7

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pemeriksaan Mikroskopis MalariaDiagnosis yang akurat dari infeksi malaria sangat penting untuk mengurangi komplikasi dan kematian. Infeksi malaria tidak dapat didiagnosis secara klinis sebagai mana tanda-tanda klinis dan gejalanya menyerupai penyakit infeksi tropis lainnya dan oleh karena itu harus dikonfirmasi dengan diagnosis laboratorium. Secara sederhana, pengamatan mikroskopis secara langsung dari spesimen darah untuk mengamati parasit malaria masih merupakan gold standard untuk diagnosis malaria. Mikroskop adalah alat yang paling banyak digunakan untuk mendiagnosis malaria pada tingkat perifer. Di tangan yang terampil mikroskopi sangat sensitif bagi parasitemia 50 /L ( 0,001 % ) dan dapat memberikan informasi penting seperti spesies, tahapanan ( morphology ) parasit dan kepadatan parasit. Namun, kualitas yang baik dari mikroskop sulit untuk diterapkan dan dipelihara.[1,5,7]Diagnosis mikroskopis malaria dilakukan dengan pewarnaan sediaan darah tebal dan tipis pada slide yang terbuat dari sampel darah perifer yang sama untuk memvisualisasikan parasit malaria. Sediaan darah tebal digunakan untuk mendeteksi parasit malaria, dan sediaan darah tipis digunakan untuk menentukan spesies parasit. Jika sediaan darah tebal memberikan hasil postif, spesies harus ditentukan dengan pemeriksaan sediaan darah tipis. Ada banyak metode yang dijelaskan untuk pewarnaan sediaan darah untuk diagnosis malaria, termasuk Giemsa, Leishman, dan Field. [3,4,5,7]Semua sediaan apusan darah untuk diagnosis malaria harus diperiksa oleh dua pengamat terlatih. Para pengamat kedua dapat memeriksa sediaan darah secara bersamaan atau bergantian. Pengamat kedua harus memiliki pengalaman yang signifikan dalam diagnosis malaria dan harus tetap memperbaharui keterampilannyan dan ilmu pengetahuannya. Pengamat mengkonfirmasikan keberadaan dan spesies parasit malaria dan juga harus memastikan hitung parasit secara benar. Namun, tidak diharapkan bahwa jumlah parasit kedua akan persis sama dengan yang pertama karena batas kepercayaan dari jumlah rendah cukup lebar dan perubahan perhitungan hanya boleh dikeluarkan jika perhitungan pertama tidak benar. [4,8]Sedian darah tebal harus diperiksa oleh dua pemeriksa dengan kekuatan minimal 200 lapang pandang untuk setiap pemeriksa. Karena volume darah yang diperiksa lebih besar sediaan darah tebal lebih sensitif dibandingkan dengan sediaan darah tipis ( turun menjadi sekitar 40 parasit per uL atau 1 parasit per 200 sel darah putih ). Meskipun sediaan darah tebal lebih sensitif untuk mendeteksi adanya parasit malaria, tetapi tidak sangat berguna dalam speciating parasit, dimana ini harus dilakukan dengan menggunakan sediaan darah tipis. Jika pengamat tidak yakin apakah parasit malaria yang hadir dalam sediaan darah tebal, sediaan darah tipis harus diperiksa secara keseluruhan dengan 100kali tujuan, dimulai dengan tepi dan ekor di mana sel-sel terparasit mungkin lebih sering didapatkan.[3,7,8]

