Abril 2010

Sample & Assay Technologies

Manual do teste digene® HPV Genotyping RH, kit de amplificação 20

Versão 1

Para amplificação dos genótipos de alto-risco

do vírus do papiloma humano (HPV)

613413

1057454EN

QIAGEN GmbH, QIAGEN Straße 1 D-40724, Hilden

R2 1057454PT

QIAGEN Tecnologia de tratamento de amostras e ensaios de biologia molecular QIAGEN é o fornecedor líder de tecnologias inovadoras para o tratamento de amostras e ensaios de biologia molecular, permitindo o isolamento e detecção de qualquer conteúdo biológico. Os nossos avanços, com produtos e serviços de alta qualidade garantem o sucesso desde a amostra ao resultado.

QIAGEN aposta nos seguintes procedimentos:

Purificação do DNA, RNA e proteínas

Ensaios com ácidos nucleicos e proteínas

Investigação com microRNA e RNAi

Automatização de tecnologias de tratamento de amostras e ensaios de biologia molecular

A nossa missão é ajudá-lo a cumprir os seus objectivos com sucesso Para mais informações, visite www.qiagen.com.

Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação 4/2010 3

Conteúdo Composição do Kit 4

Símbolos 4

Armazenamento 5

Fim a que se destina 5

Limitações da utilização do produto 5

Controlo de qualidade 5

Assistência técnica 5

Informação de segurança 6

Introdução 7

Principio 7

Equipamentos e reagentes necessários mas fornecidos pelo utilizador 8

Notas importantes 9

Recomendações para o layout e procedimentos do laboratório 9

Colheita da amostra 10

Armazenamento de amostras 10

Purificação do DNA das amostras 11

Protocolo

Amplificação do DNA do vírus HPV por PCR 13

Guia para resolução de problemas 16

Apêndice: DNA Templates inicial 17

Referencias 17

Informação para encomendas 18

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Composição do kit

Teste digene HPV Genotyping RH , kit de amplificação (20)

Referência 613413

Número de testes 20

MM Mastermix* 945 μl

POS Controlo positivo de PCR 150 μl

NEG Controlo negativo de PCR: água (qualidade para PCR)

1000 μl

MgCl2 MgCl2 (25 mM) 1000 μl

Manual do utilizador 1

* Solução do primer GP5+ e primer GP6+ biotinilado, primers de beta-globina, dNTP’s, tampão de PCR, DNA Polimerase HotStarTaq® Plus e água.

† Solução de dois plasmideos contendo um HPV18 e uma sequencia de beta-globina em T10E1 e transportador RNA.

Símbolos

<N> Conteúdo suficiente para <N> testes

Dispositivo médico para diagnostico in vitro

Conformidade europeia

Referência

Fabricante

Código do lote

Número de material

Nota importante

Limitações de temperatura

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Prazo de validade

Consultar manual do utilizador

Armazenamento O teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação deve ser armazenado imediatamente após recepção a –20ºC. Os vials fechados são estáveis até ao fim do prazo de validade.

O teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação deve ser armazenado longe de qualquer fonte de DNA contaminante, especialmente produtos de DNA amplificado (ver “Sala 1,” página 9). Se os reagentes não forem todos utilizados numa só corrida, a quantidade não utilizada deve ser armazenada a –20°C.

O Controlo Positivo da PCR deve ser armazenado separadamente do resto do kit a –20°C até ao fim do prazo de validade inscrito no rótulo.

Fim a que se destina O teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação é um acessório do kit de detecção do teste digene HPV Genotyping RH. Incluía a Mastermix (MM), a solução de MgCl2, e os controlos negativo (NEG) e positivo (POS) da PCR para as reacções de PCR para o HPV.

Limitações da utilização do produto Devem tomar-se todas as precauções devidas e prestar atenção no manuseamento dos produtos. Recomendamos a todos os utilizadores dos produtos da QIAGEN que sigam as normas do Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos que foram desenvolvidas para utilização do DNA e outras directrizes aplicáveis.

