CAPITUI;O V

BACTERIAS HETEROTROFAS (Continuacin)

3. Bacterias anaerobias que necesitan hidrgeno combinado.

BACT^RIAS DESTRUCTORAS DE I,A C^I,UI,OSA:

a) Anaerobias.b) Aerobias.c) Termfilas.d) Desnitrificantes.

3. Bacterias aaaerobias. - No se conoce ninguna bacteria abso-lutamente anaerobia, es decir, que slo pueda vivir y desarrollarse entotal ausencia de oxigeno (pg. i3). I,as anaerobias estrictas parecenestimuladas por la presencia de pequeas cantidades de osgeno libre,aun cuando pueden vivir en total ausencia de este gas.

I,a primera generacin de una bacteria anaerobia, en cultivo, esms sensible a la presencia de oxfgeno que las generaciones siguientes,y dentro de una generacin, toleran peor el oxgeno en las primerasedades del cultivo.

McI,eod y Gordon (68) han destacado la incapacidad de producircatalasa de las bacterias anaerobias. 1~n el desarrollo aerobio de lasbacterias se forma perxido de hidrgeno, que sera perjudicial paraellas de no existir la catalasa, que desdobla el perxido en agua y oxf-geno inactivo. A1 carecer las bacterias anaerobias de la capacidad deformar catalasa, cuando se desarrollan en condiciones aerobias estnsometidas a la accin perjudicial del agua oxigenada. ^1 efecto nocivodel aire sobre las bacterias anaerobias en estado vegetativo se hacepatente con una exposicin de slo cuarenta minutos, mientras queen las esporas no se manifiesta al cabo de tres horas (2 y 27).

Las bacterias anaerobias intervienen en el suelo en un nmero con-siderable de importantes procesos, algunos de los que hemos mencio-nado ya, y entre los que merecen destacarse: formacin de amonacoa partir de los proteidos; fijacin del nitrgeno atmosfrico por bac-terias libres, ms iutensa, probablemente (77), que la llevada a cabopor bacterias aerobias, y descomposicin de celulosa, peptinas yproteidos.

^l solo carcter de anaerobias no sirve para caracterizar bacteriasque difieren tan fundamentalmente en su metabolismo, como lasqne obtienen su energa de la celulosa, las que toman su nitrgeno delnitrgeno atmosfrico, las que pueden obtener oxgeno de los nitratos

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y sulfatos o las que ocasionan el desprendimiento de olores pesti-lentes de las prote^nas complejas. Mientras que el anhdrido carb-nico es el gas principal producido por las bacterias aerobias, las anaero-bias se caracterizan por originar diversos gases, tales como el metanoy el hidrgeno en la descomposicin de los glcidos; el cido sulfh-drico en la reduccin de los sulfatos; xidos de nitrgeno y nitrgenolibre en la reduccin de los nitratos; determinadas aminas, hidrgenosulfurado, nitrgeno y sus gidos y mercaptanes, como resultantesde la descomposicin de los proteidos. Adems, las bacterias anaerobiasforman cidos actico, butrico, propinico, frmico y lctico, alco-holes etlico y butlico, y en algunos casos, acetona.

De entre los varios sistemas de clasificacin de las bacteriasanaerobias del suelo, reproducimos el siguiente, propuesto por ^^Vaks-man (io2): ^

I.-Bacterias que actan prindpalmente sobre hidratos de carbono:

i. - Bacterias que utilizan ampllamente hidratos de carbono sencillos yalmdones como fuentes de energfa, denominadas por varios auto-res sacarolticas. A este grupo pertenecen las bacterias butricasclasificadas de ordinario como una sola espede: Bacillus amylo-bacter A. :lfeyer y Bredemann. $stas bacterias descomponen losazcares, con formadn de ddo butfrico y Rases.

a) Bacterias. fijadoras de nitrgeno: Clostridium pastorianum Wino-gtadsky (Bac, amylobacter van Thieghem, Bac. amylocymePerdrix, Bac, butyricus Botkin, Granulobacter saccarobuty-ricum Befjeriack, Bac. ordhobutilicus Grimbert, Clostridiumamericanum Ptiagahefm, Bac. amylobacter A. M. y Bred.), yformas afines encontradas prcticamente como abundantesea casi todos los auelos. Bste organ{smo o grupo ha sido clasi-ficado por Bergey como Cdostridium butyricum Prazmowsky-y por Lehmann y Newmann, como Bac. pastorianum Wino,gradsky.

b) Bac. wekhii Migula (Bac. aerogenes capsulatus Weleh y Nutall,Bac. per/ringens Veillon y Zuber, Bac, enteritidis sporogenesKlen). BastondUos cortos, de 4 a 8 x i a i,s , aslados oen parejas, inmvilea, que forman esporas ovales, centraleso escntrcas, encapsulados. Bncontrada repetidas veces enel suelo y en las aguss residuales.

z. - Bacterias que descomponen los compuestos pcticos.a) Grupo del Bac. amylobackr, que ineluye al Clostridium pastorianum

(gual que i, a)). I,as formas que ocasionan el enriado del linohan sido descrtas con nombtes diveraos, entre ellos el Plec-tridium de Fribea y Wnogradsky, el Clostridium de Behrens^el Plectridium pectinovorum de Beijernck y van Delden.