2.2 Prosedur Pemeriksaan Mikroskopis Beserta InterpretasinyaBerikut langkah pemeriksaan mikroskopis malaria yang diawali dengan pembuatan sediaan darah tebal dan tipis. Sebelumnya siapkan alat dan bahan yang diantaranya terdiri dari : kapas, alkohol, blood lancet, obyek glass (slide kaca), larutan pewarna (Giemsa, Leishman, dan Field), Metanol, air buffer, aseton, botol Coplin, dan mikroskop. Secara singkat, jari pasien dibersihkan dengan alkohol, dibiarkan kering dan kemudian sisi jari yang telah dibersihkan ditusuk dengan jarum atau blood lancet, dan tetes darah ditempatkan pada slide kaca untuk membuat sediaan darah tebal dan sedian darah tipis.[3,7,9]Atau sebagai alternatif, sampel darah bisa diambil dari lengan atas penderita dengan membuat tusukan intradermal dengan jarum ukuran 25 pada permukaan lengan atas. Dimana tusukan seharusnya bukan cairan darah , tapi cairan serosanguinus. Hapusan ini mungkin menunjukkan pigmen yang mengandung leukosit dan menunjukkan bentuk-bentuk yang lebih matang dari Plasmodium falciparum dari pada darah tepi.[3,7]Sediaan darah tipis dibuat dengan cara yang sama seperti untuk setiap apusan darah tepi. Sediaan darah tipis dibuat dengan segera menempatkan tepi slide penyebar dalam tetes darah, menyesuaikan sudut antara slide dan penyebar sampai 45 , dan kemudian mengolesi darah dengan sapuan cepat dan stabil sepanjang permukaan. Sediaan darah ini kemudian diberikan udara kering dan metanol. Sediaan darah tipis harus diwarnai dengan pengecatan giemsa atau lieshman. Jika menggunakan pewarnaan giemsa, sediaan darah tipis kemudian harus diperbaiki dalam metanol selama 1 menit sebelum pewarnaan, pewarnaan giemsa membutuhkan waktu 20-30menit. Sedangkan leishman yang berbasis metanol pewarnaan harus dibiarkan pada slide selama 1 menit sebelum menambahkan air buffer. [3,7,8]Sediaan darah tebal dibuat dengan menempatkan beberapa tetes darah dalam tumpukan pada slide kaca, tetesan darah diaduk dalam gerakan melingkar dengan ujung slide perhatikan untuk tidak terlalu tebal, dan biarkan kering tanpa fiksatif, sediaan darah tebal harus dikeringkan pada 37 C selama 15 menit atau, jika tidak ada urgensi, antara 30 menit dan 1 jam pada suhu kamar dan kemudian harus diberi aseton selama 10 menit dalam botol coplin, dan kemudian melisiskan darah (biasanya dengan air ) untuk selanjutnya dilakukan pewarnaan. Sediaan darah tebal diwarnai dengan pewarnaan giemsa selama 20 - 30 menit atau field yang bisa dilakukan selama 10 detik. [3,7,8]Sedian darah yang telah siap kemudian diperiksa dibawah mikroskop cahaya. Pada pemeriksaan dengan mikroskop cahaya dari hapusan darah dapat dilaporkan jumlah, spesies, dan morphologi parasitnya. Selain memberikan diagnosis malaria pemeriksaan hapusan darah juga dapat memberikan informasi prognostik yang berguna seperti jumlah parasit , jumlah sirkulasi pigemen yang mengandung fagosit dan adanya tahap aseksual akhir parasit yang semuanya berkorelasi positif dengan prognosis yang fatal.[2,7]Pemeriksaan mikroskopis memberi hasil positif jika ditemukan adanya parasit malaria dalam sediaan darah dan negatif jika tidak ditemukan parasit malaria. Hasil pembacaan mikroskopis harus menyebutkan jenis parasit yang ditentukan dari sediaan darah tipis. Kepadatan parasit diukur secara semi kuantitatif dan kuantitatif yaitu : [4,6,8]a. Semi kuantitatif- =Negatif (tidak ditemukan parasit dalam 100 LPB/lapang pandang besar)

+=Positif 1 (ditemukan 1 10 parasit dalam 100 LPB)

++=Positif 2 (ditemukan 11 100 parasit dalam 100 LPB)

+++=Positif 3 (ditemukan 1 10 parasit dalam 1 LPB)

++++=Positif 4 (ditemukan > 10 parasit dalam 1 LPB)

b. KuantitatifKuantifikasi dilakukan dengan menggunakan film tipis, dengan minimal 1000 sel darah merah diperiksa di daerah yang berbeda. Jumlah parasit dihitung per mikro liter darah .[4,6,8]Setiap kali P.falciparum atau P.knowlesi terdeteksi, persentase sel terparasit harus diukur dan dilaporkan segera kepada staf klinis yang bertanggung jawab, sebagai derajat keparahan parasitemia yang dapat mempengaruhi pilihan pengobatan. Dalam kasus infeksi ganda, kuantifikasi hanya berlaku untuk P. falciparuma atau P.knowlesi. Hanya parasit stadium aseksual yang harus dihitung.[8]Berikut ini adalah gambaran akan diberikan dari hasil pemeriksaan mikroskopis malaria.

