Módulo VIII Genética enero 2015

67
MODULO IX. 4.0 INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA DE PROCARIOTES 4.1. Ácidos nucleicos. 4.1.1. Composición, estructura y función genética. 4.2. Biología molecular de genes procariontes. 4.2.1. Replicación del ADN. 4.2.2. Transcripción de la información genética. 4. 2.3. Traducción de la información genética. 4.3. Mutación y reparación del ADN. 4.3.1. Espontanea e inducida. 4.3.2. Mecanismos de reparación.

description

genetica,microbiana,ciencia, bioquimica

Transcript of Módulo VIII Genética enero 2015

Page 1: Módulo VIII Genética enero 2015

MODULO IX.

4.0 INTRODUCCIÓN A LA GENÉTICA DE PROCARIOTES

4.1. Ácidos nucleicos.

4.1.1. Composición, estructura y función genética.

4.2. Biología molecular de genes procariontes.

4.2.1. Replicación del ADN.

4.2.2. Transcripción de la información genética.

4. 2.3. Traducción de la información genética.

4.3. Mutación y reparación del ADN.

4.3.1. Espontanea e inducida.

4.3.2. Mecanismos de reparación.

Page 2: Módulo VIII Genética enero 2015

Antecedentes históricos

1893-1900. Miesher, Wohler: Química y Estructura de las bases nitrogenadas.

4.1. Ácidos nucleicos. 4.1.1. Composición, estructura y función genética.

http://chemistry.tutorvista.com/biochemistry/nucleic-acids.html

Page 3: Módulo VIII Genética enero 2015

Abreviatura Base Nucleósido 5´Nucleótido Ácido

nucléico

A Adenina

2´ Desoxiadenosina dAMP ADN

Adenosina AMP ARN

G Guanina

2´ Desoxiguanosina dGMP ADN

Guanosina GMP ARN

C Citosina 2 Desoxicitidina dCMP ADN

Citidina CMP ARN

T Timina 2´Desoxitimidina (timidina) dTMP ADN

U Uracilo Uridina TMP ARN

2´desoxi guanosina monofosfato dAMP

2´ ribo guanosina monofosfato AMP

Nucleósidos y nucléotidos de los ácidos nucléicos

http://chemistry.tutorvista.com/biochemistry/nucleic-acids.html

Page 4: Módulo VIII Genética enero 2015

Antecedentes históricos

LA MOLÉCULA ENCARGADA DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA. ADN o PROTEÍNAS?

1923. Griffith . Experimento de

Transformación. Factor transformante?

http://www.visionlearning.com/en/library/Biology/2/DNA-I/149

1944. O. Avery.McLeod, La información genética

esta en el ADN (transformante) y no en una

proteína.

1952. Hershey y Chase. Experimento con

fagos marcados.

Page 5: Módulo VIII Genética enero 2015

Antecedentes del modelo Watson-Crick

Chargaff Erwin. 1952. Relación de bases púricas y pirimídicas. A-T/ G-C

Estas observaciones, conocidas como las leyes de Chargaff, se basaron en sus estudios del DNA utilizando técnicas recientes como la

cromatografía de papel y el espectrómetro ultravioleta.

Primera regla: en la molécula natural de DNA las cantidades de guanina igualan las cantidades de citocina, mientras que las cantidades de

adenina igualan las cantidades de timina. Esto llevó a pensar en la estructura doble y complementaria del DNA.

Segunda regla: las cantidades de DNA varían de una especie a otra. Esto llevó a pensar que el DNA, y no las proteínas como se presumía,

era el portador de la herencia

Page 6: Módulo VIII Genética enero 2015

Experimentos de (cristalografía) de difracción con rayos X. Rosalind Franklin y Maurice Wilkins. 1952

Las sustancias regulares como los cristales difractan los rayos X con un patrón característico de acuerdo con su estructura física.

El experimento coloca una fibra (cristal) de ADN en la trayectoria de un haz de rayos X.

El patrón de difracción se obtiene en películas colocadas a pocos centimetros del cristal.

El patrón de difracción es bidimensional que muestra la simetría helicoidal de una molécula en lugar de una tridimensional como si

fuera una cristalografía de rayos X.

“ the molecule had a "helical shape" with repeating distances of 0.34 nm 2nm and 3.4 nm.

Antecedentes del modelo Watson-Crick

http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Nucleic_Acid/DNA/Franklin's_DNA_X-ray_Crystallography

4 cuadrantes simétricos, los ejes

alineados al meridiano y los ejes

perpendiculares a la fibra de ADN se

denominan ecuador:

La fotografía muestra el patrón de

difracción de una fibra de una molécula

«cristalizada» de ADN.

periodicidad de

los repetidos

El patrón en cruz es característica de

una molécula helicoidal con

estructuras repetidas regulares.

Se encontró un patrón que corresponde

a una estructura de dos cadenas de

forma helicoidales

También observaron que los patrones

coinciden y que el diametro de la helice

debera ser constante

El “esqueleto” de fosfato de la pentosa se encuentra hacia el exterior de la

helice y no hacia el interior como se pensaba. Llegaron a esta conclusión

porque trabajaron con las formas hidratadas y deshidrtadas A y B de DNA y

mostraron que el agua se puede unir más facilmente al DNA, lo cual puede

ocurrir si el fosfato esta hacia afuera.

Page 7: Módulo VIII Genética enero 2015

J.D.Watson and F.H.C. Crick. Molecular Structure of Nucleic Acids. Nature 171 (4358) ; 1953 (Apr,25): 737-738.