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b) Bac. Jelsineus Carbone. Bastondllos, de o,3 a o,q x 3 a g ,que se preseatan aislados, en pares y en cadenas, mviiea conflageloa pertricos. Esporas ovales, terminales, Gram positivos.No producen ddo butlrIco en el enriado del lino.

3. - Bacterias qne desrnmponen la celulosa.a) Bacterias anaerobias que descomponen la celulosa a la temperatu-

ra ordinara. Bntre ellas se encuentran las productoras dehidrgeno y de metano, de Omellansky; el Bac. cellulos^dissolvans Khouvne, y otras.

b) Bacterias termfilas: Clostridium thermocellum Vljcen, Fred yPeterson.

II.-Bacteriae que ad:an prIndpalmente sobre los prtidos.

i. - Pormas fuertemente proteolticas. a) Bac. sporegenes Metdwihoff (Glostridium sporogenes (Metcluii-

koff) Bergey y ml). Bacilo mbvil, con flagelos pertricos, Grampostvo, con extremos redondeados, de 3 a y x o,6 a o,8 .Una de las bacterias ms fuertemente proteolticas que se co-nocen. Descompone los prtidos rnn formacidn de gas, enne-gredmiento del medio y producdn de an olor marcado. );asesporas, subterminales, se forman proato. Se encuentra abun-dantemente en el sudo, estircol, polvo y aguas residuales.

b) Bac. oadamatis maligni Koch ( Vibrion septique Pasteur, Clostri-dium oedematis maligni (Koch) Bergey y col.). E;ncoatradoen el intestino del hombre y en el suelo. Descompoae los pr-tidos con formaddn abuadante de gas, sin ennegrecer elmedio.

c) Bac. putrificus Bienstodc (Clostridium puirificus Bergey y col.).Badlo rnn flagelos pertricos, mvil. F'orma esporas ovales,graades, termnales. Posee propedades saca.rolticas dbilesy descompone fuertemente los prtidos, con ennegredmientodel medio y desprendimiento de olor ftido. La leche es dige-rida gradualmente, sin coagulaca rpida.

d) Bac. histolytticus Weimberg y Seguin (Clostridium histolytcumBergey y col.). Bad1o de 3 a 5 x o,s a o,^ , mvil con fla-gelos perftricos, que se presentan aislados o en parejas. Des-compone los prtdos ain desprendimiento de gases, ennegre-ce el medio y posee olor nauseabundo. Este organsmo ha sidoaislado del suelo por Peterson y Hall.

e) Bac, botultinus van Ermengen (Clostridium botulinum Bergeyy rnl.). Badlos gruesos, con estremos redondeados y esporasovales subterminales. Descompone los prtidos con forma-ddn de gasea y ennegredmiento del medio. >~I habitat naturalde esta espede est eztendido por todo el mundo, tanto en lossuelos vfrgenes y forestales como en loa cultivados.

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s. - Organiemoe dEbilmeate proteolitcoa.a) Bac. bifer+westaus Teaier ^ Martelly (Clostridium 6iJermc+^taxs

(Tisaer y Martelly) Bergey y col.). Badlos de 5 a 6 x o,8a r , inmvilea, preaeatQndade aialadoa o en cadenas wrtaa.iyaporas ovalea, centralea. I.os baatondllos no engrnesan alesporular. Produce ddo y gas con loa hidratoa de carbono.Dearnmpone los prtdoa oon deaprendimeato gaseoao y en-negredmimto dei medio. Arede desarroUarae hasta loa go^.

b) Bac. t^taxi Nfoolaiet (Closhidium tetani (Neolaiet) Holland).Badloe mvks, oon flageloa perltricos, de 4 a 8 x o,4 a o.6 ,incapaces de ntilizar los hidratos de carbono. Eanegrecen elmedio de caltivo. Pasaa al auelo mn el eatircol, habiendo aidocomprobada sn eziatenda m muchas muestraa de auelo.

