MALDI-TOF-MSによるイメージング質量分析アプリ …MALDI-TOF-MSによる...

MALDI-TOF-MSによる

イメージング質量分析アプリケーション

イメージング？

イメージング（英: imaging）とは、試料の情報を様々な方法で測定して画像化・視覚化すること。あるいはそれに用いられる技術。レントゲン写真はX線イメージングの一例です。

「～イメージング」と記述して、応用の方法によって区別する場合があります。情報技術や医療分野でよく用いられます。

コンピュータ断層撮影(CT)

核磁気共鳴画像法(MRI/MRS)

陽電子放出断層撮影(PET)

MALDI-IMS Research use only


試料の質量電荷比を求めるときに使用される分析法である。

高電圧をかけた真空中で試料をイオン化すると、静電力によって試料は装置内を飛行する。飛行しているイオンを電気的・磁気的な作用等により質量電荷比に応じて分離し、その後それぞれを検出することで、質量電荷比を横軸、検出強度を縦軸とするマススペクトルを得ることができる。

（出典：「質量分析法」 2009年8月8日 (土) 15:39 UTC ウィキペディア日本語版）

質量分析法とは、


Imaging mass spectrometry(IMS)イメージング質量分析

MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization )SIMS (Secondary Ion Mass Spectrometry)

DESI (desorption electrospray ionization)

等のイオン源を搭載した質量分析計を用いタンパク質、ペプチド、代謝物、バイオマーカーや薬物の分布を可視化します。

MALDI-IMS


MALDIによるイオン化の原理

MatrixとSampleの混合結晶

H+

脱離およびイオン化（プロトン化）

LASER

LASERによるMatrixの励起

ソフトなイオン化多価イオンを生成しづらい

Modified from: Lottspeich, Zorbas, eds“Bioanalytik”, Spektrum Akademischer Verlag, 1998and M.Stoeckli et al. Analytical BioChemistry 311 (2002)33-39

分子量で色分け2Dで表示

組織切片全体を分割して測定

DriftAcc

+ + ++ + +


Imaging mass spectrometry(IMS)イメージング質量分析

Principle of MALDI Tissue Imaging

2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000

200 µm pixels

m/z

MALDI-IMS

• XYピクセル状にスペクトルを取得します

• 各シグナルは異なる物質を示します (タンパク質、ペプチド、薬物、代謝物など・・・・)

• 各物質の分布は分子イメージに再構築されます

Research use only

MALDI-MS

MALDIイメージングの原理


MALDI-TOF MS

MALDI-TOF/TOF MS

タンパク質

ペプチド

脂質

薬物（低分子）既知物質

selected reaction monitoring(SRM)

MALDI-TOF MSの特徴

高感度・高分解能測定レンジが広い！

MALDI-Imaging 機種選択

catchfreeze

cryosection-15～-20 °C

CutOCTが無い部分をスライス

MALDI-IMS

OCT compound

Research use only

MALDIイメージング用凍結切片調製


● クライオミクロトーム（Leica等）

● 凍結組織包埋剤（OCTコンパウンド等）

● 冷媒（ドライアイス等）

● 溶媒殺菌用アルコール、エタノール、リン酸緩衝液、milliQ水等

● 組織洗浄用溶媒洗浄溶媒1 ：70% エタノール水（1%グリセロール含有）洗浄溶媒2 ：70% エタノール水洗浄溶媒3 ：100% エタノール

● Coplin Jar 、シャーレ等

● ITOコートスライドガラス：Glass Slides for MALDI Imaging : Part No. 237001

● スライドガラスアダプタターゲット：MTP slide-adapter II : Part No. 235380

● ドライヤー

● 真空乾燥器

Glass Slides for MALDI Imaging Part No. 237001

MTP slide-adapter II Part No. 235380

MALDIイメージング用凍結切片調製-備品例

• 凍結組織OCT compoundを使用しない

• クライオミクロトーム凍結切片 10 ～ 20 µm （10～12μmが適当）

• 導電性スライドガラス（凍結）に保持(#237001 Glass Slides for MALDI Imaging :BDAL)

• 真空乾燥


MALDIイメージング用凍結切片調製-薄切

切片作成後の処理方法例

• 5分間真空乾燥（脳の場合は45分）切片をスライドガラス表面に固定します

• ＊70%EtOH（シャーレ等）で15から30秒洗浄-1回目

• ＊70%EtOH（シャーレ等）で15から30秒洗浄-2回目

• ＊96%EtOHもしくはpure EtOH（シャーレ)で15秒洗浄

• 真空乾燥

• 保存

長期保存の場合は、アルミホイル等で包み冷凍する

＊注意•Neuropeptide等のペプチドを測定する場合は、各ステップを短時間で行う•薬物および脂質を測定する場合は、洗浄ステップを行わずに測定する

“Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation” Schwartz SA, Reyzer ML, Caprioli RM, J. Mass Spectrom. (2003); 38(7): 699-708