We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest.

A structure for nucleic acid has already been proposed by Pauling and Corey (1). They kindly made their manuscript available to us in advance of publication. Their model consists of three intertwined chains, with the phosphates near the

fibre axis, and the bases on the outside. In our opinion, this structure is unsatisfactory for two reasons: (1) We believe that the material which gives the X-ray diagrams is the salt, not the free acid. Without the acidic hydrogen atoms it is

not clear what forces would hold the structure together, especially as the negatively charged phosphates near the axis will repel each other. (2) Some of the van der Waals distances appear to be too small.

Another three-chain structure has also been suggested by Fraser (in the press). In his model the phosphates are on the outside and the bases on the inside, linked together by hydrogen bonds. This structure as described is rather ill-defined,

and for this reason we shall not comment on it.

We wish to put forward a radically different structure for the salt of deoxyribose nucleic acid. This structure has two helical chains each coiled round the same axis (see diagram). We have made the usual chemical assumptions, namely,

that each chain consists of phosphate diester groups joining ß-D-deoxyribofuranose residues with 3',5' linkages. The two chains (but not their bases) are related by a dyad perpendicular to the fibre axis. Both chains follow right- handed

helices, but owing to the dyad the sequences of the atoms in the two chains run in opposite directions. Each chain loosely resembles Furberg's2 model No. 1; that is, the bases are on the inside of the helix and the phosphates on the outside.

The configuration of the sugar and the atoms near it is close to Furberg's 'standard configuration', the sugar being roughly perpendicular to the attached base. There is a residue on each every 3.4 A. in the z-direction. We have assumed an

angle of 36° between adjacent residues in the same chain, so that the structure repeats after 10 residues on each chain, that is, after 34 A. The distance of a phosphorus atom from the fibre axis is 10 A. As the phosphates are on the outside,

cations have easy access to them.

The structure is an open one, and its water content is rather high. At lower water contents we would expect the bases to tilt so that the structure could become more compact.

The novel feature of the structure is the manner in which the two chains are held together by the purine and pyrimidine bases. The planes of the bases are perpendicular to the fibre axis. The are joined together in pairs, a single base from

the other chain, so that the two lie side by side with identical z-co-ordinates. One of the pair must be a purine and the other a pyrimidine for bonding to occur. The hydrogen bonds are made as follows : purine position 1 to pyrimidine

position 1 ; purine position 6 to pyrimidine position 6.

If it is assumed that the bases only occur in the structure in the most plausible tautomeric forms (that is, with the keto rather than the enol configurations) it is found that only specific pairs of bases can bond together. These pairs are :

adenine (purine) with thymine (pyrimidine), and guanine (purine) with cytosine (pyrimidine).

In other words, if an adenine forms one member of a pair, on either chain, then on these assumptions the other member must be thymine ; similarly for guanine and cytosine. The sequence of bases on a single chain does not appear to be

restricted in any way. However, if only specific pairs of bases can be formed, it follows that if the sequence of bases on one chain is given, then the sequence on the other chain is automatically determined.

It has been found experimentally (3,4) that the ratio of the amounts of adenine to thymine, and the ration of guanine to cytosine, are always bery close to unity for deoxyribose nucleic acid.

It is probably impossible to build this structure with a ribose sugar in place of the deoxyribose, as the extra oxygen atom would make too close a van der Waals contact. The previously published X-ray data (5,6) on deoxyribose nucleic

acid are insufficient for a rigorous test of our structure. So far as we can tell, it is roughly compatible with the experimental data, but it must be regarded as unproved until it has been checked against more exact results. Some of these are

given in the following communications. We were not aware of the details of the results presented there when we devised our structure, which rests mainly though not entirely on published experimental data and stereochemical arguments.

It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.

Full details of the structure, including the conditions assumed in building it, together with a set of co-ordinates for the atoms, will be published elsewhere.

We are much indebted to Dr. Jerry Donohue for constant advice and criticism, especially on interatomic distances. We have also been stimulated by a knowledge of the general nature of the unpublished experimental results and ideas of

Dr. M. H. F. Wilkins, Dr. R. E. Franklin and their co-workers at King's College, London. One of us (J. D. W.) has been aided by a fellowship from the National Foundation for Infantile Paralysis.

J. D. WATSON F. H. C. CRICK

Medical Research Council Unit for the Study of Molecular Structure of Biological Systems, Cavendish Laboratory, Cambridge. April 2.

1. Pauling, L., and Corey, R. B., Nature, 171, 346 (1953); Proc. U.S. Nat. Acad. Sci., 39, 84 (1953).

2. Furberg, S., Acta Chem. Scand., 6, 634 (1952).

3. Chargaff, E., for references see Zamenhof, S., Brawerman, G., and Chargaff, E., Biochim. et Biophys. Acta, 9, 402 (1952).

4. Wyatt, G. R., J. Gen. Physiol., 36, 201 (1952).

5. Astbury, W. T., Symp. Soc. Exp. Biol. 1, Nucleic Acid, 66 (Camb. Univ. Press, 1947).

6. Wilkins, M. H. F., and Randall, J. T., Biochim. et Biophys. Acta, 10, 192 (1953).

Page 8: Módulo VIII Genética enero 2015

EL MODELO DEL ADN DE WATSON Y CRICK.