5e han aislado del ando o de otras fuentes, que pueden in-dcar un habitat m l, bacterae anaerobfas de eacaso poder pro-teoltico, pero capacea de atacar a diversoa hidratoa de carbonocon formadn de gas, q tales como Bac. ckauvei Arloing, Corne-vla y Thomas (Clostridium cauvei (Arlong, Cornevin y Thomas)Holland).

III.-Bacterias qne obtienen au ozgeno de sales mineralea.r. - Bacterias rednctoras de nitratos.z. - Bacterias reductorss de sulfatos.

I,as bacterias anaerobias pueden llegar a alcanzar en el suelocifras muy elevadas, del orden de los io millones por gramo de tierrade jardn. 1~1 gran nmero de bacterias anaerobias que se encuentranen los suelos forestales (de 500.00o a 5 millones por gramo de suelo)merece particular atencin, as como la de las fijadoras de nitrgenoanaerobias (de ioo a io.ooo por gramo de suelo). I,as bacterias fija-doras de nitrgeno aerobias, o faltan totalmente en los suelos fores-tales, o estn en nmero muy reducido, lo que prueba (3o y 32) elpapel de las bacterias anaerobias para la fijacin del nitrgeno atmos-frico en estos suelos.

Bacterias destructoras de la celulosa. - Fstas bacterias han sidoobjeto de particular atencin a causa de que la celulosa es el materialorgnico ms abundante entre los que recibe el suelo y a que existenbastantes bacterias que pueden desarrollarse utilizando la celulosacomo material energtico, y algunas son incapaces de emplear otraf uente de energa.

I,as bacterias destructoras de celulosa pueden dividirse en lossiguientes cuatro grupos: anaerobias, aerobias, termfilas y desni-

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trificantes, de los que el primero parece ser el de mayor importarr-cia (8o y I^3) en los procesos que se llevan a cabo en el suelo.

aJ BACT^RIAS ANAEROBIA5 DE5TRUCTORA5 D^ I.A CEI.UI,OSA. - Alfrente de este grupo deben figurar las bacterias, ya clsicas, aisladaspor Omeliansky (75) a fines del siglo pasado: Bac. methanigenes I,ehmanny Neumann y Bac. f ossicularum I,ehmann y Neumann, que fueronlas primeras bacterias que se demostraron defintivamente capacesde descomponer la celulosa en forma de papel de filtro o de algodn.

Ambos organismos se encuentran en aquellas sitios donde, encondiciones anaerobias, se destruyen tejidos vegetales, por ejemplo,en el esti^rcol o en el cieno de los pantanos y ros.

Para su aislamiento, Omeliansky empleaba estircol de caballo 0cieno del ro Neva, inoculados en frascos completamente llenos deun medio que contena, adems de papel de filtro, los siguientes ele-mentos:

Fosfato btpotsico (KfHPOi) ........ . . .. . . . . . . . i,o gramos.Sulfato magnsim (b1gS0^ qH^O) ....... . . . . .. . o,s rSulfato amnico (NH^)^ SO^ ..... ... . . . . . . . . . . . . i,o rCarbanato cldrn (CaCO') ..................... io,o rCi,oruro sdico (NaCI) ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Indidos.Agua destilada ............................... iooo c. c.

El sulfato amnico puede ser reemplazado por una cantidad igualde fosfato amnico, de peptona o de asparagina.

Los frascos inoculados se incuban a una temperatura de 34^ a 35^.A1 cabo de unos ocho das empieza el desprendimiento de gases de Iafermentacin, que, al principio, consisten en una mezcla de hidrgeno,metano y anhdrido carbnico; pero que despus de varios resiembrosen medio nuevo, terminan por contener una mezcla de metano yanhdrido carbnico, en la proporcin de 3 a i cuando los cttltivos sonjvenes.

^n esta fase, cuando el gas desprendido no contiene hidrgeno, elcultivo es casi puro, pudiendo ser aumentada su pureza mediante pas-teurizaciones realizadas antes de los resiembros, siempre que las espo-ras del fermento metnico estn formadas. Por este medio se destru-yen los organismos contaminadores que no formen esporas.

Examinando al microscopio un cultivo obtenido de este modo, seobserva que contiene unos bacilos delgados, de o,4 ^ x 5 , que secolorean fcilmente y se encuentran en gran nmero depositadossobre las fibras de celulosa, por lo que muchos de ellos estn curvados

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y conservan la forma de la seccin de la fibra aun despus de separa-dos de sta rnediante lavados. A medida que el cultivo envejece yavanza la destruccin de la celulosa, los bacilos se alargan hastaalcanzar una longitud triple de la primitiva, empezando a percibirseun engrosamiento en uno de los extremos. que se tie ms intensa-mente, constituyendo finalmente una espora esfrica de z de di-metro, en cuyo momento el Bac. methanigenes presenta su aspectoms caractertstico.

