MANUAL DE ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ENDOFTICOS Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - USP 1. Tcnicas de Purificao de Microorganismos 1.1 Purificao por diluio Esta metodologia mais indicada para a purificao de colnias fngicas com esporos. Consiste em obter uma suspenso em Tween 80 (item 5.4) de esporos de cada colnia, os quais so desagregados por agitao em vortex por 2 minutos. A concentrao de esporos na suspenso pode ser estimada por meio da contagem de esporos em cmara de Neubauer. A suspenso deve ser diluda e concentraes apropriadas devem ser semeadas em meio de cultura apropriada (item 4). Nessas placas, frequente a observao de dois ou mais tipos morfolgicos de colnias, os quais podem representar duas ou mais espcies de microrganismo presentes na amostra original. Este processo deve ser repetido pelo menos mais duas vezes com cada tipo morfolgico observado. 1.2 Purificao por estria de esgotamento Esta tcnica pode ser utilizada para purificao de colnias fngicas ou bacterianas, embora seja mais indicada para bactrias. A tcnica consiste em fazer estrias em meio slido, onde por esgotamento se obtm colnias isoladas no final das estrias (Figura 1). Aps cada passagem da ala pelas estrias bacterianas, e obteno de novas estrias, deve-se aquecer a ala para que o excesso de clulas seja eliminado, antes da fase seguinte. As placas contendo as estrias devem ser incubadas para se observar o crescimento bacteriano. Aps a obteno de colnias isoladas, deve-se repetir o processo por pelo menos mais 3 vezes, at se ter certeza da pureza das colnias.

Figura 1. Purificao de bactrias por meio de estria e obteno de colnia isolada. A esquema da coleta do material e realizao das estrias (Brock & Madigan, 1991). B

e C- colnias isoladas de actinomiceto e levedura, respectivamente obtidas por meio de estria de esgotamento. 2. Tcnica de Armazenamento de Microrganismos 2.1 Armazenamento por at 1 ms

Repicar o microrganismo em placas de Petri, contendo meio especfico. Cultivar na temperatura e perodo adequado para cada espcie, vedar a placa com folha plstica (filme de PVC, parafilm). Manter no refrigerador a 4C. Esta tcnica indicada para fungos e bactrias. 2.2 Armazenamento por at 1 ano

Repicar o microrganismo em microtubos hermeticamente fechados ou em frascos (tampados com rolha de borracha) contendo 2/3 do volume com meio de cultura. Deve-se evitar o ressecamento do meio. Manter no refrigerador a 4C. Esta tcnica indicada para fungos e bactrias. Da mesma maneira, podem ser usados tubos de ensaio com meio de cultura slido inclinado e vedados com rolhas ou folha plstica (filme de PVC, parafilm). 2.3 Armazenamento de 1 a 4 anos leo Mineral Adicionar leo mineral sobre os microrganismos cultivados sobre meio slido inclinado (item 2.2), descritos anteriormente e mant-los a temperatura ambiente. Esta tcnica indicada para fungos e bactrias. Mtodo de Castelani Nesta metodologia, o microrganismo deve ser cultivado em meio slido e posteriormente, fragmentos do meio de cultura contendo pedaos da colnia devem ser retirados e colocados em frascos contendo gua esterilizada. Manter em temperatura ambiente. Esta tcnica indicada para fungos. Congelamento

As culturas tambm podem ser armazenadas por perodos mais longos em congeladores (freezers) -80 C. Os isolados devem ser cultivados em meio lquido, suplemento com um crioprotetor e amostras devem ser distribudas em tubos criognicos, a fim de evitar que, durante o congelamento, ocorra danos estrutura das clulas e consequente comprometimento da viabilidade das mesmas. Para crioproteo, a cultura microbiana deve ser suplementada com 7-8% de dimetilsulfxido (DMSO) ou 15-25% de glicerol antes do congelamento a -80 C. Para o armazenamento a -20 C, devem ser utilizadas concentraes de 40-50% de glicerol. Esta metodologia indicada principalmente para bactrias. 2.4 Armazenamento por 1 a mais de 4 anos