Gambar 1. Gambaran mikroskopis parasit malaria.[7]

Gambar kiri menunjukan photomicrographs dari setiap tahap perkembangan parasit yaitu cincin, trofozoit dan skizon untuk masing masing parasit plasmodium dari P. falciparum, P. vivax, P. malariae dan P. ovale dari film darah tipis. Gambar kanan menunjukan gambaran photomicrographs untuk parasit P. falciparum yang didapat dari film darah tipis (atas), dan film darah tebal (tengah).[7]

2.3 Rapid Diagnostic Test pada MalariaPenelitian terbaru telah mengembangkan metode diagnostik yang dapat diperbandingkan dengan metode yang lazim (konvensional). WHO bersama para ilmuwan, ahli laboratorik, serta peklinik mengembangkan alat uji diagnostik cepat (Rapid Diagnostic Test/RDT) yang mudah dilakukan, tepat, sensitif, dan sesuai biaya (cost-effective). Penggunaan RDT malaria direkomendasikan oleh WHO saat mikroskop tidak dapat dikerjakan. Di daerah non-endemik bisa digunakan sebagai uji pelengkap untuk memberikan hasil yang tepat waktu dalam kasus kurangnya keahlian dalam uji mikroskopis akibat insiden yang rendah, RDT malaria memiliki nilai untuk diagnosis malaria dan memberikan informasi tentang keterlibatan P.falciparum.[2,4,5]Rapid Diagnostic Test (RDT) merupakan suatu pemeriksaan laboratorium yang digunakan untuk mendiagnosis penyakit malaria. Tes ini berdasarkan atas deteksi antigen parasit malaria di dalam darah, dengan menggunakan prinsip immunokromatografi. Test ini sangat bermanfaat pada unit gawat darurat, pada saat terjadi kejadian luar biasa dan di daerah terpencil yang tidak tersedia fasilitas lab serta untuk survey tertentu. Paling sering digunakan adalah dipstick atau tes strip yang dilakukan untuk pengujian antibodies monoclonal yang secara langsung menyerang target antigen dari parasit tersebut.[2,6]Ada beberapa target antigen malaria yang dapat digunakan sebagai sasaran (target) pemeriksaan Rapid Diagnostic Testmalaria antara lain:1.Histidine-rich protein 2 (HRP 2)Adalah suatu protein yang dapat larut dalam air yang dihasilkan pada tahap aseksual dan gametosit Plasmodium falciparum dan diekspresikan di membran sel eritrosit, diproduksi oleh trophozoites dan gametocytes muda P.falciparum. Protein ini terdapat di dalam sitoplasma parasit dan permukaan membran eritrosit yang terinfeksi. HRP-2 banyak dihasilkan oleh Plasmodium falciparum, sehingga merupakan sasaran (target) antigen utama dalam membuat uji diagnostik cepat malaria. 2. Parasite lactate dehydrogenase (pLDH)pLDH adalah enzim glikolitik di Plasmodium sp, yang dihasilkan pada tahap seksual dan aseksual parasit. Antibodi monoklonal pLDH dapat menargetkan semua parasit malaria atau secara khusus dapat membedakan apakah infeksi tersebut akibat parasit P.falciparum atau P.vivax. 3. Aldolase Merupakan enzim kuncipada jalur glikolisis parasit malaria dimana digunakan sebagai target antigen pan malaria yang terdapat pada 4spesies parasit, P.falciparum, P.vivax, P.ovale, dan P.malariae. [1,2,4,6]Sebagian besar RDT malaria menggunakan asas imunokromatografi yang menggunakan antibody monoklonal yaitu HRP-2 (Histidine Rich Protein) untuk Plasmodium falciparum dan pLDH (parasite Lactate Dehydrogenase) untuk mengetahui Plasmodium vivax sebagai indikator infeksi. Catatan bahwa antigen HRP-2 dapat bertahan dalam darah sampai beberapa minggu setelah pengobatan yang berhasil (karena clearance yang rendah), sedangkan pLDH dan aldolase tergantung pada parasit yang hidup dan akan menghilang dari sirkulasi setelah pengobatan. [1,4]RDT mendeteksi plasmodium parasit dalam darah oleh reaksi antigen -antibodi pada strip nitroselulosa. Tes ini didasarkan pada penangkapan antigen parasit dari darah perifer menggunakan antibodi monoklonal yang disiapkan terhadap antigen target malaria dan dikonjugasikan ke salah satu liposom yang mengandung selenium pewarna. Reaksi di strip nitroselulosa terlihat sebagai garis merah muda. RDT ada dalam beberapa bentuk dipasaran. Dual -band RDT malaria kebanyakan dirancang untuk mendeteksi plasmodium falciparum, dengan menampilkan garis kontrol dan garis uji yang menggunakan target histidin rich protein-2 ( HRP-2 ) atau P. falciparum spesifik parasit laktat dehidrogenase ( Pf - pLDH ). RDT malaria Tiga-dan empat -band menampilkan garis kontrol dan dua atau tiga garis uji, satu menargetkan P.falciparum antigen spesifik, baris lain menargetkan antigen umum untuk empat spesies seperti pan-plasmodium spesifik parasit laktat dehidrogenase ( pan - pLDH ) atau aldolase, dan dalam kasus dari RDT malaria empat-band, garis ketiga yang menargetkan Plasmodium vivax khusus pLDH ( Pv - pLDH ). [1,2]Semua tes diagnostik cepat malaria yang tersedia di pasaran saat ini dapat mendeteksi plasmodium falciparum yang merupakan penyebab utama malaria berat dan kematian. RDT dapat mendeteksi antigen HRP-II atau enzim pLDH yang terdapat pada P.falciparum. Pada pasien dengan malaria falciparum berat dapat terjadi sekuestrasi parasit sehingga parasit tidak selalu ditemukan di darah perifer. Oleh karena itu diagnosis infeksi P.falciparum dapat terlewatkan oleh pemeriksaan mikroskopik akibat tidak adanya parasit dalam sediaan darah tepi.[2]RDT memiliki kemampuan untuk membedakan antara spesies, membedakan antara P.falciparum dan bentuk lain dari malaria dan karena pentingnya terapi mengidentifikasi kasus Plasmodium ovale atau Plasmodium vivax, yang pengobatan dengan primakuin diperlukan. Mendefinisikan sensitivitas dan spesifisitas untuk mendeteksi setiap spesies penting bagi program pengendalian malaria untuk dapat memilih tes paling cocok untuk wilayah geografis tertentu . RDT malaria telah menunjukkan sensitivitas mendekati 100 % untuk mendeteksi P.falciparum, spesies yang paling mengancam jiwa. Namun hasil negatif palsu dapat terjadi pada kepadatan parasit rendah (< 100 parasit aseksual/ml atau < 0,002 % dari sel darah merah terparasit). Dalam kasus tersebut, pilihan yang benar adalah untuk mengulang RDT malaria (dan jika mungkin mikroskop) setelah 8 - 12 jam, sampai empat sampel berturut-turut.[2,3]