I,a destruccin de la celulosa puede seguirse microscpicamente.A1 iniciarse el ataque, el papel de filtro toma una coloracin anaran-jada o amarilloanaranjada, apareciendo con numerosos agujeros ylos bordes corrodos. Finalmente pierde su estructura fibrosa y seacumula en el fondo del frasco en forma de un sedimento negruscoo anaranjado. El proceso de la destruccin es lento y puede durarvarios meses. Durante el perlodo de fermentacin vigorosa, el des-prendimiento de gases vara de 3,5 c. c. a i5 c. c. por gramo de celu-losa. Aderns de los gases indicados, durante la fermentacin se for-man cidos grasos voltiles.

Con el Bac, methanigenes aparece asociado el Bac, f ossicularum, quedesprende hidrgeno durante la fermentacin de la celulosa. Sus es-poras germinan mucho ms lentamente que las del primero, hecho quefu aprovechado por Omeliansky para su separacin. Como hemosindicado, en el primer cultivo preparado para el aislamiento del Ba-cillus methanigenes, el gas desprendido contena hidrgeno y metano.Si dicho cultivo, poco tiempo despus de iniciado el desprendimientogaseoso, se calienta durante quince minutos a una temperaturade 75^, las clulas del bacilo metnico procedentes de la germinacinde las esporas quedan destrufdas, mientras que las esporas del pro-ductor de hidrgeno, que no han germinado todava, permanecen vi-vas. Repitiendo esta operacin en tres o cuatro generaciones sucesi-vas se llega a obtener un cultivo que slo desprende hidrgeno yanhdrido carbrco, en el que se encuentran bacilos de o,5 X 4 a 8 de longitud en los cultivos jvenes, y en los viejos pueden alcanzarde io a ^5 de longitud. ^as esporas, esfricas y terminales, son demayor dimetro que en el Bac. methanigenes, midiendo i,5 de di-metro. A1 igual que este ltimo, las clulas vegetativas no toman conel yodo la coloracin azul o prpura caracterfstica del Bac. amylobacter.

I,a fermentacin hidrogenada de la celulosa progresa ms lenta-mente que la metnica, y a la temperatura ptima (35^) puede con-tinuar ininterrumpidamente durante ms de un ao. El gas, hidr-

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geno y anhdrido carbnico, se forma con ms lentitud; aproximada-mente, 8 c. c. por gramo de celulosa en las veinticuatro horas. Ade-ms de los gases mencionados, durante la fermentacin se formancidos actico y butrico, trazas de cido valrico y alcoholes superio-res, asf como pigmentos y substancias aromticas, que dan al cultivoun aroma parecido al del queso.

Ni el Bac. methanigenes ni el Bac, fossicularum han podido obte-nerse en cultivos puros en la forma habitual, ya que ninguno de losdos se desarrollan en los medios slidos ordinarios a base de agar ogelatina, habiendo fracasado todos los intentos en este sentido.

En iq23, Khouvine (56) describi otro organismo anaerobio des-tructor de la celulosa aislado del intestino del hombre: el Bac. cellulosaedissolvens Khouvine. (Clostridium dissolvens (Khouvine) Bergey y cola-boradores), interesante porque, adems de otros productos, suministraalcohol etlico en proporcin de un 8 por ioo de la celulosa fermen-tada. NTorfolgicamente, el Bac. cellulosae dissolvens se parece mucho alBac. fossicularum, del que se diferencia por sus esporas, ovales enlugar de esfricas y de mayor tamao: 2 x 2,5 . Fste organismose desarrolla bien hasta en temperaturas de 57^, y a este respecto,repre^enta una fase de transicin hacia las bacterias termfilas. Fucultivado en un medio lquido conteniendo substancias fecales comofuente de nitrgeno: las bacterias se adhieren fuertemente a las fibrascelulsicas del papel, lo que permite separarlas de las contaminacionesque son arrastradas al lavar el papel con la solucin de sales esteri-lizada.

En la fermentacin de la celulosa, nico hidrato de carbono al queataca, adems de hidrgeno y anhdrido carbnico, se forma cidoactico y butrico, alcohol etlico y un pigmento pardoamarillento.nicamente se recupera, en los productos de la fermentacin aislados,e155^15 Por Zoo del carbono fermentado. Madame Khouvine cree que elresto se encuentra en el lquido de fermentacin en forma de hidratosd e carbono solubles , que son capaces d e ser absorbidos por elintestino.

Este organismo se ha encontrado tambin distribudo abundante-mente en toda clase de suelos.