Controlo de qualidade Em cumprimentos com o Sistema de Gestão e Garantia de Qualidade com Certificação ISO, cada lote do teste digene HPV Genotyping RH , Kit de amplificação é testado de acordo com as especificações pré definidas para garantir a uniformidade da qualidade dos produtos.

Assistência técnica Na QIAGEN, nós orgulhamo-nos da qualidade e disponibilidade do nosso suporte técnico. O nosso Departamento do Serviço Técnico é composto por

Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação 4/2010 6

cientistas muito experientes com extensa experiência teórica e pratica em tecnologia de tratamento de amostras e ensaios de biologia molecular com os produtos da QIAGEN. Se tiver alguma questão ou dificuldade com o teste relacionada com o teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação ou qualquer outro produto da QIAGEN em geral, por favor não hesite em contactar-nos.

Os clientes da QIAGEN são a maior fonte de informação relativamente à utilização avançada e especializada dos nossos produtos. Esta informação é muito útil para outros cientistas bem como para os investigadores da QIAGEN. Nós gostaríamos de ser contactados se tiver alguma sugestão em relação à performance do produto, novas aplicações ou técnicas.

Para assistência técnica e mais informações por favor consulte o nosso Centro de Suporte Técnico em www.qiagen.com/Support ou telefone para um dos nossos departamentos de Serviço técnico ou entre em contacto com o distribuidor local.

Informação de segurança Sempre que trabalhe com produtos químicos, utilize bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, consulte as fichas de segurança dos materiais correspondentes (material safety data sheets (MSDSs). Estes estão disponiveis online em formato PDF em www.qiagen.com/support/MSDS.aspx, onde pode encontrar, ver e imprimir a ficha de segurança de cada kit e componentes.

Informação para emergências disponível 24

Pode obter informação de emergência médica em inglês, francês e alemão 24 horas por dia em:

Centro de Informação Toxicológica de Mainz, Alemanha

Tel: +49-6131-19240

Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação 4/2010 7

Introdução O teste digene HPV Genotyping RH consiste em 2 kits: o teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação e o teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção. O teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação inclui os reagentes necessários para a amplificação por PCR do vírus HPV. O teste digene HPV Genotyping RH, kit de detecção permite realizar uma identificação fácil e fiável dos genotipos de alto risco (HR) do virus HPV usando hibridização inversa.

Ler o manual do utilizador completo antes de começar o protocolo.

Principio Usando os primers PCR 5+/6+ amplifica-se uma sequencia L1 altamente conservadora. A amplificação decorre usando a DNA Polimerase HotStarTaq Plus DNA. O primer GP6+ é biotinilado, permitindo a detecção e análise de sequências amplificadas usando o teste digene HPV Genotyping RH, Kit Detecção. Os primers de Beta-globina permitem a co-amplificação do DNA genomico humano presente em amostras clínicas e funcionam como um controlo interno para a inibição da PCR e a purificação adequada do DNA e das amostras.

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Equipamentos e reagentes necessários mas fornecidos pelo utilizador Sempre que trabalhe com produtos químicos, utilize bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, consulte as fichas de segurança dos materiais correspondentes (material safety data sheets (MSDSs), disponíveis pelo fornecedor do produto.

Tubos para PCR de parede fina, 0,2 ml

Termociclador*

Pipetas* e pontas descartáveis com filtros (1–20 μl, 20–200 μl, e 200–1000 μl)

Opcional: Multidispensador (por exemplo, Finnpipette® Stepper da Thermo Electron, ver www.thermo.com)* †

* Assegure-se que os equipamentos foram verificados e calibrado de acordo as

recomendações do fabricante. † Esta não é uma lista completa de fornecedores e não inclui vários fornecedores importantes de produtos biológicos.

