Tinjauan Pustaka Hari, Tanggal : Rabu, 10 September 2014

Teknologi Asam Nukleat Waktu : 13.00 – 16.00

PJP : Puspa Julia Puspita

Asisten : Gia Permasku, S.Si

Rini Kurniasih, S.Si

Asep Didi S.

ISOLASI DAN PEMURNIAN

Kelompok 20

Yoana Puspita Sari (G84110066)

Chelsea . (G84110069)

Renti Efraim (G84110027)

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA Plasmid

Isolasi DNA merupakan proses pemisahan molekul DNA dari molekul-

molekul lain di inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu

visualisasi DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik,

rekayasa genetika, dan amplifikasi DNA (Grunzel et al. 2013). Prosedur isolasi

DNA memiliki tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan yaitu preparasi

ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan

presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan protease) dan RNA

(dengan RNAse). Kualitas DNA yang baik ditentukan oleh kemurnian DNA,

panjang DNA, kemampuan dipotong oleh berbagai enzim, dan tidak mengalami

modifikasi selama proses isolasi berlangsung (Catherine et al. 2014).

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dinding sel dan lisis membran sel

sebagai upaya pemecahan sel, dan presipitasi DNA yang akan dipisahkan

(Syafaruddin dan Tri 2011). Pelisisan membran sel biasanya menggunakan larutan

deterjen kationik, misalnya CTAB karena mampu mengendapkan polisakarida

serta senyawa fenolik, mengurangi kontaminan, mengurangi browning, dan

menjaga DNA agar tidak rusak. Buffer CTAB mengandung komponen seperti

Tris-HCl, EDTA, NaCl, PVP, dan merkaptoetanol. Fungsi Tris-HCl untuk

mendenaturasi protein, NaCl berfungsi sebagai bahan penetral pada gula fosfat

DNA, EDTA akan berfungsi sebagai penghancur sel dengan cara mengikat ion

magnesium yang diperlukan oleh sel untuk menjaga keutuhan selubung sel.

Larutan PVP dan merkaptoetanol dapat mendegradasi senyawa metabolit

sekunder dan mengurangi browning akibat oksidasi (Min et al. 2014).

Pemurnian atau purifikasi DNA plasmid bertujuan menghilangkan

kontaminan seperti senyawa metabolit sekunder, polisakarida, RNA, dan protein.

Plasmid merupakan vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa

DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid adalah molekul DNA utas

ganda sirkular (tidak berujung) dengan ukuran kecil dan terdapat di dalam

sitoplasma, serta mampu bereplikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti

2006).

DNA plasmid biasanya didapatkan dari bakteri, misanya Escherichia coli.

Sebelum DNA plasmid diambil dari bakteri tersebut, terlebih dahulu bakteri

dibiakkan di dalam suatu media yang mengandung campuran zat sebagai nutrisi

yang diperlukan mikroorganisme tersebut untuk pertumbuhannya (Brock et al.

1994). Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan

sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai

ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan

dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil

selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication)

sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara

otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga

terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah

diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap

antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang

membawa gen tertentu (Brock et al. 1994).

Sterilisasi

Proses sterilisasi diperlukan untuk mencegah kontaminan yang muncul

ketika purifikasi DNA. Beberapa macam proses sterilisasi yaitu secara mekanik,

fisik, dan kimiawi. Sterilisasi secara mekanik biasanya menggunakan suatu

saringan dengan pori yang sangat kecil sekitar 0.22-0.45 mikron, sehingga

mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk bahan yang

peka terhadap panhas seperti larutan enzim dan antibiotik.

Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran.

Beberapa cara sterilisasi dengan pemanasan misalnya pemijaran dengan api

langsung, metode panas kering yang biasanya cocok untuk alat terbuat dari kaca

misalnya erlenmeyer dan tabung reaksi, metode uap air panas untuk bahan yang

mengandung air, dan metode uap air panas bertekanan dengan menggunakan

autoklaf. Metode lain dari sterilisasi fisik adalah penyinaran dengan sinar ultra

violet.

Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan desinfektan seperti

alkohol. Penggunaan antiseptik kimia yang mudah menguap, efisien, dan efektif

sangat diperlukan. Penambahan iodium pada alkohol akan meningkatkan daya

disinfeksinya, terutama terhadap spora.