J.D.Watson and F.H.C. Crick. Molecular Structure of Nucleic Acids. Nature 171 (4358) ; 1953 (Apr,25): 737-738.

Page 9: Módulo VIII Genética enero 2015
Page 10: Módulo VIII Genética enero 2015

Melting Temperature (Tm)

Tm es el punto medio de la transición entre el estado

nativo y desnaturalizado de la molécula del DNA.

Depende en mucho de la proporción de pares AT/GC

Page 11: Módulo VIII Genética enero 2015

It has not escaped our notice that the specific pairing that we have postulated immediately

suggests a possible copying mechanism for the genetic material". -- Nobel Laureates James Watson and Francis Crick, after solving the structure of DNA in 1953.

La replicación del DNA es de tipo semiconservativa.

Cada una de las cadenas se usa como molde para copiar su información.

Existe un sistema que lleva a cabo el proceso de duplicación o replicación

4.2. Biología molecular de genes procariontes.4.2.1. Replicación del ADN.

Page 12: Módulo VIII Genética enero 2015

Conservativa: podría mantener intacta la molécula de ADN original y

generar una completamente nueva.

Dispersiva: podría producir dos moléculas de ADN con secciones de

ADN viejo (molde) y nuevo.

Semiconservativa: podría producir moléculas con ADN híbrido (viejo y

nuevo) pero, cada molécula híbrida podría estar formada por una

cadena vieja y una nueva.

Page 13: Módulo VIII Genética enero 2015

Experimento de Messelson y Stahl

Page 14: Módulo VIII Genética enero 2015
Page 15: Módulo VIII Genética enero 2015

James Cairns. Autoradiogramas del ADN en replicación

E.coli en crecimiento exponencial. Pulsos de timina marcada.

Lisis celular y obtención de ADN.

Autorradiograma

Horquillas de replicación, en ambas direcciones.

Page 16: Módulo VIII Genética enero 2015

Replicación in vitro. Arthur Kornberg Sr.

La replicación como un proceso mediado por enzimas. DNA polimerasa.

Extractos «crudos» celulares de cultivos de E.coli , purificación de proteínas.

Primer ensayo para la síntesis de ADN.: El ADN es insoluble en TCA, los

nucleótidos sí. El ADN liberado puede separarse por centrifugación. Se

pueden usar nucléotidos radiactivos. si ocurrió la síntesis de ADN alguna

etiqueta de radioactividad será incorporado en el ADN insoluble en TCA. Esto

provee evidencia de que algunos de los nucleótidos etiquetados fueron

polimerizados en una nueva molécula de ADN. Este ensayo de síntesis de

ADN es muy fácil de ejecutar y así mismo es cuantitativo, lo cual significa que

proporciona valores muy confiables y reproducibles que pueden ser utilizados

para calcular cuanto ADN fue hecho y que tan rápido fue la síntesis.

1. Polimerización in vitro DNA con extracto celular (polimerasa) y citosina no

radiactiva.

2. Adición de C radiactiva por periodos cortos, incorporación y detienen la

reacción.

3. Digestión del DNA con fosfodiesterasas 3´y 5´ periodos cortos, detiene la

reacción.

4. Unicamente la fosfodiesterasa 3´libera fragmentos radiactivos.

5. Polimerasa actua 5´a 3´

4.2. Biología molecular de genes. Replicación del ADN

http://www.discoveryandinnovation.com/BIOL202/notes/lecture10.html

Page 17: Módulo VIII Genética enero 2015

Función E. coli Eucariontes

Unión al origen

Helicasa

Prot. de unión a monocadenas

Primasa

Polimerasa 5´-3´

Pinza

Cargador de pinza

Transferencia primasa

a Pol III

Excisión primer RNA

Ligasa

DnaA

DnaB

SSB

DnaG

Pol III (a)

Pol III (b)

Pol III (complejo g)

Pol III ()

Pol I

ligasa

ORC

Mcm2-7

RP-A

primasa (Unida a Pol a)

Pol d (Cad. Retrasada),

Pol a (Cad adealantda)

PCNA

RF-C

RNasaH1, FEN1/RTH1

DNA ligasa I

La maquinaria de replicación en eucariontes es en general similar a la de E. coli

Page 18: Módulo VIII Genética enero 2015

El replisoma es un complejo

proteínico codificado en al

ADN y cuya función

específica es la replicación

exacta del ADN y mantiene la

información genética con el

menor número de cambios.

Page 19: Módulo VIII Genética enero 2015

DNA polimerasas de mamiferos

Asociación con primasa

>>> sintesis de 100-150 nt en

ambas cadenas

Interacción con PCNA (pinza)

>>> elongacion cadena conductora

Page 20: Módulo VIII Genética enero 2015

Las DNA polimerasas de E. coli

exonuclease 5´: excision primer RNA

exonuclease 3´: proofreading Holoenzima DNA pol III

Page 21: Módulo VIII Genética enero 2015

Holoenzima DNA polimerasa III de E. coli

600 kDa

10 polipéptidos

Núcleo catalítico

Dimerización

Switch primer

RNA/ DNA

“pinza”

Complejo g

(cargador de pinza o clamp loader)

10

25

130

´

g

exo 3´-5

(proofreading)

pol 5´-3

Page 22: Módulo VIII Genética enero 2015

g

ETAPA 2

- Cambio de conformacion del dimero b >>

afinidad por el nucleo catalitico (a, e y ZZ) de la

DNA pol >> acercamiento al DNA

núcleo catalítico

g

g

cargador de pinza

(complejo g)

pinza

ETAPA 1

- Formación del complejo de preiniciación:

complejo g + dimero b + DNA

- Hidrólisis de ATP >> energía para la unión del

dimero b al DNA

ATP >>> ADP +P

DNA

Mecanismo de acción del cargador de pinza (“clamp loader”)

Page 23: Módulo VIII Genética enero 2015

La función de las topo isomerasas en la replicación del DNA en procariontes

Durante la replicación, la desnaturalización del duplex de DNA y la progresión de la horquilla de replicación, producen cambios en

la topología de las moléculas de DNA, tales como super enrollamientos positivos y negativos, los cuales deben de ser eliminados

para que pueda progresar la maquinaria de replicación.