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Notas importantes

Recomendações para o layout e procedimentos do laboratório Recomenda-se realizar a seguinte sequência de operações:

1. Preparação e separação em aliquotas das misturas de PCR

2. Preparação de amostras (isolamento do DNA)

3. Amplificação

4. Análise dos produtos de PCR biotinilados por hibridização

O pessoal envolvido no passo 3 e 4 não devem participar nos passos 1 e 2 no mesmo dia. Da mesma forma, depois de participarem no passo 2, os operadores não devem participar no passo 1 no mesmo.

De modo a evitar contaminações (por exemplo, com produtos amplificados) das amostras e evitar resultados falsos-positivos, o procedimento deverá ter lugar em três salas fisicamente separadas, cada uma com o material e pipetas necessário. Uma sala é necessária para a preparação de reagentes, outra para a preparação da amostra e a terceira sala para amplificação e detecção dos produtos de PCR. Todo o equipamento deve ser mantido na sala onde é usado e não deve ser trocado entre salas. Devem usar-se pontas com filtro para pilotagens de forma a reduzir ao mínimo contaminações cruzadas entre amostras. Usar luvas descartáveis e substituí-las frequentemente.

Sala 1: Esta sala deve ser utilizada exclusivamente para armazenamento e preparação dos reagentes de PCR. Esta sala e o seu equipamento têm de ser mantidos livres de produtos amplificados. O pessoal do laboratório deve usar uma bata limpa que não deverá utilizar-se for a deste. Devem usar-se luvas descartáveis em todo o momento.

Sala 2: Esta sala é usada para a preparação das amostras e deverá ser mantida livre de produtos amplificados. O pessoal do laboratório deve usar uma bata limpa que não deverá utilizar-se for a deste. Durante a preparação das amostras, as luvas descartáveis deverão ser substituídas frequentemente. Cuidadosamente, destapar os vials contendo amostras processadas de modo a evitar contaminações cruzadas. Evitar abrir mais que um vial de reacção contendo amostras ao mesmo tempo.

Sala 3: Esta sala utiliza-se para a amplificação e detecção dos produtos de PCR. O pessoal do laboratório deve usar uma bata limpa que não deverá utilizar-se for a deste. Sempre que trabalhe com produtos amplificados deve utilizar luvas descartáveis.

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O teste digene HC2 High-Risk HPV e o teste digene Genotyping RH, kit de detecção podem ser processados na mesma sala. Quando isto acontecer, processar as amostras, a desnaturação e transferência para a plataforma de hibridização do HC2 antes de entrar no laboratório onde se fará o teste de HC2 e o teste digene Genotyping RH, kit de detecção (Sala 3). Desta forma evita-se que a amostra original, que deve ser processada na Sala 2 seja exposta a produtos amplificados usados na Sala 3.

Colheita da amostra O teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação foi validado para ser utilizado com o seguinte:

digene Cervical Sampler (cat. no. 5122-1220)

digene Female Swab Specimen Collection Kit (cat. no. 5123-1220)

Amostras colhidas em Hologic ThinPrep® Pap Test PreservCyt® Solution

STM (Amostras STM desnaturadas armazenadas de acordo com o protocolo do teste digene HC2 High-Risk HPV)

Amostras colhidas usando outros dispositivos de colheita ou transportadas em outro meio de transporte não foram validades para utilização neste ensaio.

Armazenamento de amostras As amostras podem ser armazenadas de acordo com a informação da Tabela 1, abaixo. Maus armazenamentos podem conduzir a resultados falsos negativos com este ensaio.

Tabela 1. Condições de armazenamento de amostras

Meio de Transporte

Duração do armaze-namento antes do teste HC2

Temperatura

Duração do armazenamen-to após o teste HC2

Temperatura

STM Máximo 2 semanas

Temperatura ambiente

(15–25°C)

Até ao dia seguinte

15–25°C

STM Máximo 3 semanas

2–8°C Máximo 3 meses –20°C

A tabela continua na página seguinte.