MALDIイメージング用凍結切片調製-洗浄

Acquire mass

spectra

DropletsSpray

coating

m/z 18 388

ImagingProfiling

+ + ++ + +

Protein images


マトリックス添加方法

液滴内部では、非局在化が発生します

大きな液滴: 良質なスペクトルが得られますが空間分解能は低下します


MALDIイメージング - マトリックススプレー

エアーブラシ

スプレーの微調整が可能良好のコーティングが可能マトリックス消費量：約1ml

洗浄および使用頻度によりメッキ部分から銅が溶出し、銅アダクトピークが検出される場合がある酸に弱い

TLC-Sprayer

ガラス製であるために銅アダクトの心配が無い

スプレーの微調整が困難一度に多量のマトリックスを消費するマトリックス消費量：約10ml

乾燥窒素圧縮空気（オイルレス）


マトリックス溶液スプレー

テフロンコーティングスプレーチャンバー

スプレーヘッド

光学センサー内蔵

スプレーヘッドとマトリックスリザーバー

コンパクトな装置タッチパネル式コンピュータ内臓


ピンホールの開いた薄いメタルシート

マトリックスリザーバー

ピエゾ素子

ミスト

•振動気化法によるマトリックスエアロゾルの生成

• ノズル、ガスを必要としません

• ソフトな重力による液滴の添加最適な湿度コントロール

ImagePrep スプレーヘッド


ImagePrepマトリックスミストの生成

∅ 20µm

max 50µm

0

10

20

30

40

50

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Diameter [µm]

Fre

quen

cy o

f Occ

urre

nce

[%]

100 µm


液滴のサイズ分布

典型的なスプレーサイクルの散乱光強度

time

scat

tere

d lig

ht

inte

nsi

ty


光学センサー

dryw

et

Time [min]0 15 30

thick thinscat

tere

d lig

ht in

tens

ity


マトリックス調製工程の例

ImagePrep (50µm crystals) マニュアルスプレー

50 µm

Sinapinic acid (20g/l in 50%

acetonitrile)


結晶形の例

脳のTICスペクトル(全スペクトルの総和)

2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000

•低バックグラウンド

• 500-800 ピークを検出


スペクトルのクオリティー

ペプチド・タンパク質領域

MALDI-IMS


アルツハイマー

モデルマウス脳

空間分解能：50 µm

Sample by courtesy of:Matthias RiemenschneiderNeurochemistry and

Neurogenetics,Dept. of Psychiatry and

PsychotherapyKlinikum rechts der Isar,Munich


ImagePrepデータ例


空間分解能：50μmアルツハイマーマウス脳のイメージングMS

Richard Caprioli, Vanderbilt Univ. TN-USAMALDI-IMS Research use only

マウス脳切片から得られたイメージ各イメージはそれぞれ異なる分子量を可視化（前データセットの約1/5）


fleximaging（Imaging MSソフト）とClinProTools（統計解析ソフト）の連携

ROI 1

ROI 2

ROI 3

ROI 4


主成分分析＆クラスタ解析

MALDI-IMS

質量分析/プロテオミクススペシャリスト

臨床医/病理学者

腫瘍

Research use only

ガン研究におけるMALDIイメージング

腫瘍部位

• 組織サンプルにおけるタンパク質の局在分布は、有用な情報が含まれています

• 右図は、組織サンプル中に腫瘍部位が存在する模式です



MALDI-IMS

LC-MS/MS

Research use only

腫瘍部位を切り取り、ショットガン解析によりマーカータンパク質を解析すれば良い！！！



MALDI-IMS

LC-MS/MS

Research use only

腫瘍部位を切り取り、ショットガン解析によりマーカータンパク質を解析！！！

同定されたタンパク質：１０００種類

???