Las topoisomerasas son las enzimas responsables de la relajación del DNA

• las toposiomerasas del tipo I relajan el DNA por el corte y la ulterior reparación de una cadena del DNA duplex

• las topoisomeras del tipo II cambian la topología del DNA mediante la rotura y reparación del DNA bicatenario

Las toposiomerasas del tipo I relajan el DNA por el corte y la ulterior reparación de una cadena del DNA duplex

La topoisomerasa I de E. coli elimina superenrollamientos negativos

Importante para eliminar el superenrollamiento negativo producido por otra toposiomerasa ( topoisomerasa II ) y mantener la

densidad superhelicoidal del cromosoma

Mutaciones no letales

Regulación de la transcripción y reparación DNA dañado

Page 24: Módulo VIII Genética enero 2015

1) La DNA girasa (topo II) de E. coli

- 2 subunidades que se activan por hidrólisis del ATP

- esencial para el inicio y la realización de la replicación:

- produce superenrollamientos negativos cerca del oriC, lo que permite la unión de la DnaA

- elimina el superenrollamiento positivo que se forma por delante de la horquilla

Las topoisomeras del tipo II cambian la topologia del DNA mediante la rotura y reparacion del DNA

bicatenario

2) la Topo IV de E. coli es esencial para la terminación de la replicación: proceso de “decatenation”

Page 25: Módulo VIII Genética enero 2015

DNA pol I: exonucleasa 5´-3´y polimerasa 5´-3´

5’-----A-C-A-A A-G-C-A-U-A-C-T-T-A-A-C-T----3’

3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A-A-T-T-G-A----5’

5’-----A-C-A-A-T A-G-C-A-U-A-C-Y-T-A-A-C-T----3’ 3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A—A-T-T-G-A----5’

5’-----A-C-A-A-T G-C-A-U-A-C-T-T-A-A-C-T----3’ 3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A-A-T-T-G-A----5’

5’-----A-C-A-A-T-A-G-C-A T-A-C-T-T-A-A-C-T----3’ 3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A-A-T-T-G-A----5’

exo 5´-3´: eliminación de un nucleótido en 5´

pol 5´-3´: adición de dNTP en 3´

exonucleasa 5´-3´: eliminación de rNMP en 5´

polimerasa 5´-3´: adición de dNTP en 3´

5’-----A-C-A-A U-A-G-C-A-U-A-C-T-T-A-A-C-T----3’

3’-----T-G-T-T-A-T-C-G-T-A-T-G-A-A-T-T-G-A----5’

nick Primer RNA Cadena retrasada

Cadena parental

Elongación 5’-3’

P.

Page 26: Módulo VIII Genética enero 2015

DNA ligasa: Cierra de manera covalente los cortes (nicks ) por que “sella” la unión de los fragmentos de

Okasaki ( unión de los fragmentos de Okazaki) en 4 etapas.

1. Adenilación de la ligasa.

2. Interacción ligasa con 5´-P del Okasaki 2

3. Ataque del 3’-OH del Okazaki 1 sobre el 5´-P del Okazaki 2

4. Enlace fosfodiester entre 3’-OH del Okasaki 1 y 5’-P del Okasaki. 2

5. Liberación AMP y ligasa

Okazaki 1

3’ 5´

5’ 3´

cadena

molde

Okazaki 2

Page 27: Módulo VIII Genética enero 2015

Etapas de la replicación del ADN procariote.

A. Formación de la horquilla de replicación.

Relación entre el tiempo de início y el rango de crecimiento.

Las cadenas deben separarse para que actúen como molde.

1. Complejo de preiniciación

a.- Complejo Abierto: 45, pb, ATP y dos proteínas de unión a ADN: HU (tipo histona) y DnaA se unen a OriC

Locus OriC: 5 cajas DnaA (AT) , se une un multímero de 20 DnaA a expensas de ATP por HU

Proteínas de unión a DNA de una cadena: SSB recubren las cadenas separadas evitan reasociación

b.- Unión al DNA de Helicasa (DnaB): es transportada de un complejo DnaB : DnaC : ATP

Helicasa (DnaB): helicasa de la horquilla de replicación, rompe puentes de hidrogeno entre los pares de bases, es procesiva, se une a la

cadena rezagada, se mueve 5´- 3´, desplazando el molde lider. Usa ATP .

DnaB

Se sintetiza como monómero y actúa como dímero.

Se une a DNA de cadena sencilla.

Dependiente de la hidrólisis del ATP.

Polaridad 5´-3´

Helicasas

Catalizan el desenrrollamiento de las moléculas de nucleicos (DNA o

RNA) de doble cadena-

Facilitan varios procesos biologicos: replicación, transcripción,

recombinación, reparación….