Liofilizao As clulas microbianas so liofilizadas, mantendo a viabilidade por longos perodos. Manter no refrigerador a 4 C. Esta tcnica indicada para fungos e bactrias. Slica Faz-se uma suspenso de esporos em uma soluo de leite (5%). 100l da suspenso so adicionados a um tubo (2mL) mantida a 0 C (no gelo) contendo slica previamente esterilizada. Manter no refrigerador a 4 C ou temperatura ambiente. Esta tcnica indicada para fungos e bactrias esporuladas. 3. Identificao de Microrganismos Endofticos 3.1 Identificao de Bactrias 3.1.1 Caracterizao Morfolgica Determinao da forma da clula Deve ser preparado um fino esfregao de clulas jovens das culturas bacterianas em lmina de microscpio, secando levemente, na chama para fixao. Em seguida o esfregao tratado como a seguir: a) Corar com safranina (item 5.2.) por 1 min. b) Lavar cuidadosamente com gua e secar com papel absorvente.

c) Observar ao microscpio ptico (aumento de 1000X). Nesta anlise possvel obter dados sobre a forma das clulas (cocos ou bastonetes), bem como outras estruturas com filamentos ou arranjos em cachos. Colorao de Gram Deve ser preparado um fino esfregao de clulas jovens das culturas bacterianas em lmina de microscpio, secando levemente na chama para fixao. Em seguida o esfregao tratado como a seguir: a) Corar com cristal vileta (item 5.2) por 1 min. b) Lavar cuidadosamente com soluo de lugol forte (item 5.2). c) Cobrir com lugol forte por 1 min. d) Lavar com soluo descorante (item 5.2) por 1 min. E posteriormente com gua. e) Corar com safranina (item 5.2) por 1 min. f) Lavar cuidadosamente com gua e secar com papel absorvente. g) Observar ao microscpio ptico (aumento de 1000X). As clulas das bactrias Gram-positivas mantm a colorao violeta devido reteno dos corantes iniciais, enquanto as bactrias Gram-negativas apresentam colorao rosaavermelhado, devido colorao de contraste com safranina. Clulas velhas podem resultar em falso Gram-negativo. Colorao de Wirtz (colorao de esporos) Deve ser preparado um fino esfregao de clulas jovens das culturas bacterianas em lminas de microscpio, secado levemente na chama para fixao. Em seguida o esfregao tratado como a seguir: a) Corar com verde malaquita (item 5.2). por 15 min. b) Lavar cuidadosamente com gua corrente. c) Corar com safranina (item 5.2) por 30 seg. d) Lavar cuidadosamente com gua e secar com papel absorvente. e) Observar ao microscpio ptico (aumento de 1000X). Os esporos apresentam colorao verde enquanto que as clulas vegetativas apresentam colorao rosaavermelhada, devido a colorao de contraste com safranina. 3.1.2 Identificao Bioqumica

EPM (cido e gs de glicose, urase, H2S, L-triptofano desaminase) Com auxlio de uma ala de ponta reta (agulha), as bactrias devem ser inoculadas por meio de picada profunda no meio EPM (item 4.2) e incubadas por meio de picada profunda no meio EPM (item 4.2) e incubadas a 28C por 24 horas. A formao de bolhas indica a produo de gs a partir da glicose, a passagem da cor do meio de verde para amarelo, na base do tubo, indica que houve produo de cido a partir da glicose, porm, quando houver produo de H2S neste mesmo local ocorre a formao e pigmentos pretos. A colorao verde escura na superfcie do meio indica a produo de L-triptofano desaminase e a produo de urase verificada quando a cor do meio passa de verde para azul. MILI (motilidade, indol lisina) As culturas bacterianas devem ser inoculadas com o auxlio de um ala de ponta reta no interior do tubo contendo o meio MILI, e incubadas a 28 C por 24 horas. Aps o crescimento bacteriano, realizar a leitura do teste: a presena de zonas trbida ao redor da picada indica motilidade positiva, quando a cor do meio passa de roxo-violeta para amarelo indica lisina descarboxilase negativa, enquanto que a produo de indol a partir de triptofano verificada colocando 3-5 gotas do reagente de Kovacs (item 5.2). Neste caso, o teste considerado positivo quando ocorre a formao de um anel vermelho (anel indlico). Utilizao de citrato A bactria deve ser inoculada por meio de estrias na superfcie do meio citrato de Simmmons e incubar a 28 C. O crescimento bacteriano e a alterao da colorao do meio devem ser examinados diariamente durante 7 dias. O resultado positivo caracterizado pela passagem da cor do meio de verde para azul. Utilizao de Diferentes Fontes de Carbono No momento do uso deve ser adicionada a fonte de carbono (D-glicose, D-frutose, Dgalactose, D-manose, L-arabinose, D-xilose, L-ramnose, celobiose, D-lactose, Dmelibiose, sacarose, Trealose, rafinose, D-melizitose, dextrana, inulina, D-manitol, mesoinositol, Adonitol, xilitol e salicina soluo estoque esterilizada 20% em gua) numa concentrao final de 1% ao meio bsico para acares e 5,0 mL deste meio devem ser