En el conducto intestinal de las larvas de Potosea cuprea Fabr., aislWerner (io6) un organismo anaerobio, Bac. cellulosam fermentans(Clostridium werneri Bergey y col.), capaz de atacar rpidamente ala celulosa, ayudando asf al insecto en su proceso digestivo. Otrosinvestigadores han sealado tambin la naturaleza anaerobia de las

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bacterias que desrnmponen la celulosa en el aparato digestivo de loscaballos, ganado, termites y larvas de in.sectos.

b^ BACT^RIAS AEROBIAS DESTRUCTORAS DE CEI,ULOSA. -^1 prl-

mer mcroorganismo de este tipo fu descrito por van Iterson (95) ^bajo el nombre de Bac. ferrugineus (Cellulornonas ferruginea Bergeyy rnl.), como un delgado bacilo, muy movible, no esporgeno, que seencuentra en el suelo de jardn, en el humus, en las hojas secas, etc.

Puede obtenerse colocando en un plato un trozo de papel de filtro,que se espolvorea con fosfato amnico magnsico, se cubre con otrotrozo de papel, se humedece rnn una solucin al o,og por ioo de fos-fato bipotsico, se inocula con tiena de la indicada anteriormente yse incuba a 28^.

A los cuatro o cinco das aparecen sobre el papel unas manchaspardoamarillentas; en ellas, el papel va siendo descompuesto en unasubsta.ncia mucilaginosa, en la que, observada al microscopio, seadvierten diversos microorganismos, entre los que predominan dostipos: el ya mencionado Bac. ferrugineus y una forma cocoide grande.Ln una fase m^as avanzada de la descomposicn, los restos de lasfibras aparecen envueltos en una masa mucilaginosa de micrococos.Van Iterson atribuy la descomposicin de la celulosa al Bac. ferrugi-neus, y consider la fortna cocoide como un organismo en simbiosiscon aqul, que aun cuando por s solo es incapaz de atacar a la celu-losa, ayuda al primero a destruirla.

Durante una investigacin sobxe la descomposicin aerobia de lacelulosa en los suelos de Rothamsted, Hutchinson y Clayton (si), ais-laron un microorganismo aerobio S^irochaeta cyto^haga Hutchinsony Clayton, muy semejante al Bac. ferrugineus, utilizando una solu-cin de sales minerales inoculada con suelo, en la que estaba introdu-cido parcialmente un trozo de papel de filtro. A1 cabo de cuatro o seisdas de incubacin a 2s^, aparecan en el papel, en la parte no sumer-gida, pero pr.zima al lquido, unas manchas pardoamarillentas, en lasque el papel iba perdiendo consistencia, y donde se poda observar,con ayuda del microscopio, que contenfa bacilos delgados y cocos detamao grande. Tras de muchas tentativas consiguieron un cultivoliquido en el que slo se encontraban bacilos; pero los resiembros enmedio nuevo, al cabo de algunos das, presentaron nuevamente laasociacin de cocos y bacilos, lo que hizo que Hutchinson y Cla.ytonconsiderasen a las primeros como una fase del ciclo evalutivo del or-ganismo.

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En los cultivos jvenes de Spirochaeta cyto^haga predomina laforma de bacilos de o,3 a o,4 por 3 de longitud, afilados en losextremos y frecuentemente encorvados. Aun cuando no se han podidoobservar flagelos, los bacilos presentan un movimiento de rotacinlento, pero marcado. 5on muy fle^cibles, tomando a menudo formasde S, de O de U; a medida que el cultivo envejece va siendo ms fre-cuente la forrna de cocos, o xfase esporoide^. I,os esporoides miden i,5 de dimetro, y se tien mucho ms intensamente que los bacilos. I,osesporoides no pueden considerarse como esporas, ya que basta paradestruirlos el calentamiento a 60^ durante diez minutos.

Winogradsky (ii3), posteriormente, en un estudio sistemtico dealgunas bacterias aerobias del suelo destructoras de celulosa, estable-ci los siguientes gneros:

Gnero Cytophaga Winogradsky, ig2g.

Bastoncillos largos, fleguosos, con extremos afilados, conteniendogrnulos metacromticos. Incapaz de usar como alimento substan-cias carbonadas, con egcepcin de la celulosa que hidroliza. Su des-arrollo sobre los medios de cultivo habituales es lento.

1a especie ttpica es Cytophaga hutchinsoni Winogradsky, que fuel organismo descrito por Hutchinson y Clayton como S^irochaetacito^ihaga.

i. - Cyto^haga hutchinsoni Winogradsky.

Bastoncillos de o,3 a o,4 x 3 a 8 , aislados o en cadena, que setien con dificultad, pero presentan grnulos fuertemente teidos.Gram, negativa. Reproduccin probable por los grnulos temdos(^ artrsporas? ). I,os cultivos viejos presentan formas cocoidesgrandes.