Page 28: Módulo VIII Genética enero 2015

2. Necesidad de la DNA girasa (topoisomerasa II) A medida que avanza la helicasa DnaB, se introducen fuerzas de tensión

a la molécula de ADN.

Sí DNA E.coli replica 1000 nucleotidos / seg y hay 10.5 pb por vuelta, se

introducirían 95 super enrrollamientos por segundo ¡

La girasa cambia los superenrrollamientos positivos a negativos a

expensas de ATP para liberar el estrés tensional

También se requiere para formar la horquilla de replicación

Page 29: Módulo VIII Genética enero 2015

Proteínas de unión a monocadenas (SSB): mantenimiento

de la conformación optima del molde, impiden reasociación.

- Unión de un monómero

a la cadena sencilla de

DNA

- Estabilización de la

cadena previamente

desenrollada por la DnaB

(helicasa)

- Prevención de la

reformación de los

enlaces hidrógenos entre

ambas cadenas

- Unión

cooperativa de

varias SSB

potencializacion

del efecto

Page 30: Módulo VIII Genética enero 2015

Prot. de unión a monocadenas (SSB)

- impiden reasociación de las cadenas

Burbuja de replicación

(2 horquillas)

Proteina DnaG (= Primasa)

RNA polimerasa dep de DNA

sintetiza iniciador de RNA

parte del primosoma con DnaB

CUERPO DE REPLICACIÓN REPLISOMA

Page 31: Módulo VIII Genética enero 2015

B. REPLICACIÓN DEL DNA. FORMACIÓN DEL REPLISOMA. ¿ Como se usan las dos cadenas como moldes para ser copiadas en la horquilla durante la replicación.? Para el funcionamiento de las DNA polimerasas se requiere la participación de una RNA polimerasa o Primasa (DnaG). Sintetiza un iniciador (primer) de RNA corto 5- 60 nucleotidos. Las DNA polimerasas III, II y I, requieren 3 ÓH libre, dNTP´s, y la síntesis es de 5´ a 3´ ¿ Sí la horquilla de replicación es un complejo cerrado y las cadenas son antiparalelas, como puede moverse el replisoma en el mismo sentido?

Page 32: Módulo VIII Genética enero 2015

Fragmentos de Okasaki. Síntesis discontinua del DNA DNA pol III no solo alarga ambas cadenas sino que permanece en la horquilla de replicación. Sintetiza el extremo 3´que quedaría más alejado en fragmentos cortos de 1000 nucleótidos La cadena copiada en fragmentos cortos se llama “retardada” (lagging)

La cadena copiada en fragmentos largos se llama “lider” (leading)

Page 33: Módulo VIII Genética enero 2015

C. TERMINACIÓN. Región de terminación: locus con secuencias específicas Ter en seis

grupos Ter A,B,C,D,E y F.

Dos grupos A,D,E y C,B y F. Evitan la rotación de la horquilla de replicación

Proteina TUS (terminator utilization sustance) se une a grupos TER y desvia

la horquilla en un solo sentido

Se sugiere que inhibe a la helicasa

D. PARTICIÓN CROMOSÓMICA: Separación y segregación de los

cromosomas hijos.

Page 34: Módulo VIII Genética enero 2015

en una ciencia como la Genética no debería emplearse la palabra "dogma" ya que como acabamos de ver en muy

poco tiempo el fundamento central de la Biología Molecular propuesto por Crick tuvo que ser modificado

http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/grupod/Transcripcion/Transcripcion.htm

Proteómica Genómica

Transcriptómica

Genómica, Transcriptómica y Proteómica

Page 35: Módulo VIII Genética enero 2015

Genómica, Transcriptómica y Proteómica

Tres niveles básicos de información biológica:

Genoma: la información genética común a todas las células del organismo.

Transcriptoma: la parte del genoma que se expresa en una célula en una etapa específica de su desarrollo.

Proteoma: las proteínas que interactuan para dar a la célula su carácter individual.

Del GENOMA estático, único al PROTEOMA dinámico, múltiple.

http://www.unavarra.es/genmic/docbiomica/transcriptomica.pdf

Page 36: Módulo VIII Genética enero 2015

http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/actabiol/article/view/19283/27971

Un gen es la unidad básica de la herencia, y porta la

información genética necesaria para la síntesis de una

proteína (genes codificantes) o de un ARN no

codificante (genes de ARN). Está formado por una

secuencia promotora, que regula su expresión, y una

secuencia que se transcribe, compuesta a su vez por:

secuencias UTR (regiones flanqueantes no

traducidas), necesarias para la traducción y la

estabilidad del ARNm, exones (codificantes) e

intrones, que son secuencias de ADN no traducidas

situadas entre dos exones que serán eliminadas en el

procesamiento del ARNm.

Page 37: Módulo VIII Genética enero 2015

https://genmolecular.files.wordpress.com/2007/12/geneucaconproteinaovoalbc3baminaefnuncoredu.jpg

Los genes de las bacterias y de los organismos superiores se diferencian en su organización. El genoma bacteriano es muy pequeño y debe reducir la

información al mínimo posible. El genoma humano es tan amplio que se dice que solo el 10% posee genes, así que muchas regiones no codificantes

rodean a los genes e incluso estan dentro de ellos INTRONES) o sea son genes discontinuos poseen intrones y EXONES (regiones codificantes) que

luego se arreglan en el splicing.