distribudos em tubos esterilizados. Aps a inoculao da bactria de interesse, os tubos devem ser incubados a 28 C por 7 dias. O resultado positivo caracterizado pela passagem da cor do meio de verde para amarela devido a acidificao do meio e queda do pH. Teste de Oxidao e Fermentao da Glicose (0/F glicose) A bactria de interesse deve ser inoculada com picada profunda em dois tubos contendo o meio para teste de O/F (item 4.2). Sobre a superfcie de um dos tubos devem ser colocados 3,0 mL de leo mineral esterilizado e ambos os tubos devem ser incubados a 28 C por 72 horas. A mudana da cor do meio de verde para amarela nos dois tubos indica a fermentao da glicose (F), mas se esta alterao ocorrer apenas na superfcie do tubo sem leo indica oxidao da glicose (O). Entretanto, se houve crescimento bacteriano e o meio passou de verde para azul, no ocorreu utilizao da glicose, mas houve elevao do pH devido a produtos do metabolismo proteico. Hidrlise do Amido Inocular isolados bacterianos em placas de Petri contendo o meio de amido (item 4.3) e incubar a 28 C por 48 horas. Aps o crescimento as colnias so cobertas com soluo de lugol (item 5.2). O resultado positivo caracterizado por um halo incolor ao redor da colnia bacteriana. Hidrlise da Gelatina O meio de gelatina (item 4.2) deve ser deixado a 4 C durante 2 horas para solidificar. O inoculo realizado por picada profunda com auxlio de um fio de platina ou nquelcromo. Incubado a 28 C durante 30 dias. Para observaes dirias, os tubos inoculados juntamente com um tubo controle (sem inculo) devem ser colocados a 4 C por 1 hora antes de anlise. A manuteno do estado lquido do meio aps esta inoculao a 4 C indica a hidrlise da gelatina. Crescimento em Diferentes Temperaturas As bactrias devem ser inoculadas em meio NA (item 4.1) ou outro de crescimento especfico. Incubar em diferentes temperaturas (4, 10, 20, 28, 32, 37, 45 e 55 C) durante 7 dias para verificar o crescimento.

Crescimento em NaCl 5% Para este teste deve ser utilizado o meio NA (item 4.1) ou outro de melhor taxa de crescimento acrescido de NaCl na concentrao de 5%. Inocular e incubar a 28 C por 72 h para se observar o crescimento bacteriano. Crescimento em Diferentes pHs Para esta anlise pode ser utilizado o meio LB (item 4.1) ou outro similar. O pH do meio deve ser ajustado ao nvel desejado. Aps a inoculao da bactria de interesse, o tubo deve ser incubado 28 C por 72 horas para verificao do crescimento bacteriano. Catalase Com auxlio de um palito de madeira, cortar uma amostra de colnia bacteriana, e colocar sobre uma gota de H2O2 (3%). O resultado positivo caracterizado pelo desprendimento de gs imediatamente ou aps, no mximo, cinco minutos. Oxidase Sobre um papel de filtro impregnado com 2-3 gotas de dimetil--fenilenediamina (1%), colocar amostras de colnia bacteriana. O resultado positivo dado pelo aparecimento de colorao violeta sobre o papel aps at 10 segundos. Produo de Indol Transferir bactrias para meio de determinao da produo de indol (item 4.2) e incubar a 28 C por 48 horas. Aps o crescimento, adicionar 4 gotas do reagente de Kovacs (item 5.2). A formao de um halo vermelho na fase alcolica indica a presena de indol. Reduo de Nitrato a Nitrito Inocular bactrias em meio com nitrato (item 4.2) e incubar a 28 C por 48 horas. Aps o crescimento adicionar 2 gotas da soluo A e 2 gotas da soluo B dos reagentes para o teste de nitrato (item 5.2). O resultado positivo caracterizado pelo aparecimento de uma colorao vermelha intensa na superfcie do meio. Reao de Voges-Proskauer Com auxlio de uma ala de platina, inocular as bactrias em tubos contendo o meio VP (item 4.2) e incubar a 28 C por 72 horas. A leitura da reao realizada alcalinizando o

