles como la mayor parte de los ácidos ribonucléicos.

Al homogeneizar el tejido se liberan las enzimas de los lisosomas, entre ellas la DNAasa, la cual hidroliza el DNA. Se sabe que el Mg++ es indispensable para la actividad de esta enzima; si en la solución existe citrato, éste se une al Mg++ e impide la acción de la DNAasa. Otra forma de evitar la acción hidrolítica de la enzima es trabajar a temperaturas bajas (0°C a 2°C).

El siguiente paso en la purificación está basado en que las desoxirribonucleoproteínas y el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, mientras que la mayor parte de las proteínas precipitan en estas condiciones. Si el residuo se suspende en solución de NaCl 2.6M y se centrifuga, el residuo insoluble estará formado fundamentalmente por proteínas, mientras que el DNA permanecerá en solución. Este DNA se puede precipitar selectivamente por la adición selectiva de 2 volúmenes de alcohol etílico al 95% formándose un precipitado blanco fibroso, el cual se puede recoger por rotación de un agitador de vidrio con pequeños salientes.

EXPERIMENTO 1 • La muestra de bazo se coloca en un mortero, previamente enfriado y se

secciona lo más finamente posible con una tijera. Se colocan 450 mL de la solución reguladora de citrato 0.01M – NaCl 0.14M, a pH de 7.2 fría, en una licuadora cuyo vaso haya sido previamente enfriado.

• Se hace funcionar la licuadora a baja velocidad y se van añadiendo los trozos de bazo de todos los equipos,

• esperando a que se homogeneice completamente el primero antes de añadir el segundo y así sucesivamente.

• Una vez terminada la adición, continúe homogeneizando por 30 – 60 segundos más.

• Utilizando la centrifuga automática refrigerada, se coloca el homogeneizado en tubos de centrífuga apropiados teniendo cuidado de tarar perfectamente los tubos opuestos. ¡PRECAUCIÓN! (CONSULTE A SU MAESTRO).

• Se centrifuga por 15 minutos a 5 000 rpm. El sobrenadante se desecha.• El residuo insoluble se lava en el mismo tubo con 15 mL de citrato 0.01M –

NaCl 0.14M, pH 7.2, agitando hasta volver a resuspender con ayuda de una varilla de vidrio, si es necesario.



• Se vuelve a centrifugar a 5 000 rpm por 5 minutos y el sobrenadante se desecha.

• Al residuo insoluble que contiene el DNA y residuos celulares se le añaden 15 mL de NaCl 2.6M frío y se homogeneiza por agitación.

• El ácido desoxirribonucléico es soluble en esta solución mientras que la mayor parte de las proteínas son insolubles.

• Centrifugue a 8 000 rpm por 30 minutos. El líquido sobrenadante contiene el DNA en solución y el sedimento, que contiene restos celulares y proteínas insolubles, se desecha.

• La solución salina sobrenadante se coloca en un vaso de precipitados y se añaden lentamente dos volúmenes de alcohol etílico al 95%, procurando que la fase alcohólica quede en la parte superior.

• Se deberá observar la formación de un precipitado blanco, denso, en la interfase. Utilizando un agitador con pequeños salientes, agite esta mezcla lentamente procurando enrollar sobre el agitador las fibras del DNA precipitadas.

1)Explique por qué se utilizó bazo como materia prima y no otro órgano cualquiera.

2)¿Sería conveniente utilizar solución reguladora de fosfatos para la extracción del DNA? ¿Por qué?

3)¿Por qué es conveniente trabajar durante toda la extracción a baja temperatura?

CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL DNA

Existen varios métodos para identificar y cuantificar a los ácidos nucléicos. El método más utilizado es el espectrofotométrico, el cual está basado en que tanto el DNA como el RNA absorben a 260 nm. La absorbancia es proporcional a la concentración del ácido, por lo tanto, el medir la absorbancia es un método cuantitativo muy sensible y sencillo, pero no distingue entre DNA y RNA. Es de gran utilidad cuando las muestras están puras.

Una reacción muy utilizada para identificar y cuantificar DNA es la llamada reacción de Dische, la cual está basada en que el reactivo de difenilamina reacciona específicamente con el DNA dando una coloración azul cuya intensidad es proporcional a la concentración de DNA. En realidad, la especificidad de esta reacción no es absoluta, ya que la difenilamina es un reactivo específico para las 2-desoxipentosas en general, pero en condiciones normales la cantidad de azúcares capaces de interferir es despreciable.

EXPERIMENTO 2Prepare una serie de 6 tubos de ensayo y numérelos del 1 al 6.