Se desarrolla en gel silceo y ataca la celulosa en este medio, for-mando grandes colonias mucilaginosas de color naranja.

Aerobia facultativa.Temperatura ptima: 20^.Habitat: Suelo. Desintegra las fibras vegetales.

2. - Cyto^haga aurantiaca Winogradsky.Bastoncillos largos, de i x 6 a 8 , puntiagudos, inmviles. Gram

negativos.

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5obre gel silceo con celulosa forma colonias de color rosa na-ranja.

3. - Cytophaga rubra Winogradsky.

Bastoncillos largos, de o,4 x 3 , ligeramente curvados, con unpequeo grnulo cerca de cada extremo. Movilidad no demostrada.Gram negativo.

Sobre gel silceo con celulosa forma colonias mucilaginosas rojas.4. - Cytophaga dutea Winogradsky.

Bastoncillos de o,4 por 3 . Gram negativos. No se ha aislado eucultivo puro.

Sobre gel slceo con celulosa forma colonias mucilaginosas, ama-rillo brillante.

^. - Cytophaga tenuissima Winogradsky.

Ms tenue que las otras especies.1lorma colonias mucilaginosas color verde oliva sobre el gel silceo

con celulosa.

Gnero Cellvibrio Winogradsky, 1929

Bastoncillos largos, ligeramente curvos, con extremos redondeados.Muestran grnulos, que se tien fuertemente (^artrsporas?), que pa-recen relacionados con la reproduccin. Mviles con flagelos polares.Oxida la celulosa formando oxicelulosa. Sobre medios ordinarios decultivo muestra crecimiento dbil.

I,a especie tipo es Cellvibrio ochracea Winogradsky.

i. - Cellvibrio ochracea Winogradsky.

Bastoncillos curvados, rollizos, con extremos redondeados, deo,^ x 2,5 a 5 , raramente en espiral. Mviles. Gram negativos.

5obre gel silceo con celulosa forma colonias difusas, mucilagino-sas, color ocre claro.

2. - Cellr^ibrio flavescens Winogradsky.Bastoncillos curvados, rollizos, con extremos redondeados, con

grnulos metacromticos. Gram negativos.Sobre gei silceo con celulosa forma coloni^s difusas, mucilaginosas,

color amarillo claro.

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Gnero Cellfakicula Winogradsky, 1929Bastoncillos cortos, que no egceden de a , puntiagudos, con gr-

nulos metacromticos. I,os cultivos viejos presentan formas cocoideas.:Vlviles con un flagelo polar. Osida la celulosa y la transforma enoYicelulosa.

I,a especie tipo es Cell f akicula viridis Winogradsky.Z. - Cellfakicula viridis Winogradsky.

Bastoncillos curvos, rollizos, de o,7 X 2 , con extremos ligera-mente puntiagudos. Mviles. Gram negativos.

Forma colonias difusas, mucilaginosas, de color verde, sobre gelsilceo con celulosa.

2. - Cell f al.cicula mucosa Winogradsky.Bastoncillos curvos, rollizos, de o,7 X a , con extremos ligera-

mente aguzados. Mviles. Gram negativos.Sobre gel silceo con celulosa forma colonias difusas, mucilaginosas,

color crema.3. - Cell f alcicula f usca Winogradsky.

Muy parecida a la anterior, presentando autolisis en los cultivosviejos.

1^1 gel silceo con celulosa empleado por Winogradsky puede pre-pararse del modo siguiente: Se pone en placas de Petri, en la forma in-dicada anteriormente, una mezcla de una solucin normal de xCl ysu equivalente de una solucin de silicato potsico. Despus que seha formado el gel, se colocan las placas durante veinticuatro horas enagua corriente, y luego, varias veces, en agua destilada hervida, hastaque queden libres de cloruros. Cinco gramos de papel de filtro, fina-mente desmenuzado, se mezclan con ioo c. c. de una solucin quecontenga:

t^a)a HPOa . ... . . . ... .. . . . .. ...... .. . . .. . g,oo gramos.Mg SOa ................................... i,oo SG ...................................... i,oo rFeSOa .................................... 0,02 rAgua destllada ............................. i.ooo c.c.