Estructura génica eucariote

Page 38: Módulo VIII Genética enero 2015

Los genes de las bacterias y de los organismos superiores se diferencian en su organización. El genoma bacteriano es

muy pequeño y debe reducir la información al mínimo posible

Page 39: Módulo VIII Genética enero 2015

2. Transcriptoma. Transcripción de la información genética en procariotes

Mecanismo mediante el cual una cadena de DNA es

utilizada como molde por RNA polimerasas específicas

para generar los tres tipos de RNA conocidos:

1. RNA Mensajero (mRNAs): Es una copia de la información

contenida en el DNA y a su vez es usada por la maquinaria de

traducción para transformarla en una proteína.

2. RNA de Transferencia (tRNAs): forma enlaces covalentes entre

aminoácidos y reconoce las secuencias codificadas en los mRNAs y

permite la inserción correcta del aminoácido permitiendo el

alargamiento del péptido.

3.RNA Ribosomal (rRNAs): moléculas pequeñas que se ensamblan

con numerosas proteínas para dar lugar a los ribosomas. Reconocen el

mRNA forman los sitios de síntesis de proteínas. Las proteínas poseen

actividad catalítica.

http://www.unavarra.es/genmic/docbiomica/transcriptomica.pdf

Genes de ARN. Además de los genes codificantes de

proteínas, el genoma contiene varios miles de genes ARN,

cuya transcripción reproduce ARN de transferencia (ARNt),

ARN ribosómico (ARNr), microARN (miARN), u otros genes

ARN no codificantes. Los ARN ribosómico y de transferencia

son esenciales en la constitución de los ribosomas y en la

traducción de las proteínas. Por su parte, los microARN tienen

gran importancia en la regulación de la expresión génica,

estimándose que hasta un 20-30% de los genes del genoma

humano puede estar regulado por el mecanismo de

interferencia por miARN. Hasta el momento se han

identificado más de 300 genes de miARN y se estima que

pueden existir unos 500

Page 40: Módulo VIII Genética enero 2015

Transcripción de la información genética en procariotes

RNA.

Compuesto por nucleótidos: gpo fosfato, ribosa y base nitrogenada.

Guanina (G), Citosina (C),Uracilo (U) y Adenina (A).

Existe complementaridad: U:T, G:C

Pueden presentarse estructuras secundarias.

Page 41: Módulo VIII Genética enero 2015

BIOSÍNTESIS DE RNA: Se puede usar CUALQUIERA de las dos cadenas del DNA para

COPIAR SU INFORMACIÓN en una molécula de RNA mensajero.

La CADENA QUE SE COPIA se ha denominado de diversas maneras: CADENA MOLDE

(TEMPLATE), CADENA MENOS (-), SU SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS ES

COMPLEMENTARIA AL RNAm.

La cadena que NO SE COPIA se conoce como: CODIFICANTE, NO MOLDE, POSITIVA

(+). Su secuencia es idéntica a la del RNAm

El RNAm que se sintetiza y su secuencia de nucleótidos es ANTIPARALELA a la cadena

MOLDE.

El extremo 3´OH del RNAm es antiparalelo con el 5´OH de la cadena molde.

Page 42: Módulo VIII Genética enero 2015

LA RNA POLIMERASA Y EL PROMOTOR Sintetiza los tres tipos de RNA en bacterias, los eucariotes tienen tres nucleares y una

mitocondrial.

GEN (CISTRON): Secuencia del DNA involucrada en la síntesis de una cadena

polipeptídica (región codificante), incluye las regiones que preceden (promotores) a la región

codificante y las posteriores (terminadores) (lider y atrasada; leader and trailer), así como que

las secuencias que separan (intrones) las secuencias codificantes (exones)

REGIONES PROMOTORAS DE LA TRANSCRIPCIÓN (SEÑALES PARA EL INICIO):

Secuencias de nucleótidos cortas similares rio arriba (upstream), indican el inicio de la región

codificante (downstream), -10 Pribnow box

Page 43: Módulo VIII Genética enero 2015

Transcripción de la información genética en procariotes

Todas son dependientes de DNA

Procariotes: la síntesis de RNA depende de la actividad de una sola RNA polimerasa.

Eucariotes existen tres diferentes RNA polimerasas: RNA polimerasa (pol) I, II y III.

Cada polimerasa es responsable de la síntesis de tipo de RNA.

RNA pol I sintetiza rRNA synthesis (excluyendo 5S rRNA). 28S, 5S 5.8S.

RNA pol II sintetiza mRNAs y algunos RNAs nucleares (snRNAs) invoucrados en el

proceso de RNA splicing.

RNA pol III sintetiza tRNAs, the 5S rRNA y algunos snRNAs.

Page 44: Módulo VIII Genética enero 2015

Subunidad Gen Masa

(daltons)

Número Localización Posibles

funciones

rpoA 40,000 2 Núcleo Ensamble del

complejo

rpoB 150,000 1 Núcleo Unión de nucleótidos

´ rpoC 160,000 1 Núcleo Unión DNA molde

rpoD 32 –

92,000

1 Holoenzima Unión al

promotor

RNA polimerasas de Eubacterias

Gen Masa Uso Secuencia -35 Separación Secuencia -10

rpoD 70,000 General TTGACA 16-18 pb TATAAT

rpoH 32,000 Choque Térmico CCCTTGAA 13-15 pb CCCGATNT

rpoN 54,000 Met. Nitrógeno CTGGNA 6 pb TTGCA

fliA 28,000 Flagelar CTAAA 15 pb GCCGATAA

E.coli posee varios factores sigma que reconocen promotores con diferentes secuencias consenso

Page 45: Módulo VIII Genética enero 2015
Page 46: Módulo VIII Genética enero 2015

El factor sigma reconoce las secuencias de nucleótidos en la región promotora.