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Tabela 1. Continua

Meio de Transporte

Duração do armaze-namento antes do teste HC2

Temperatura

Duração do armazenamen-to após o teste HC2

Temperatura

STM De 3 semanas a 3 meses

–20°C Máximo 3 meses –20°C

PreservCyt Solution

Máximo 3 meses

2–30°C Até ao dia seguinte

2–8°C

PreservCyt Solution

Máximo 3 meses

2– 30°C Máximo 3 meses –20°C

Purificação do DNA das amostras

Este processo deve ser feito antes do protocolo e na Sala 2.

Purificações mal efectuadas de DNA de amostras e um excesso de ciclos de congelação/descongelação podem conduzir a resultados falsos negativos com este ensaio.

Amostras de STM desnaturadas e PreservCyt não desnaturadas podem ser utilizadas por métodos manuais e automáticos.

Para a purificação de DNA automatizado, recomendamos a utilização do kit EZ1® DSP Virus (cat. no. 62724). Amostras que tenham sido utilizadas nos ensaios HC2 devem ser descongeladas totalmente, equilibradas à temperatura ambiente e homogeneizadas brevemente em vortex antes da sua utilização. Deve haver um volume de amostra igual a 200 μl para todo o tipo de amostras aprovadas. Para purificar o DNA de amostras de STM desnaturadas e de amostras não desnaturadas de PreservCyt, juntar 3 μg de RNA transportador a cada amostra, e seleccione 90 μl como volume de eluição.

Para a purificação de DNA manual, recomendamos a utilização do kit QIAamp® MinElute® Virus Spin (50) (cat. no. 57704) com um volume inicial de 200 μl para todo o tipo de amostras aprovadas. Juntar 2,8 μg de RNA transportador a cada amostra. Consulte a tabela 1 Volumes of Buffer AL and carrier RNA–Buffer AVE mix for the QIAamp MinElute Virus Spin Kit procedure (Volumes de Tampão AL e mistura de RNA transportador-tampão AVE para o procedimento do kit QIAamp MinElute Virus Spin) (page 17). Adicionar ½ do volume da mistura de RNA transportador-AVE ao volume do tampão AL (ml)

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como especificado na tabela. Inclua os passos de 9 e 13 do protocolo recomendado (ver ““Protocol: Purification of Viral Nucleic Acids from Plasma or Serum” [Protocolo: Purificação de ácidos nucleicos virais de plasma ou soro] no manual do utilizador do kit QIAamp MinElute Virus Spin (Terceira edição, Fevereiro 2007), Tabela 1, pagina 17 (Volume of Buffer AL and carrier RNA–Buf AVE mix required for the QIAamp MinElute Virus Spin Kit procedure [Volume de tampão AL e mistura de RNA–transportador-tampão AVE necessária para o procedimento do kit QIAamp MinElute Virus Spin]) para mais informações). Eluir o DNA em 100 μl de tampão de eluição. Ambas as amostras desnaturadas de STM e não desnaturadas de PreservCyt podem ser usadas.

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Protocolo: Amplificação do DNA do vírus HPV por PCR

Pontos importantes antes de começar

Utilize a Mastermix (MM) e a solução de MgCl2 na Sala 1 (área separada da utilizada para a preparação de amostras ou analise de produtos de PCR). Utilize o controlo Positivo (POS) de PCR e o controlo negativo (NEG) de PCR NA Sala 2 (área utilizada para a preparação e separação do DNA e independente da utilizada para analise de produtos de PCR).

Normalmente os produtos para a purificação de DNA disponíveis devem gerar uma quantidade de DNA suficiente para este ensaio. (ver pagina 11).

Consulte “Notas importantes” a partir da página 9.

Prepare todas as misturas da reacção na sala 1 (área separada da utilizada para a preparação do DNA ou analise de produtos de PCR).

Utilizar pontas descartáveis com filtro hidrofóbico de modo a reduzir o risco de contaminação cruzada.

A DNA polimerase HotStarTaq Plus requer um passo de activação de 5 min a 94ºC (ver passo 6 deste protocolo).