meio com 2-3 gotas de KOH (40%). Posteriormente adicionar 3-5 gotas de soluo de naftol (item 5.2). O teste positivo caracterizado pela presena de halo vermelho, alguns segundos aps a adio do reagente. Este halo formado a partir da superfcie de contato com o O2 devido a oxidao da acetona. 3.2 Identificao de Fungos Observao de estruturas fngicas Os isolados fngicos devem ser cultivados em diferentes meios de cultura. (item 5.4). Fragmentos das colnias fngicas so coradas em lactofenol-azul algodo (item 5.2) e analisados em microscpio ptico para observao das hifas (grampos de conexes, septao). As estruturas observadas devem ser comparadas com as estruturas descritas na literatura (Arx, 1974; Barnett & Hunter, 1972; Hanlin & Menezes (1996). 4. Meios de Cultura Utilizados para o Estudo de Microrganismos 4.1 Meios de cultura para isolamento de bactrias Meio TSA (Tryptone Soya gar) 10% Triptona Peptona de soja NaCl Agar gua destilada completar volume para pH 1,5 g 0,5 g 1,5 g 15,0 g 1000 mL 7,3

Alternativamente pode ser utilizado o meio TSA pronto (Merck, Difco Oxoid) na concentrao de 4 g/L (10 %), associado de 1,5% de gar. Meio TSB (Tryptone Soya Broth) 5 % Casena digerida panceica Soja digerida papanica NaCl Na2HPO4 0,15 g 0,25 g 0,125 g 0,85 g

Glicose Agar gua destilada completar volume para pH

0,125 g 15, 0 1000 mL 7,3

Alternativamente pode ser utilizado o meio TSB pronto (Merck, Difco ou OXOID) na concentrao de 1,5 g/L (5 %), acrescido de 1,5% de gar. Meio LB Luria Bertani Triptona Extrato de levedura NaCl gar bacteriolgico (Difco) gua destilada completar volume para pH 10,0 g 5,0 g 10,0 g 15,0 g 1000 mL 7,0

Meio PW Periwinkle Wit Agar Davis et al. (1981) Peptona de soja Triptona K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7 H2O Hemina clorada (0,1 %) Vermelho de fenol (0,2 %) gua destilada pH 4,0 g 1,0 g 1,2 g 1,0 g 0,4 g 10 mL 10 mL 820 mL 6,8

Aps a autoclavagem e com o meio resfriado (45C), adicionar: L-Glutamina (4 %) Soro Albumina Bovina V (BSA) (10 %) 100 mL 60 mL

Antes de serem adicionados ao restante do meio, as solues de Glutamina e BSA so esterilizados por filtrao (0,2 m).

Meio BCYE Wells et al. (1981) Extrato de levedura Carvo vegetal ativado L-Cistena HCl Pirofosfato frrico (solvel) Tampo ACES gar gua destilada Completar volume para pH Meio Nutriente gar (NA) Extrato de carne Peptona gar gua destilada completar volume para pH 3,0 g 5,0 g 15,0 g 1000 mL 6,8 10,0 g 2,0 g 0,4 g 0,25 g 10,0 g 17,0 g 1000 mL 6,7

Alternativamente pode ser utilizado o meio NA pronto (Difco) na concentrao de 23 g/L. Meio seletivo para Pseudomonas sp (Meio de King) Peptona Glicerina K2HPO4 MgSO4. 7 H2O gar gua destilada completar volume para pH 20,0 g 10,0 g 1,5 g 1,5 g 15,0 g 1000 mL 7,0-7,2

Meio MMS Metanol e Sais minerais (para isolamento de bactrias metilotrficas) K2HPO4 KH2PO4 CaCl2 MgSO4 .7 H2O 1,2 g 0,62 g 0,05 g 0,2 g