• 現実は右図のような単純なモデルでは表現できません

• 単純なモデルでは不十分です

正常組織

腫瘍部位



浸潤性の腫瘍細胞

カルシノ―マインサイチュ(初期段階の腫瘍)

悪性新生物 (前ガン細胞）

上皮細胞

リンパ球の浸潤

炎症

結合組織

腫瘍は、複合的な細胞集団で構成されています:

腫瘍幹細胞(*)

異なるステージ

異なるクローン

腫瘍の周辺環境(ストローマ）が、腫瘍そのものに影響します:

腫瘍内微小環境

分子生物学的に見た細胞の分化


病理学者の目で見ると・・・

MALDI-IMS

腫瘍

Research use only


Deininger, S., Ebert, M., Fütterer A., Gerhard M., Röcken, C. (2008) J. Proteome Res. 7(12), 5230-5236

Connective Tissue

Tumor Clone 1

Tumor Clone 2

Inflammation

Research use onlyMALDI-IMS Research use only

階層クラスタリング

Milk duct

正常

上皮細胞

カルシノ―マインサイチュ

浸潤性腫瘍細胞

腫瘍細胞(上皮細胞由来)


ヒト乳がん

ガン部位

1mm


乳がんのMALDIイメージング

組織凍結切片マトリックス添加 MALDI質量分析

H&E 染色

Research use onlyMALDI-IMS

MALDIイメージングワークフロー顕微鏡画像と統合

ペプチド・タンパク質の同定

MALDI-IMS


Groseclose et al., J. Mass Spectrom. 42, 254-262 (2007)

Tissue Section


組織から直接タンパク質の同定

MALDI-IMS

• トリプシンで処理を行うことでスペクトルパターンが大きく変化。トリプシン消化物ペプチドのシグナルが多数観測。

• 任意のシグナルを選択し、TOF/TOFによるLIFT測定を行うことで得られるMS/MSフラグメンテーションスペクトルをデータベース検索（MASCOT）することによって組織切片からの直接タンパク同定が可能。

m/z750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

a.u.

m/z750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

a.u.

平均スペクトル m/z 2141（MBP）を可視化

トリプシン処理

未処理

Research use only

トリプシン処理 vs. 未処理

MALDI-IMS

m/z200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Abs. Int. * 1000a T P V V H Fb D E N P V V H F F K Ny R P T V I N K F F H V N E D Q T

73.865a 1

T

174.773y 1

229.684b 2

271.702y 2

344.628b 3

372.656y 3

473.611b 4

471.700y 4

559.678a 5

587.640b 5

584.743y 5

656.727a 6

684.694b 6

P

698.806y 6

755.813a 7

783.757b 7

826.888y 7

854.906a 8

882.855b 8

973.971y 8

991.911a 9

1019.887b 9

H

1121.061y 9

1138.985a 10

1166.872b 10

1258.131y 10

1314.424b 11

1357.223y 11

1443.138b 12

1556.282b 13

1553.384y 13

1641.939a 14

I

1667.452y 14

1796.514y 15

1911.835y 16

1967.675b 17

2040.678y 17

2094.526a 18

R

2140.902y 18

QD y17b3

NP y14b6

PV y13b7

VH y11b9

HF y10b10

FF y9b11

FK y8b12

DEN y16b5

ENP y15b6

NPV y14b7

VHF y11b10

HFF y10b11

FFK y9b12

FKN y8b13

KNI y7b14

QDEN y17b5

NPVV y14b8

FFKN y9b13

DENPV y16b7

HFFKN y10b13

FFKNI y9b14

PVVHFF y13b11

VVHFFK y12b12

VHFFKN y11b13

HFFKNI y10b14

VVHFFKN y12b13

VHFFKNI y11b14

NPVVHFFK y14b12

HFFKNIVT y10b16

NPVVHFFKN y14b13

MASCOT Score: 123

トリプシン処理

未処理

Research use only

例） m/z 2141 Myelin Basic Protein

• MALDIイメージングと LC-MALDIの統合アプローチ

• FFPE（ホルマリン固定）組織および巨大タンパク質の解析が可能


ImageIDTM ワークフロー


空間的プロテオミクス

低分子・脂質領域

MALDI-IMS


空間分解能：20μm


MALDI Imaging －脂質の分布


Different lipid species in mouse brain measured at a spatial resolution of 10 µm on an ultrafleXtreme.

from: Chaurand P et al.

Sublimation of new matrix candidates for high spatialresolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.