Procedimento

1. Na sala 1, descongelar a Mastermix (MM) e a solução 25 mM MgCl2 à temperatura ambiente (15–25°C) ou em gelo.

2. Agitar gentilmente por vortex.

É muito importante agitar as soluções completamente antes de utilizar de modo a evitar a concentração localizada de sais.

3. Ainda na sala 1, preparar a mistura de reacção de acordo com a tabela 2, pagina 14.

Não é necessário manter no gelo os tubos de reacção desde que a DNA polimerase esteja inactiva à temperatura ambiente.

Armazenar as misturas por 2 horas no máximo.

A mistura de reacção contém todos os componentes necessários para a PCR excepto o DNA template e os controlos positivo/negativo (POS/NEG).

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Preparar um volume de mistura de reacção 10% em excesso que o solicitado para o número total de ensaios de PCR que irá realizar.

4. Ainda na sala 1, agite bem a mistura de reacção. 5. Dispensar 40 μl da mistura de reacção em cada tubo de PCR.

Agitar gentilmente (por exemplo, com ajuda da pipeta aspirando e dispensando várias vezes).

Tabela 2. Composição da mistura de reacção para a reacção de amplificação

Componentes

Volume/reacção

Volume para 20 reacções*

Mastermix (MM) 33 μl 726 μl

Solução 25 mM MgCl2 7 μl 154 μl

Volume Total 40 μl 880 μl

DNA Template/controlo 10 μl

* Inclui 10% excesso

6. Vá para a sala 2 e adicionar 10 μl do DNA template a cada tubo individual contendo a mistura de reacção.

O DNA purificado deve ser completamente descongelado e homogeneizado antes da pipetagem.

7. Agitar a solução com ajuda da pipeta aspirando e dispensando pelo menos 2 vezes.

8. Ainda na sala 2, adicionar 10 μl de cada controlo positivo (POS) de PCR e negativo (NEG) a cada tubo individual contendo a mistura de reacção.

9. Agitar a solução com ajuda da pipeta aspirando e dispensando pelo menos 2 vezes.

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10. Vá para a sala 3 com a mistura de PCR e programe o termociclador de acordo com as instruções do fabricante, usando as condições indicadas na tabela 3.

Cada programa de PCR tem de começar com um passo inicial de activação por calor a 94°C durante 5 min. Não exceder os 5 minutos de activação.

Tabela 3. Protocolo de ciclos optimizado

Passo inicial de activação:* 5 min 94°C

Ciclo de 3 passos

Desnaturação (2,8°C/s a 94°C): 20 s 94°C

Renaturalização (1,8°C/s até 38°C): 30 s 38°C

Extensão (1,8°C/s até 71°C): 80 s 71°C

Número de ciclos: 40

Extensão Final: 4 min 71°C

Arrefecimento: 10 s 10°C

* DNA Polimerase HotStarTaq Plus é activada pelo passo de aquecimento.

11. Coloque os tubos de PCR NO Termociclador e inicie o programa de ciclos.

Se a detecção não for realizada no mesmo dia, armazene os tubos que contém os produtos de PCR a –20°C. Para a detecção, utilize o kit de detecção como descrito no manual do utilizador do teste digene Genotyping RH , kit de detecção.

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Guia para resolução de problemas Este guia será útil na resolução de qualquer problema que possa ocorrer. Para mais informações, consulte também a página de perguntas frequentes (Frequently Asked Questions, FAQ) do nosso centro de suporte técnico: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Os especialistas dos serviços técnicos da QIAGEN estão sempre disponíveis para responder a qualquer questão que possa ter em relação ao manual do utilizador bem como relacionadas com tratamento de amostras ou outros ensaios (para informação dos contactos ver anteriormente ou visite www.qiagen.com).