NaCl FeCl3 . 6 H2O (NH4) 2 SO4 CuSO4 . 5 H2O MnSO4 . 5 H2O Na2MoO4 . 2 H2O H3BO3 ZnSO4 . 7 H2O CoCl2 . 6 H2O Metanol Soluo de vitaminas (item 5.1) gua destilada completar volume para gar pH Meio AA gar-gua gar Difco gua destilada completar volume para pH Meio seletivo para Erwinia sp. Sacarose Arabinose Casena hidrolisada LiCl NaCl Glicina MgSO4 . 7 H2O Na2HPO4 SDS Azul de bromotimol Fucsina cida gar gua destilada completar volume para 0,5 g

0,1 g 1,0 mg 5,0 g 10,0 g 10,0 g 10,0 g 70,0 g 5,0 g 5 mL 50 mL 1000 mL 15,0 g 6,8-7,0

15,0 g 1000 mL 6,5

10,0 g 10,0 g 5,0 g 7,0 g 5,0 g 3,0 g 0,3 g 0,1 g 0,05 g 0,06 g 0,1 g 15,0 g 1000 mL

pH

8,2

Adiconar 6 mL de azul de bromotimol a 1 % em NaOH 0,02M (80 mg/100 mL de H 2O) e 10 mL de fucsina a 1 %. O meio deve estar com pH auto-ajustado para 6,8 aps autoclavagem. 4.2 Meios para identificao de bactrias Meio para deteco de indol Extrato de carne Triptona gua destilada completar volume para pH 3,0 g 10,0 g 1000 mL 6,8

Meio para Oxidao/Fermentao de Glicose (OF) Peptona NaCl KH2PO4 Azul de Bromotimol (1 % em gua) gar gua destilada completar volume para pH 2,0 g 5,0 g 0,3 g 0,8 mL 3,0 g 900 mL 6,8-7,2

Aps o preparo, do meio, autoclavar (1 atm) por 20 min a 120oC. Acrescentar 100 mL de soluo de glicose (10 %) e distribuir o meio em tubos de ensaio (10 mL/tubo). Meio para reduo de nitrato Extrato de carne Peptona KNO3 gar gua destilada- completar volume para pH 3,0 g 5,0 g 1,0 g 12 g 1000 mL 6,8

Meio de gelatina Extrato de carne Peptona Gelatina gua destilada completar volume para pH Meio para fermentao de Acares Peptona NaCl Azul de bromotimol (1 %) gua destilada completar volume para pH Meio EPM (Toledo et al., 1982) Soluo Base A Extrato de carne Triptona NaCl NaH2PO4 . 5 H2O L-triptofano Azul de bromotimol (sol. 1 %) gar gua destilada 2,0 g 10 g 5,0 g 2,0 g 1,0 g 0,8 mL 11 g 100 mL 10 g 5,0 g 2 mL 1000 mL 7,2 3,0 g 5,0 g 12 g 1000 mL 6,8

Ajustar o pH para 7,4, aps solubilizao dos componentes, e acrescentar o gar. Autoclavar a 120oC durante 20 minutos. Soluo Base B Citrato de ferro amoniacal Na2S2O3 . 5 H2O Glicose Ureia gua destilada 2,35 g 2,35 g 11,76 g 47,06 g 100 mL

Os compostos devem ser homogeneizados e aquecidos em banho-maria a 65 oC por 1 h, agitando constantemente at completa dissoluo. Preparo final Soluo A Soluo B 982,5 mL 17,5 mL

Aps misturar as duas solues, 4 mL do meio de cultura deve ser distribudos assepticamente em tubos. Inclinar os tubos at o meio solidificar. Meio para Reao de Voges-Proskauer (VP) Peptona K2HPO4 Soluo de Glicose 5 % gua destilada completar volume para pH 5,0 g 5,0 g 100 mL 900 mL 7,5

Dissolver a peptona e o K2HPO4, distribuir em tubos com 1,35 mL do meio e autoclavar. Posteriormente, adicionar 150 l da soluo de glicose, j esterilizada, em cada tubo. 4.3 Meios de Cultura para o Isolamento de Actinomicetos Meio AACK gar-Casena-KNO3-Kuster & Williams (1964) Amido KNO3 Casena NaCl K2HPO4 MgSO4 . 7 H2O CaCO3 FeSO4 . 7 H2O gar gua destilada completar volume para pH 10 g 2,0 g 0,3 g 2,0 g 2,0 g 0,05 g 0,02 g 0,01 g 15 g 1000 mL 7,0-7,5