Cuatro regiones conservadas en todos.

Regiones 2 y 4 reconocen las cajas –10 y –35 del promotor.

Otra parte de la región 2 tiene actividad desnaturalizante de DNA.

Regiones 361-390 necesarios para unirse a las otras subunidades.

El extremo N terminal evita que se una a DNA en ausencia del núcleo de la enzima.

Page 47: Módulo VIII Genética enero 2015

Aminoacidos específicos en la alfa helice del factor sigma interactúan en las regiones promotoras.

Page 48: Módulo VIII Genética enero 2015

I. INICIACIÓN.

a. Formación del Complejo Cerrado: (DNA duplex/RNA pol)

b. Formación del Complejo Abierto. No

requiere helicasa o una nucleotido

trifosfatasa. Superenrrolamiento

negativo lo favorece

c. Unión de los ribonucleótidos de

iniciación: En +1, con ATP o GTP

cuyo 3´OH ribosa libre, lo usa el

nucleótido siguiente.

El nuevo RNA sintetizado tiene un

trifosfato´en su´extremo 5´. Se

libera sigma ¡

ETAPAS DE LA TRANSCRIPCIÓN.

Page 49: Módulo VIII Genética enero 2015

II. ALARGAMIENTO

Después de aprox 12 nucleotidos.

La polimerasa se mueve hacia delante formando la “burbuja de replicación” de 18 pb.

Se forma un hibrido transitorio RNA / DNA que favorece la unión de la enzima al DNA.

Rango de alargamiento en E.coli 40-.50 nucleotidos / seg.

Corresponde con el rango de síntesis de proteínas. El rango de aminoácidos adicionados

es 16 / seg.

El mensajero debe moverse en los ribosomas: 48 nucleotidos (16 codones) / seg

La posición de la Polimerasa determina cual cadena actúa como molde.

Page 50: Módulo VIII Genética enero 2015

• RNA polimerasa adiciona 50 bases / seg

• no tiene actividad de nucleasa, si presenta errores no los corrige.

• 1/ 10000-100000, no heredables

II. ALARGAMIENTO

Page 51: Módulo VIII Genética enero 2015

II. TERMINACIÓN. 1. Terminación dependiente de secuencias terminadoras. • Aprox 40 pb en el molde, segmento rico en G-C seguido por 6 ó mas A´s. • Las secuencias correspondientes en RNA son capaces de formar una estructura

secundaria consigo mismas. • Origina una sección tipo rizo o bucle. Hairpin loop. Seguido de un poli U´s • Esta estructura sirve como terminador y disocia RNApol-DNA.

Page 52: Módulo VIII Genética enero 2015

2. Terminación dependiente de rho. • RNA sin señales de terminación • Actividad de ATPasa, hexámero • Se une a RNA naciente en sitio

específico rut . Rio arriba (5) del sitio de pausa de la polimerasa

• Hacia la burbuja de transcripción. • Disocia el complejo RNA

polimerasa-DNA.

Page 53: Módulo VIII Genética enero 2015

Los mRNA policistrónicos presentan varias secuencias Shine-Dalgarno

Una secuencia en el rRNA 16S es complementario a la secuencia Shine-Dalgarno.

Page 54: Módulo VIII Genética enero 2015

IV. PROCESAMIENTO DEL RNA DE TRANSFERENCIA Y RIBOSOMAL.

RNA RIBOSÓMICO.

E. coli 7 genes 30S: RNAr 16S, 23S, 5S y uno o más RNAt.

5´ 16S-tRNAIle-tRNAAla-23S-5S-tRNAAsp-tRNATrp 3´

Después de metilarse, se rompe en transcritos rRNA´s 17S,25S, y 5S y tRNA´s correspondientes.

RNA DE TRANSFERENCIA.

El transcrito primario es procesado removiendo los extremos 3´y 5´por actividad de RNasaP y una

endonucleasa.

Rnasa: ribonucleoproteína donde el RNA presenta ACTIVIDAD CATALITICA.

RIBOZIMA otro ejemplo: peptidil transferasa.

3´ una pieza es removida por una endonucleasa y después una RNAasa D que genera un extremo 3´maduro

17S tRNA17

S

25S

Metilación

5S

Hidrólisis

Nucleasa Nucleasa

16S 23S

Page 55: Módulo VIII Genética enero 2015

V. FACTORES (EFECTORES) DE TRANSCRIPCIÓN.

INICIO : PROTEÍNAS DE UNIÓN A SECUENCIAS ESPECÍFICAS EN EL ADN. Ejemplos.

POSITIVOS. FAVORECEN O PROMUEVEN; NEGATIVOS: EVITAN LA TRANSCRIPCIÓN

PRESENTAN MOTIVOS HELICE-VUELTA HELICE

ALARGAMIENTO: ATENUACIÓN POR SECUENCIAS EN EL TRANSCRITO 1º. OPERON

TRIPTOFANO

Page 56: Módulo VIII Genética enero 2015

La información ordenada en genes, contenida en el DNA como una secuencia de

desoxinucleotidos se transcribe a una molécula de RNA mensajero que también es una

secuencia de nucleótidos.