Comentários e Sugestões

Sinais ou sensibilidade baixas

a) DNA Polimerase HotStarTaq Plus não activada

Verificar se a PCR começou com o passo de incubação inicial a 94°C durante 5 min.

b) Erro de pipetagem ou falta de reagente Repetir a PCR. Verificar as concentrações e

condições de armazenagem dos reagentes.

c) Problemas com o template inicial Verificar a concentração, condições de

armazenamento e a qualidade do template inicial. (ver Apêndice, pagina 17). Se necessário, fazer diluições seriadas do DNA Template. Repetir a PCR utilizando novas diluições.

d) Problemas com o termociclador Verificar a alimentação do termociclador e

se os ciclos foram bem programados.

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Apêndice: DNA Templates inicial Dado que o ensaio de PCR consiste numa serie de reacções enzimáticas, é mais sensível a impurezas como proteínas, fenol/clorofórmio/sais, etanol, EDTA e outros solventes químicos que os processos enzimáticos simples de um só passo. A QIAGEN oferece uma gama completa de sistemas de preparação de ácidos nucleicos, garantindo DNA Template de mais alta qualidade para os ensaios de PCR.

Para mais informação acerca dos kits da QIAGEN kits para Purificação de DNA, contacte um dos nossos departamentos de serviço técnico (ver anteriormente ou visite www.qiagen.com).

Referencias A QIAGEN mantém online uma base de dados extensa e actualizada de publicações cientificas de utilizações dos seus kits. As opções de pesquisa permitem ao utilizador encontrar os artigos que necessitam, ou por uma palavra única ou especificando a aplicação, área de investigação, titulo, etc.

Para obter uma lista completa de referências visite a base de dados bibliográfica da QIAGEN online em www.qiagen.com/RefDB/search.asp, contacte os serviços técnicos da QIAGEN ou o distribuidor local.

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Informação para encomendas Produto Conteúdo Cat. no.

digene HPV Genotyping RH Test (20)

Para 20 reacções: Primers GP5+ e GP6+ biotinilado; reagentes e tampões para hibridização Inversa

613413

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Manual do teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação 4/2010 20

Marcas comerciais: QIAGEN®, QIAamp®, digene®, EZ1®, HotStarTaq®; Hybrid Capture®, MinElute® (QIAGEN Group); Finnpipette® (Thermo Electron OY); ThinPrep®, PreservCyt® (Hologic Corporation), Thermomixer® (Eppendorf).

Acordo de licença limitada

A utilização deste produto implica por parte de qualquer comprador do teste digene HPV Genotyping RH , Kit de Amplificação a aceitação dos seguintes termos:

1. O teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação pode ser utilizado exclusivamente de acordo com as especificações do Manuel do utilizador do teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação e usando unicamente os componentes contidos dentro do kit. A QIAGEN não oferece licença alguma sobre nenhuma das suas propriedades intelectuais para utilizar ou incorporar os componentes contidos no kit com componentes não incluídos no mesmo, excepto de acordo com o descrito no manual do utilizador do teste digene HPV Genotyping RH, kit de amplificação e em protocolos adicionais disponíveis em www.qiagen.com.

2. A parte das licenças expressamente especificadas, a QIAGEN não garante que este kit nem a sua utilização não infrinjam direitos de terceiros.

3. Este kit e os seus componentes estão licenciados para uma única utilização e não podem ser reutilizados, reacondicionados nem vendidos.

4. A QIAGEN especificamente renuncia a qualquer outra licença, explícita ou implícita, diferente das licenças expressamente especificadas.

5. O comprador e o utilizador do kit aceitam não realizar nenhum passo que possa conduzir a acções que sejam proibidas nas especificações anteriores ou que possam facilitá-las. A QIAGEN reserve-se ao direito de accionar legalmente acções perante qualquer tribunal para o cumprimento das proibições especificadas neste Acordo de Licença limitado e recuperará todos os gastos envolvidos na investigação e os custos judiciais, incluindo honorários de advogado, em qualquer acção interposta para fazer cumprir este Acordo de garantia limitada ou qualquer outro direito de propriedade intelectual em relação a este kit e seus componentes.

Para obter os termos da licença actualizados visite www.qiagen.com.

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Australia Orders 03-9840-9800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066

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Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712

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