• Mida con una pipeta cuidadosamente 2 mL de solución patrón. Esta solución tiene una concentración de DNA de 1 mg/mL. Colóquela en el tubo no.1.

• Añada a los tubos 2, 3, 4 y 5, 2 mL de agua destilada.• Agregue al tubo no.2, 2 mL de la solución patrón; mezcle perfectamente,



• transfiera 2 mL de esta mezcla al tubo no. 3; se mezcla el contenido• y se transfieren 2 mL al tubo no. 4. De este tubo se toman 2 mL y se

descartan.• El tubo no. 5 será el blanco• y en el tubo 6 se colocan 2 mL de la solución de DNA problema. • Añada a todos los tubos 4 mL de reactivo de Dische y agite vigorosamente• coloque los tubos en baño maría a ebullición por 10 minutos.• Inmediatamente después coloque los tubos en baño maría de hielo – agua

durante 5 minutos con objeto de enfriar su contenido rápidamente.

Los tubos con DNA desarrollan una coloración azul característica con un máximo de absorción a 600 nm. La intensidad de la coloración se puede determinar cuantitativamente en el espectrofotómetro. Determine la densidad óptica a 600 nm de todos los tubos utilizando el tubo no. 5 como blanco.

Resuma sus resultados en la siguiente tabla:

Tubo [DNA] mg/mL

Densidad Óptica

1 12 0.53 0.254 0.1255 06 Problema

1)Con los datos de la tabla construya la curva tipo (absorbancia contra mg de

DNA)2)Interpolando la absorbancia del tubo no. 6 encuentre la concentración de DNA

(mg/mL) y calcule la cantidad total de DNA en su problema.

CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL RNA

El RNA puede ser cuantificado por espectrofotometría, como ya se explicó. Sin embargo, la reacción más utilizada para identificar y cuantificar el RNA es la reacción del orcinol, (5-metilbenceno-1,2 diol), la cual se caracteriza por dar una coloración verde en presencia de cualquier RNA. La reacción del orcinol es una modificación de la reacción de Bial para pentosas y es, por tanto, poco específica. Sin embargo, cuando se trata de muestras razonablemente puras, esta reacción puede ser utilizada incluso para análisis cuantitativos.

EXPERIMENTO 3Prepare una serie de seis tubos y numérelos del 1 al 6.

• Añada a los tubos 2, 3, 4 y 5, 3 mL de agua destilada,• al tubo no.1, 3 mL de la solución patrón de RNA que contendrá 0.300 mg/

mL.• Añada 3 mL de la misma solución patrón al tubo no. 2, mezcle bien el contenido• transfiera 3 mL de esta solución al tubo no. 3, mezcle el contenido



• y añada 3 mL de esta solución al tubo no. 4, mezcle bien el contenido y tome 3 mL de esta solución y deséchelos.

• El tubo no. 5 será considerado como blanco• y al tubo no. 6 se le añaden 3 mL de solución problema.• Añada a todos los tubos 6 mL del reactivo de orcinol ácido y 0.4 mL del

reactivo de orcinol – alcohol.• Se mezcla el contenido y se colocan en baño maría a ebullición por 20 minutos.• Una vez fríos se lee la densidad óptica de cada tubo a 660 nm.

Anote sus resultados en la siguiente tabla:

Tubo [RNA] mg/mL

Densidad Óptica

1 0.32 0.153 0.0754 0.03755 06 Problema

1)Con los datos de la tabla anterior trace la curva tipo, absorbancia contra mg de RNA.

2)Interpole los valores de absorbancia de su problema y determine la concentración real en mg/mL.

DETERMINACIÓN DEL FOSFATO TOTALEXPERIMENTO 4

Para efectuar la determinación colorimétrica con el molibdato de amonio se empleará una muestra que ha sido previamente digerida.Prepare una serie de seis tubos como se indica en la siguiente tabla:

ReactivoTubo

1 2 3 4 5 6Buffer de acetato 0.1M pH 4.0 mL 7 7 7 7 7 7Reactivo molibdato al 2.5% mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5Solución de vitamina C al 1% reciente mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5Agua destilada mL 2

Solución tipo 1 µM/mL 2Solución tipo 2.5 µM/mL 2

Solución tipo 5 µM/mL 2Problema DNA 2

Problema RNA 2Deje los tubos en reposo a temperatura ambiente por 30 minutos y lea la

absorbancia a 660 nm tomando como blanco el tubo no. 1.

1)Con los datos obtenidos con las soluciones tipo, construya la curva tipo para fosfato. (Densidad óptica contra concentración en mol/mL)

2)¿Cómo afecta el medio ácido al enlace 3’-5´diéster fosfato?¿Cómo afecta el medio alcalino al enlace 3’-5´diéster fosfato?


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