Luria Bertani (LB)

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari

campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk

pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-

molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media

pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan

juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.

Luria Bertani Agar digunakan untuk budidaya dan pemeliharaan strain

rekombinan dari Escherichia coli untuk studi genetik dan molekuler dan dapat

digunakan untuk budidaya rutin mikroorganisme tidak terlalu rewel. Luria Bertani

Agar siap untuk budidaya dan pemeliharaan strain rekombinan Escherichia coli

(Rohaeti et al. 2003)

Fungsi Pelarut pada Isolasi DNA Plasmid

Larutan 1 terdiri atas Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM, dan sukrosa 15%.

Larutan 1 ini berfungsi untuk memecah dinding sel dan mensuspensikan pellet

sampai larut. EDTA dapat menghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA

sebagai pengkelat Mg2+

yang berperan merusak stabilitas membran plasma

sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Selain itu, Tris-HCl juga

berfungsi untuk menjaga pH larutan.

Larutan 2 terdiri atas NaOH 0.2 M dan SDS 1%. Larutan 2 digunakan

untuk mengendapkan dinding sel bakteri. SDS dalam larutan ini berfungsi untuk

menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein, sedangkan NaOH

berfungsi untuk mendenaturasi DNA genomik dan mulai menghidrolisis RNA.

Metode dalam tahap ini memiliki perbedaan dengan isolasi pada DNA kromosom.

Pada isolasi DNA kromosom tidak ditambahkan NaOH, karena jika ditambahkan

maka NaOH akan mendenaturasi DNA dan menghidrolisis RNA yang kita

inginkan, sehingga pada isolasi DNA kromosom tidak ditambahkan NaOH

(Chang 2009).

Larutan 3 berisi Na-asetat 3M, larutan fenol-kloroform, etanol absolut,

etanol 70%, dan dH2O. Na-asetat dengan pH 4.8 akan mengakibatkan terjadinya

renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA karena molekulnya

yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam yang tinggi.

Selain itu, adanya pembentukan KDS (kalium dodesisulfat) yang tidak larut

menyebabkan SDS mudah terbuang. Penambahan Larutan 3 juga berfungsi untuk

mempertahankan pH agar DNA plasmid tidak rusak.

DAFTAR PUSTAKA

Brock TD, Michael TM, John MM, Parker. 1994. Biology of Microorganisms.

Prentice Hall.

Catherine et al. 2014. Supercoiled plasmid DNA purification by integrating

membrane technology with a monolithic chromatography. Journal of

Separation Science Vol. 37 : 1229-1236.

Chang W. 2009. Bioetika sebuah pengantar. Yogyakarta: Kanisius.

Grunzel et al. 2013. Mini-scale cultivationmethod enables expeditious plasmid

production in Escherichia coli. Biotechnology Journal Vol 9: 128-136.

Min et al. 2014. Isolation of DNA using magnetic nanoparticles coated with

dimercaptosuccinic acid. Journal of Analytical Biochemistry Vol. 447:

114-118.

Rohaeti E, Sudia NM, Cynthia LR, Ratnaningsih E. 2003. Pengaruh variasi

komposisi amilosa terhadap kemudahan biodegradasi poliuretan. Jurnal

Matematika dan Sains Vol. 8 (4): 157-161.

Suharsono, Widyastuti U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik

Pengklonan Gen. Bogor: Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan

Bioteknologi IPB

Syafaruddin, Tri JS. 2011. Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang

efisien dan efektif pada kemiri sunan. Jurnal Littri 17(1): 11-17.

LAMPIRAN PERHITUNGAN

Rumus umum M =

1. Bobot Tris HCl 25 mM

Massa =

= 0,151425 g = 151,425 mg

2. Bobot EDTA 10 mM

Massa =

= 0,146125 g = 146,125 mg

3. Bobot sukrosa 15%

Sukrosa sebanyak 15 gram dalam 100 ml akuades

4. Bobot NaOH 0,2 M

Massa =

= 0,4 g

5. Bobot SDS 1%

SDS sebanyak 0,5 gram dalam 50 ml akuades

6. Bobot Na-Asetat 3 M

Massa =

= 0,0204 g = 20,4 mg