2.4. Prosedur Rapid Diagnostic Test Beserta InterpretasinyaRapid Diagnostic Testadalah suatu tes yang dapat mendeteksi antigen malaria pada sejumlah kecil darah, biasanya 1015 l menggunakan prinsip imunokromatografi dengan antibodi monoklonal untuk mendeteksi antigen parasit dan biasanya dalam bentuk tes strip. Umumnya terdapat tiga jenis tes strip antara lain sample HRP-2, pLDH test sample 1, dan test aldolase. [2,4]Dalam melakukan pemeriksaan RDT alat dan bahan yang diperlukan yaitu kapas, alkohol, lancet, tabung micro berisi EDTA atau pipa kapiler, pipet tetes, dan dipstick (strip) nitrosellulosa. Pertama dilakukan pengambilan sampel darah yang bisa diambil dari vena siku (cubiti) pada penderita sebanyak 2 ml, dimasukkan ke dalam tabung mikro (micro tube) berisi EDTA, tetapi lebih umum sampel diambil dari jari pasien. Secara singkat, jari pasien dibersihkan dengan alkohol, dibiarkan kering dan kemudian dengan menggunakan pipa kapiler yang tersedia, darah diambil dengan menusuk ujung jari dengan lancet pada sisi jari yang telah dibersihkan dan pastikan bahwa pipa kapiler telah terisi penuh darah. Cara yang sama juga berlaku untuk sampel darah yang diambil dari vena siku (cubiti). Kemudian darah diteteskan pada dipstick (strip) nitrosellulosa.[3,4,9] Hasil dari RDTtersebut akan tampak setelah kurang lebih 10 sampai 15 menit, dalam bentuk garis berwarna merah jambu. Hasil positif akan menunjukan perubahan warna merah jambu pada lokasi tersebut, hal sebaliknya terjadi bila sampel negatif dimana tidak ada antigen yang ditangkap oleh antigen (HRP-2, pLDH, dan aldolase) sehingga tidak terjadi perubahan warna merah jambu pada kertas nitrosellulosa.[4,9]Pada masing-masing strip nitrosellulosa memiliki interpretasi yang berbeda-beda sesuai dengan jenis strip yang digunakan (HRP-2, PLDH, dan aldolase). Berikut ini gambar dari strip nitrosellulosa dan interpretasi hasil pemeriksaannya :