Anal Chem. 2012;84(4):2048-54

Lipid Imaging at 10μmSmartbeam laser: Industry-leading performance in MALDI imaging at 2 kHz

低分子薬物

MALDI-IMS


MALDI-IMS

光学イメージ

薬物代謝物 1

代謝物 2

代謝部 3

MALDIイメージングは、薬物イメージングのための放射性標識を必要とせず、薬剤と代謝物を区別することができます

Research use only

ラット全身：薬物・代謝物のイメージング


SRM (Selected Reaction Monitoring)によるImagingMS

構造は異なるが分子量が同じ物質

イオンセレクタで標的イオンを選択しMS/MS測定MS/MS

MS/MS2MS/MS1

m/z

interest peaks

MS

イメージングの結果各物質の分布が明確に表示される

SRMにより最も選択的なモニタリングが可能となる


MALDIイメージングの新機能SRM (Selected Reaction Monitoring)


FAST-SRM Imaging

プリカーサ、プロダクトイオンを入力

自動的に最適なリフレクタ電圧が算出される


FAST-SRM設定


100mg/kg p.o. 2h 100mg/kg p.o. 6h

Control 20mg/kg p.o. 2h 20mg/kg p.o. 2h







OLZ(m/z 313)

N-desmethyl metabolite (m/z 299) オーバーレイ

Research use onlyサンプル提供 : 京都府立医科大学池川雅哉先生

オランザピン(OLZ)MS-IMS

control

8mg/kg p.o. 2h

20mg/kg p.o. 2h

100mg/kg p.o. 2h


オランザピン(OLZ)SRM-IMS(m/z 313->256)


ハードディスク表面潤滑剤の直接質量分析

CH2CF2 OCF2 OCF2CF2 OCF2CH2 O CH2OCH2 CHOH

CH2OHCH

HOCH2

HO m n


CH2CH

HOCH2

HO m n

CH2 CHOH

CH2OHO

末端基の異なる2種類の混合物

潤滑剤の分子構造

60

使い捨てターゲット用アダプタ

に

SEM用カーボンテープ

で貼付

準備：ターゲットプレートへのマウント

61

塗布前溶液からの通常測定ハードディスクからの直接測定

sample 1

PFPE A:Bmix ratio

100 : 0

sample 2

PFPE A:Bmix ratio

98 : 2

sample 3

PFPE A:Bmix ratio

79 : 21

sample 4

PFPE A:Bmix ratio

0 : 100

BS01_NaTFA 0:D13 MS

0

1000

2000

3000

4000

5000

Inte

ns.

[a.u

.]

BS02_NaTFA 0:F14 MS

0

1000

2000

3000

4000

Inte

ns.

[a.u

.]

BS04_NaTFA 0:I14 MS

0

2000

4000

6000

8000

Inte

ns.

[a.u

.]

BS06_NaTFA 0:L14 MS

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10

Inte

ns.

[a.u

.]

1000 1500 2000 2500 3000m/z

Mn; 1849.7Mw; 1919.7

Mn; 1969.9Mw; 2038.1

Mn; 2065.0Mw; 2124.3

Mn; 2078.0Mw; 2133.9

BS01Disk_NaTFA 0:E16 MS

0

250

500

750

1000

Inte

ns.

[a.u

.]

BS02Disk_NaTFA 1:C14 MS

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

4x10

Inte

ns.

[a.u

.]


0

2000

4000

6000

8000

Inte

ns.

[a.u

.]


2000

4000

Inte

ns.

[a.u

.]1000 1500 2000 2500 3000

m/z

Mn; 1748.2Mw; 1825.0

Mn; 1988.1Mw; 2080.4

Mn; 2069.8Mw; 2150.9

Mn; 2086.8Mw; 2168.7

実際の工業部品上の単分子膜からでも通常測定と同様の測定が可能

予備実験：通常測定との比較

数平均分子量

0

1000

500

1500

No.1 No.2 No.3 No.4

末端基

Bの比率

(%)

0

40

20

60

No.1 No.2 No.3 No.4

Endgroup A

Endgroup B


CH2OHCH

HOCH2

HO m n


CH2CH

HOCH2

HO m n

CH2 CHOH

CH2OHO

No.1 大量生産開始時No.2 大量生産終了時No.3 No.2原料溶液成分調整後大量生産（2回目）開始時No.4 No.3を用いた大量生産（2回目）後

ディスクサンプル直接測定

原料溶液

実験1：ハードディスクメディア大量生産時の変化

B

C D E F

A

2mm 2mm 2mm 2mm

2mm

m/z 1375.1(Mono)

m/z 1383.1(Bis)

m/z 1673.5(Mono)

m/z 1680.5(Bis)

A; ハードディスク表面写真；赤枠・・・劣化試験領域/黄枠・・・測定範囲B; 平均スペクトル（約1500スペクトル分）C; m/z 1375.1を可視化， D; m/z 1383.1を可視化E; m/z 1673.5を可視化， F; m/z 1680.5を可視化

実験2：劣化試験後評価（Imaging MS）

MALDI-IMS

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