De la anterior solucin se egtienden porciones de unos 2 c. c. sobreel gel de cada placa, espolvoreando con una pequea cantidad deCaC08. I,as placas se colocan en una estufa a 60^, hasta que la super-

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ficie del gel quede libre de exceso de lquido. Se colocan entonces pe-queas partculas de suelo sobre la placa, que se cubre y se pone aincubar. A los tres o cuatro das se desarrollan colonias de color anaran-jado, arnarillo, etc., que se extienden sobre el medio de cultivo. De es-tas colonias se pueden hacer trasplantes a matraces que conten-gan un gramo de papel de filtro y 25 c, c. de la solucin anterior. I,osorganismos empiezan a desarrollarse como pequeos lunares colorea-dos, sobre el papel, que posteriormente forman una masa mucilagi-nosa e^tendida por todo ste. Mediante repetidos trasplantes puedellegar a obtenerse la bacteria en cultivo puro.

Adems de los organismos mencionados anteriormente, Kellerman,McBeth y otros (54 Y 55)^ as como McBeth y Scales (66), han descritonumerosas bacterias aerobias que consideran como destructoras decelulosa. Para el aislamiento de estos organismos, los autores ameri-canos emplearon la siguiente ^olucin:

Fosfato bipot.rirn (K^HPO^) ........ . .. .... .. t,o gramos.Sulfato magnsco (MgSO^ 7H^0) . . . . . . . . . . . r,o ^Cloruro sdico (NaCI) ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T,o rSulfato amnirn (I1H^)^ SQ^ . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 >Carbonato clcico (CaCOs) .. ... . . . . . . . . . . . . . . zo,o ^rAgua cozriente .............................. iooo c. c.

b;l sulfato amnico puede reemplazarse por peptona.En matraces de ^rlenmeyer de 20o c. c. se colocan papeles de

filtro de io cm. de dimetro y se aaden ioo c. c. de solucin hastaque quede cubierto el papel.

I,os matraces preparados se esterilizan y se inoculan con una pe-quea cantidad de la substancia a examinar, incubndolos a 30^. 1

Agar-celulosa. - A un litro de amonaco diludo que contenga diezpartes de amonaco (de o,qoo de p. e.) por tres de agua, se aade unligero exceso de carbonato cprico. I,a mezcla se agita vigorosamentey se deja reposar hasta el dfa siguiente. I,uego se decanta la solucinde xido de cobre amoniacal, y se disuelven en ella z5 gramos de pa-pel de filtro sin lavar. F^sta solucin se diluye hasta io litros y se pre-cipita la celulosa, acidificando lentamente con cido clorhdrico di-lufdo (2o por ioo). El lfquido se diluye nuevamente hasta 20 litros,se deja sedimentar la celulosa y se decanta el lquido. I,a celulosa pre-cipitada se lava varias veces con agua acidulada con clorhdrico hastaque el agua de los lavadas no contenga cobre, y luego, con agua des-tilada hasta arrastrar todo el clorhdrico. La celulosa se deja reposarvarios dias, y finalmente se hace una suspensin a1 z por ioo. A50o c. c. de esta suspensin se agregan io gramos de agar y goo c. c. dela solucin de sales antes indicada.

Agar-almid^t. - Diez gramos de almidn de patata se suspendenen 80o c. c. de agua fra. I,a suspensin se hierve, agitando, hasta quese reduzca su volumen a goo c. c. A esta solucin se aaden io gramosde agar y 50o c. c. de solucin de sales.

Agar-patata. - A ioo gramos de patatas machacadas se aaden80o c. c. de agua corriente. I,a mezcla se lleva al bao de vapor durantetreinta minutos y se filtra a travs de algodn. A 50o c. c. del filtradose agregan io gramos de agar y 50o c. c. de solucin de sales.

Agar-dextrosa. - Diez gramos de glucosa y ig gramos de agar sedisuelven en 50o c. c. de agua corriente, y esta solucin se mezcla con50o c. c. de solucin de sales.

^s caracterfstico de los cultivos de estas bacterias que produzcanunas zonas transparentes alrededor de las colonias, que no son debidasa la neutralizacin del carbonato clcico ni a una accin enzimticade las bacterias, sino a la invasin del medio por un gran nmero debacterias (98). I,os resiembros de las colonias tienen menos marcado elcerco claro, que desaparece al tercero o cuarto trasplante.

Estas bacterias de Kellerman y sus colaboradores, as como otrasaisladas por Sack (8^), fueron includas por Bergey en el gnero Cellulo-monas, caracterizado por bacterias en forma de pequeos bastoncilloscon extremos redondeados, no esporgenos, mviles o inmviles, quese encuentran en el suelo y tienen la propiedad de digerir la celulosa.I,a especie tipo e^ Cellulomonas biaxotea (Kellerman) Bergey y col., ci-tando Bergey 33 especies, de las que i8 son mviles con flagelos per-tricos, ^ mviles con flagelos polares y 8 inmviles.