Meio Casena Glicerol Amido KNO3 Casena NaCl K2HPO4 MgSO4 . 7 H2O CaCO3 FeSO4 . 7 H2O gar gua destilada completar volume para pH 10 g 2,0 g 0,3 g 2,0 g 2,0 g 0,05 g 0,02 g 0,01 g 15 g 1000 mL 7,0-7,5

4.4 Meios de Cultura para o Isolamento de Fungos Meio MEA Extrato de Malte Agar Difco Bacto Extrato de Malte gar (Difco) gua destilada completar volume para pH Meio BDA Batata-Dextrose-gar Infuso de 200 g de batata Glicose gar gua destilada completar volume para pH 500 mL 20 g 15 g 1000 mL 6,0 33,6 g 1000 mL 6,5

Alternativamente pode ser utilizado o meio BDA pronto (Merck, Difco ou Oxoid) na concentrao de 39 g/L. Meio de Folhas MF Peptona Glicose 5g 15 g

gar Extrato de Folhas de Citros gua destilada completar volume para pH

15 g 400 mL 1000 mL 7,9

O extrato de folhas obtido pela triturao de 100 g de folhas de citros em 400 mL de gua destilada, sendo filtrado em gaze. Meio YEPD (para isolamento de leveduras) Peptona Extrato de levedura Glicose gar gua destilada completar volume para pH Meio Sabourand Maltose gar Peptona Maltose Extrato de levedura gar gua destilada completar volume para pH 10 g 40 g 10 g 15 g 1000 mL 6,8 20 g 10 g 20 g 15 g 1000 mL 6,8

Meio Completo Aspergillus nidulans MC (Pontecorvo et al., 1953) NaNO3 KCl KH2PO4 MgSO4 . 7 H2O ZnSO4 FeSO4 Glicose ou dextrose Peptona Extrato de levedura 6,0 g 0,5 g 1,5 g 0,5 g traos traos 10 g 2,0 g 2,0 g

Casena hidrolisada gar Sol. de vitaminas para MC A. nidulans (item 5.1) gua destilada completar volume para pH 5. Solues utilizadas 5.1 Solues adicionadas ao Meio de Cultura Soluo Glutamina Glutamina gua destilada Soluo de Soro Albumina Bovina V (BSA) Soro Albumina Bovina frao V gua destilada

1,5 g 15 g 1 mL 1000 mL 6,8

4,0 g 100 mL

10 g 100 mL

Soluo de vitaminas para meio completo Aspergillus nidulans cido -aminobenzico Piridoxina Tiamina cido nicotnico Riboflavina Soluo de biotina (2 mg/10 mL H2O) gua destilada completar para 0,01 g 0,05 g 0,05 g 0,1 g 0,1 g 1 mL 100 mL

Aquecer em banho-maria a soluo por 15 minutos, por 3 dias consecutivos, ou filtrar assepticamente. Armazenar sob clorofrmio em frasco escuro a 4 oC. Soluo de Hemida clorada Hemida clorada Hidrxido de sdio gua destilada 0,1 g 0,2 g 100 mL

Soluo de vermelho de fenol 0,2% Vermelho de fenol gua destilada 0,2 g 100 mL

Soluo de vitamina a ser adicionada no meio MMS Tiamina hidroclorada Pantotenato de clcio cido nicotnico Biotina Riboflavina Vitamina B12 cido -aminobenzico cido flico Hidrocloridrato de piridoxina gua destilada completar volume para 20 mg 500 mL 5,0 mg 5,0 mg 5,0 mg 10 g 5,0 mg 25 g 100 g 100 g

5.2 Solues utilizadas para identificao de microorganismos Soluo de cristal violeta Soluo A Cristal violeta Etanol 95% Soluo B Oxalato de amnia gua destilada 0,8 g 80 mL 2,0 g 20 mL

Soluo final: misturar as solues e deixar em repouso por 48 horas. Aps este perodo, filtrar em papel de filtro e armazenar a temperatura ambiente. Soluo de iodo forte (Lugol) Iodo Iodeto de potssio 10 g 6,0 g

gua destilada Etanol 95% completar para

20 mL 100 mL

Triturar o iodo e o iodeto de potssio em cadinho e dissolver em 20 mL de gua. Completar o volume para 100 mL com etanol 95%. Soluo de safranina (0,025%) Safranina Etanol gua destilada 50 mL 12,5 g 50 mL