Gambar 2. Interpretasi hasil uji imukromatografi dipstick[4]Interpretasi hasil dari RDT dilihat dari muncul atau tidaknya warna pada tes strip tersebut. Dari gambar strip nitrosellulosa diatas garis yang paling atas (garis pertama/C) merupakan garis kendali (kontrol), Garis dibawahnya (garis kedua/T2) merupakan garis uji untuk Plasmodium vivax, dan garis yang terbawah (garis ketiga/T1) adalah garis uji untuk Plasmodium falciparum. Bila hasil uji untuk Plasmodium falciparum positif, maka garis kendali (kontrol/C) dan garis uji terbawah atau T1 akan berwarna merah muda, sedangkan garis tengah tidak terlihat. Bila untuk Plasmodium vivax positif, maka garis kendali (kontrol/C) dan garis uji kedua atau T2 saja yang akan terlihat. Pada setiap tes yang telah dilakukan warna pada garis kontrol harus muncul, apabila warna pada garis kontrol tidak muncul menandakan bahwa tes tersebut invalid.[2,4,8]

2.5 Perbandingan Pemeriksaan Mikroskopis dan RDT pada MalariaGold Standard (Baku emas) pemeriksaan diagnosis malaria adalah dengan menggunakan pemeriksaan mikroskopis. Tetapi pemeriksaan ini mempunyai beberapa kelemahan seperti diperlukannya ketersedian mikroskop dan tenaga provider yang terampil.[4]Adapun keuntungan dari diagnostik malaria dengan metode mikroskop yaitu : 1. Memungkinkan identifikasi definitif dari spesies yang menginfeksi sebagaimana infeksi campuran.2. Dapat digunakan untuk menentukan besarnya parasitemia.3. Dapat digunakan sebagai pemeriksaan serial untuk memantau efektivitas terapi.4. Memerlukan prasarana laboratorium yang kecil.5. Relatif murah.[3] Meskipun teknologi mikroskop sederhana dan mudah, membuat dan menafsirkan apusan darah untuk malaria membutuhkan keterampilan dan pengalaman yang memadai. Selain itu pemeriksaan diagnostik mikroskopis juga memiliki kelemahan diantaranya :1. Tidak bisa mendeteksi parasitemias yang sangat rendah.2. Kesalahan dalam penafsiran yang paling umum baik dengan parasitemias yang sangat rendah atau sangat tinggi. ( yang mana diagnosis yang akurat sangat penting ).3. Infeksi campuran sering terlewat.4. Tidak berguna di daerah yang tidak endemis malaria karena ketidakmampuan orang yang cukup kompeten membaca hasil untuk membuat diagnosis yang akurat. [3]Rapid Diagnostic Test diindikasikan untuk konfirmasi ada atau tidaknya P.falcifarum dari hasil pemeriksaan mikroskopis hapusan darah terutama saat kurangnya observer yang berpengalaman atau ketika membutuhkan konfirmasi diagnosis yang cepat. RDT bisa menetapkan diagnosis malaria secara praktis, dan cepat. Pada penelitian metode imunokromatografi yang dibandingkan dengan pemeriksaan mikroskopik didapatkan sensitivitas hampir 100%, spesifisitas 96.99%.[4,9]Keunggulan dari RDT sendiri adalah konfirmasi yang dapat dilakukan dengan cepat, pelatihan tenaga yang lebih mudah, tidak memerlukan peralatan dan pengetahuan kusus, prosedur yang sederhana, hasil yang mudah disimpulkan dengan validitas yang hampir sama bahkan lebih baik dibandingkan dengan pemeriksaan mikroskopis. Selain itu juga tidak memerlukan persiapan sedian darah yang relative sulit karena sering kali sedian rusak sebelum diperiksa. Sedangkan kekurangan dari RDT yaitu 1. Kadang kadang terjadi false positive.2. Kurang sensitive dibandingkan dengan pemeriksaan mikroskop.3. Keberaadaan HRP2 antigenanemia dapat member hasil positif saat tidak adanya parasit hidup.4. Spesies tidak bisa dibedakan kecuali untuk kasus P.falcifarum atau P.vivax.5. Kuantifikasi tidak memungkinkan. [8,9]

4