Si las proteínas son, en su estructura primaria, una secuencia de aminoácidos y se sintetizan a

partir de la expresión de la información genética.

¿ Cual es el mecanismo mediante el cual se lleva a cabo la traducción de un tipo de

información molecular en otra?

Búsqueda de un “código” en el cual se encontraran las “letras” que se traducirían en

“palabras” S. Ochoa, Khorana, M.Nirenberg: UUU= fenilalanina

Preparación de mRNA sintéticos de secuencia conocida.

La información contenida en el mRNA consta de “letras” en forma de un codón que equivale

a un triplete de nucleótidos.

Porqué tres y no dos o uno?: VR4,3= 43 = 64 codones, sí son 20 aminoacidos?

Traducción de la Información Genética. Código genético y Síntesis de Proteínas

Page 57: Módulo VIII Genética enero 2015

• Esta compuesto de tripletes de nucleótidos que forman un codón en el mRNA y

especifican un aminoácido.

• No esta traslapado. Los codones se leen de manera sucesiva, cada nucleótido es parte

solo de un codón.

• No es ambiguo. Cada codón especifica para un aminoacido y solo para uno: ACG=

treonina y solo treonina.

• Es degenerado: en contraste cada aminoacido puede estar codificado por más de un

codón.

• Es universal: Casi todos los organismos (bacterias a humanos) usamn el mismo código

genético, excepciones DNA mitocondrial y algunos protozoarios.

El Código Genético

theredfoxatethehotdog

the red fox ate the hot dog

t her edf oxa tet heh otd og

th ere dfo xat eth eho tdo g

Page 58: Módulo VIII Genética enero 2015

El Código Genético

Page 59: Módulo VIII Genética enero 2015

TRADUCCIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS.

LA MAQUINARIA DE LA TRADUCCIÓN GENÉTICA. LOS RIBOSOMAS y tRNA´s

Page 60: Módulo VIII Genética enero 2015

TRADUCCIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS.

LA MAQUINARIA DE LA TRADUCCIÓN GENÉTICA. LOS RIBOSOMAS y tRNA´s

Page 61: Módulo VIII Genética enero 2015
Page 62: Módulo VIII Genética enero 2015
Page 63: Módulo VIII Genética enero 2015

Cargando el tRNA. Formación del aminoacil-tRNA

20 aminoacil tRNA sintetasas, el número de tRNA´s pueden ser más de 20.

Reconocen aminoácidos y tRNA´s (anticodón)

En dos etapas: aa / ATP= aminoacil AMP, ataque al OH de la ribosa 3´tRNA, también 2´OH

Dos tipos de sintetasas: I /2ÓH, II /3ÓH

Clase I requiere una reacción de transesterificación.

Formación de fMet-tRNA fMet iniciador.en procariotes es formil metionina.

Met + un iniciador especial tRNAfMet con la misma sintetasa que carga Met para secuencias internas.

tRNA metionil transformilasa transfiere un grupo formilo del N10 tetrahidrofolato

La transformilasa es capaz de distinguir ente tRNAfMet y tRNAMet

Page 64: Módulo VIII Genética enero 2015

ETAPAS DE LA SÍNTESIS DE

PROTEÍNAS

1.INICIO: Complejo de

preiniciación. Unión de IF1, IF2, e IF3 a la

subunidad 30S Junto con fMet-tRNAMet

(anticodon)

Se unen al mRNA guiados por la

región Shine-Dalgarno. Se localiza el

codón AUG

Se agrega 50S por la hidrólisis de

GTP-IF2 y se libera IF-1, IF-3.

El iniciador fMet-tRNAMet se coloca

en el sitio P y queda libre el sitio A para

el siguiente aminoacil-tRNA.

Los largos mRNA´s de los operones

bacterianos presentan multiples

secuencias Shine-Dalgarno internas

cerca de cada del codón de inicio para

cada proteína

Ya que una subunidad ribosómica

puede unirse a cada región Shine-

Dalgarno, puede ocurrir la síntesis de

diferentes proteínas independiente y

simultaneamente de los multiples sìtios

de unión en los mRNAs policistrónicos.

Shine, J. and Dalgarno, L. (1974) The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA:

Complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. US

Page 65: Módulo VIII Genética enero 2015

2.- ALARGAMIENTO Y TERMINACIÓN.

Codón de iniciación.

Unión del aminoacil tRNA al sitio A: complejo EF-Tu-GTP . Hidrólisis GTP libera EF Tu de A.

Ts desplaza a Tu, libera GDP, GTP desplaza Ts e incorpora Tu.

Page 66: Módulo VIII Genética enero 2015

b.- Formación del enlace peptídico. Ribozima: Peptidil transferasa = RNA 23 S en 50S catalíza el desplazamiento del tRNA al

sitio P vía grupo amino del aminoácido entrante. La cadena polipeptídica se desplaza de P a A

c. Translocación. El ribosoma se mueve un codón hacia 3´cuando tRNA se libera del sitio P y deja libre A para el

próximo a.a.

SE requiere EF-G y GTP.

Page 67: Módulo VIII Genética enero 2015

d. Terminación

Un codón de terminación en sitio A.

Factor de liberación RF se une al codón de

terminación.

RF Estimula a la peptidil transferasa que

hidroliza la unión entre el péptido y el tRNA

en sitio P.

Se disocián los ribosomas, se libera el

péptido.

Unión de IF-3 para evitar reasociación.