No momento do uso, diluir 1:10 em gua destilada Soluo de verde malaquita Verde malaquita gua destilada Soluo descorante Soluo de iodo forte Acetona Reagente para o teste do nitrato Soluo A cido sulfanlico cido actico Soluo B - naftilamina cido actico 5N Reagente de Kovacs -dimetilaminobenzaldedo lcool amlico HCl concentrado 0,005 mg 75 mL 25 mL 100 L 20 mL 160 L 20 mL 3 mL 97 mL 0,01 mg 200 mL

O -dimetilaminobenzaldedo deve ser solubilizado no lcool em banho-maria a 50-55 oC e em seguida deve ser adicionado o cido. O reagente deve ser armazenado em frasco escuro a 4 oC. Soluo de -naftol -naftol etanol Lactofenol Azul de algodo Lactofenol Fenol cido lctico Glicerina gua destilada Azul algodo Azul algodo gua destilada 50 mL 0,5 g 20 mL 20 g 40 mL 40 mL 0,01 mg 200 mL

Para o preparo da soluo final, devem ser misturados 100 mL de lactofenol, 5 mL de azul de algodo e 20 mL de cido actico glacial. Soluo de Azul de Bromotimol Azul de Bromotimol Etanol gua destilada 50 mL 1,0 mg 50 mL

5.3 Solues utilizadas na desinfeco superficial Soluo de hipoclorito de sdio Hipoclorito de sdio 10% gua destilada 10 mL 40 mL

Alternativamente pode ser utilizada gua sanitria comercial (Candura, Cndida, Q-Boa, etc.), sua concentrao de aproximadamente 2-3%.

Eventualmente, pode ser adicionado 0,1 mL/L de detergente (tween 80, tween 20, triton X 100, etc) na soluo de hipoclorito para auxiliar na reduo da tenso superficial da amostra. Importante: o hipoclorito de sdio decomposto pela luz, e portanto, deve ser guardado em frasco escuro ou utilizado logo aps a sua diluio. Soluo de lcool etlico 70 % lcool etlico 100 % gua destilada 70 mL 30 mL

5.4 Solues utilizadas no preparo de suspenses microbianas Soluo tampo PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 gua destilada completar para pH Soluo salina 0,85% NaCl gua destilada completar para 8,5 g 1000 mL 8,0 g 0,2 g 1,44 g 0,24 g 1000 mL 7,4

Distribuir alquotas de 9 mL, esterilizar em autoclave (1 atmosfera) por 20 min e armazenar a 4 oC. Soluo Tween 80 Tween gua destilada completar para 1,0 g 1000 mL

5.5 Solues inibidoras do crescimento microbiano

Antibiticos (inibidores de bactrias) Concentrao de uso no meio de cultura 75 g/mL 50 g/mL 100 g/mL 50 g/mL

Antibitico Penicilina Tetraciclina Cloranfenicol Streptomicina

Soluo estoque 50 mg/mL em H2O 50 mg/mL em etanol 50% 100 mg/mL em H2O 50 mg/mL em etanol 50%

Esterilizar em filtro (0,22 m), distribuir alquotas de 1 mL e armazenar a 20 oC. 250 mL 250 l TETRA 250 l CLORAF Fungicidas (Inibidores de Fungos) Concentrao de uso no meio de cultura 50 g/mL 50 g/mL 50 g/mL nas concentraes propostas acima

Fungicida Magnate Benomil Ciclohexamida

Soluo estoque 50 mg/mL em H2O 50 mg/mL em DMSO 50 mg/mL em H2O

Preparar as solues em tubos e solventes j esterilizados, distribuir alquotas de 1 mL em tubos e armazenar a 4 oC. Alternativamente esterilizar por filtrao (0,22 m).

FONTE: Arajo, W. L.; Lima, A. O. S.; Azevedo, J. L.; Marcon, J.; Sobral, J. Kuklinski; Lacava, P. T. Manual: Isolamento de Microrganismos Endofticos. Escola Superior de Agricultura Luiz de Quirz (ESALQ) Universidade de So Paulo. Piracicaba 2002.