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C^ BACTRRIAS TERMPII,AS DESTRUCTORAS DE CEI.UI,OSA. - EStegrupo de bacterias no est bien estudiado. McFayden y Blaxall (67)fueron los primeros en observar que las bacterias termfilas que ha-bfan encontrado en el suelo eran capaces de fermentar la celulosa,necesitando veintin das para descomponer el papel de filtro, o laviscosa, a la temperatura de 60^. Como productos de esta descomposi-cin, se formaban cidos actico y butfrico, anhidrido carbnico ymetano. Los organismos productoxes de esta fermentacin no pudieronaislarse en cultivo puro.

Posteriormente, Kroulik (57) realiz investigaciones con ciertosorganismos termfilos, y aun cuando no pudo aislarlos en cultivopuro, mediante el estudio microscpico lleg a la conclusin de que ladestruccin de la celulosa era ocasionada por dos formas distintas: elBacillus II, i, y el Bacitlus II, 2, producindose en ellas cidos frmico,actico y butrico, anh{drido carbnico e hidrgeno, este ltimo encantidades pequeas. El hidrgeno sulfurado, que se formaba ocasio-nalmente en cantidades apreciables, fu considerado como productode la reaccin del hidrgeno formado con los sulfatos del medio. Ladestruccin de celulosa era ms intensa cuando actuaba el Baci-llus II, 2, alcanzando al go por ioo, y aun ms, de la celulosa empleada.

En ig23, Langwell y Hind (58) dieron noticias de una bacteriatermfila destructora de celulosa que produca cidos orgnicos vol-tiles: alcohol etlico, metano, hidrgeno y anhdrido carbnico. Auncuando dieron una descripcin del organismo y un balance de lasreacciones, las investigaciones posteriores no han confirmado estoshechos ni han permitido aislarla.

Finalmente, Viljcen, Fred y Peterson (97), estudiaron la descom-posicin de la celulasa por una bacteria termfila, cuya descripcinmorfolgica dieron, y a la que denominaron Clostridium theymocellum,dudndose de que consiguieran aislarla en cultivo puro, tanto por latcnica empleada (go) como por el hecho de que al cultivarla sobreagar perda la facultad de descomponer la celulosa. Por ello debenacogerse con reserva las propiedades que se le asignaron.

^n su escrito de tg24 afirmaron que cuando se desarrolla entre60^ y 65^, el Cl. thermocellum descompone la celulosa rpidamente,formando un g6,8 por ioo de cida actico y un io por ioo de alcoholetlico a los once dfas de incubacin; en este perodo desaparece del6o al 8o por ioo de la celulosa, quedando el resto formando un sedi-mento amarillento amorfo. En su publicacin de ig26 se hace constarque el rendimiento en alcohol varfa considerablemente.

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[^J BACTERIAS DFSNITRIFICANTES QU$ ATACAN A I.A CEI,UI,OSA. -Algunas bacterias reductoras de nitratos pueden usar la celulosa comofuente de energa, Un medio que contenga o,25 gramos de KNO,,0,05 gramos de K,HPO, y 2 gramos de celulosa en forma de papel defiltro, en ioo c. c. de agua corriente, se coloca llenando completamenteun matraz tapado, que se inocula con cieno y se incuba anaerobia-mente a 3g^. 1~1 ataque de la celulosa empieza en una semana, yviene acompaado de la reduccin del nitrato a nitrito, que a su vezdesaparece en quince das. Renovado el medio, el proceso de reduccinde nitratos se acelera considerablemente. La celulosa toma color ana-ranjado amarillo y consistencia mucilaginosa, descomponindose enfibras, que terminan por desaparecer. I,os gases que se desprendenson una mezcla de nitrgeno con anhdrido carbnico.

Groenewege (45) considera que el proceso de descomposicin dela celulosa en presencia de nitratos es llevado a cabo por la accinsimbitica de dos grupos de organismos: uno descompone la celulosa,mientras que el otro reduce los nitratos usando como fuente de energalos productos formados en la descomposicin de la celulosa. Por laaccin simbitica de los dos organismos desaparece la celulosa msrpidamente que por la accin aislada del organismo espec{fico de Iacelulosa. I,a formacin de gas se inicia al segundo da, acompaada dela reduccin del nitrato a nitrito y xido de nitrgeno, con una disolu-cin gradual del papel. El proceso es sumamente activo cuando la solu-cin de cultivo se renueva por decantacin.

Groenewege aisl las bacterias que intervienen en eI proceso, en-contrando varias estirpes de una bacteria aerobia, Bacterium cella-resolvens, que acta sobre la celulosa, y los productos de la descompo-sicin de sta (cidos actico, butrico y lctico) sirven de alimentoa los organismos desnitrificantes Bacterium o^ialescens y Bacteriumviscosum.