M2R - ECM 2009

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Distinction isomérique et quantification de monosaccharides par la méthode cinétique

Thierry FOUQUET 21 septembre 2009

Laboratoire Chimie Provence Spectrométries Appliquées à la Chimie Structurale

Responsable du stage : Laurence CHARLES

A

Résumé

L'analyse isomérique quantitative de trois monosaccharides (D-fructose, D-galactose, D-

glucose), basée sur la dissociation de complexes trimériques simplement chargés formés par

electrospray, a été réalisée selon la méthode cinétique. Divers acides aminés L et cations

métalliques divalents ont été testés afin de choisir les meilleurs systèmes pour la distinction

isomérique et la quantification en mélange. Une forte discrimination est observée pour de nombreux

systèmes, dont le couple serine/Cu2+

et acide aspartique/Mn2+

, qui a été sélectionné pour l'analyse

quantitative. Des effets de compétition pour la formation/ionisation des complexes ont été mis en

évidence, mais une correction par des calibrations trois points assure la justesse et la répétabilité de

la quantification en mélange binaire et ternaire.

Abstract

Quantitative isomeric analysis of D-fructose, D-galactose and D-glucose was achieved using

collision-induced dissociation of electrosprayed trimeric ions with data analysis by the kinetic

method. Several L-amino acids and divalent metal cations were tested to select the best systems for

isomeric distinction and quantitation of each monosaccharide. Very high distinction could be

achieved for most tested systems amongst which serine/Cu2+

and aspartic acid/Mn2+

were selected

for quantitative analysis. Accurate quantitative results were obtained for each analyte in binary and

ternary mixtures using three-point corrected calibration curves, which account for the competition

effects evidenced to occur between sugars for the formation of the trimeric complexes.

B

Préambule

Ce rapport sera sans aucun doute mon dernier écrit à caractère scolaire, tout au moins dont la

portée n’excède pas le seul appât du gain pour une note honorable. Même si la forme et le fond

n’imitent en rien les autres rapports que j’ai pu rédiger jusqu’ici. C’est avec un certain

contentement, et une émotion certaine que je considère cet aboutissement aujourd’hui, et j’invite le

noble lecteur à prendre la mesure de cette charge émotionnelle à travers ces quelques lignes, car elle

ne transparaîtra fort heureusement plus dans le texte.

Que l’on rassure les correcteurs, la fantaisie de cette première personne ne se prolonge que dans

les remerciements ci-après, et laisse place au sérieux le plus absolu pour le reste du document. N’en

déplaise aux autres lecteurs.

Marseille, le 2 septembre 2009.

Remerciements

Mes premiers remerciements vont de toute évidence à Laurence Charles, pour la confiance

accordée en me permettant de réaliser mon stage de fin d’étude dans son laboratoire, ainsi que pour

l’aide précieuse apportée pour les divers travaux réalisés.

Je remercie également le Spectropôle (comme le veut la formule consacrée et usitée assez

largement) pour l’accès privilégié aux instruments. Quitte à choquer l’humaniste, j’adresse une

pensée émue à la QTrap 3200 Applied Biosystems avant que de finir les remerciements envers les

gens, mais j’aurai passé plus de temps en sa bruyante et fraîche compagnie qu’avec quiconque

certains jours heureux. Montaigne me le pardonne, je saluerai aussi le QToF, dont je n’ai

qu’effleuré l’utilisation. Mais enfin, boucher les deux instruments, deux capillaires, briser une

seringue Hamilton et faire du caramel – le tout en six mois – sans citer ces machines serait un

manque flagrant de respect, même envers un spectromètre de masse.

Et sans m’étendre davantage pour ne pas détourner le rare lecteur du but premier de ce

manuscrit, je remercie chaleureusement et d’une traite toutes les bonnes âmes du laboratoire que je

côtoie chaque jour. Eux-mêmes ne liront pas ce texte, mais si par pure fantaisie au détour d’une

pause café sans conversation, l’un d’eux venait à poser ses yeux sur cette page, je sais qu’il sera

assez modeste pour ne pas s’offusquer de l’absence de son nom.

1

Sommaire

�

Table des illustrations et des tableaux ....................................................................... 2�

Introduction ................................................................................................................. 3�

Principes de la méthode cinétique .............................................................................. 5�

Méthode cinétique pour la thermochimie ......................................................................................... 5�

Méthode cinétique pour la distinction chirale .................................................................................. 7�

Méthode cinétique pour la distinction isomérique ........................................................................... 9�

Résultats et discussion ............................................................................................... 11�

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique .............................................................. 11�

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique : variante en ligand fixe ....................... 16�

Quantification en mélange .............................................................................................................. 18�

��

��

Conclusion .................................................................................................................. 26�

Références bibliographiques .................................................................................... 27�

�

2

Table des illustrations et des tableaux

Figures :

Figure 1 : Structure cyclique à six chaînons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés.

Figure 2 : Spectres ESI-MS/MS des deux clusters trimériques [M(réf)2(A)-H]+ avec le système

Cu/Pro, pour la distinction énantiomérique des acides aminés L et D-Tyrosine.

Figure 3 : Spectres ESI/MS-MS des trois clusters [M(réf)2(A)-H]+ des sucres étudiés pour le

système Cu/Ser.

Figure 4 : Comparaison des spectres ESI-MS/MS des clusters trimériques [Fe(Asn)(Thr)(sucre)-H]+�

et [Fe(Thr)2(sucre)-H]+ quant à la fragmentation secondaire.�

Figure 5 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire

liquide �� d’un des sucres.

Figure 6 : Abondance ionique du cluster trimérique [Cu(Ser)2(fru)-H]+ en fonction de la

concentration en D-fructose, pour différentes concentrations en D-glucose (13

C1)

exprimées en mM.

Figure 7 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire

liquide�� d’un des analytes.

Tableaux :

Tableau 1 : Acides aminés L utilisés comme références dans le cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+.

Tableau 2 : Récapitulatif des comportements observés pour une série de références et de métaux en

ESI-MS.

Tableau 3 : Récapitulatif des systèmes potentiellement discriminants pour les trois sucres.

Tableau 4 : Résultats de quantification des fractions molaires en mélange binaire, par une

calibration deux points (standard) et trois points (corrigé) pour les trois

monosaccharides étudiés.

Tableau 5 : Résultats de quantification obtenus pour les mélanges ternaires I, II et III, par la

méthode cinétique corrigée.

3

Introduction

Les sucres constituent la classe la plus riche et la plus complexe de la grande famille des

biomolécules, et leurs rôles variés concernent de nombreux domaines, du transport et stockage de

l’énergie dans le métabolisme des êtres vivants à la reconnaissance cellulaire, en passant par la

structuration de tissus végétaux [1-3]. Leur capacité générale à former avec des métaux de

transitions des complexes polydentates, propriété largement utilisée dans la suite de ce travail, les

rend particulièrement utiles pour le transport de métaux ou de complexes métalliques à travers la

membrane cellulaire [4]. Certains sucres peuvent également être utilisés comme vecteur ou comme

base pour un principe actif, tel que l’acide shikimique (base de fabrication du Tamiflu, antiviral

utilisé dans le traitement de certaines souches de la grippe) ou l’héparine (anticoagulant puissant).

Ces propriétés parmi d’autres motivent la mise en place de techniques d’identification et de

quantification de sucres natifs isomères ou énantiomères, dont les monosaccharides qui constituent

les molécules de base des sucres complexes, en particulier les hexoses et pentoses, formes les plus

représentées.

Les techniques de Résonance Magnétique Nucléaire sont irremplaçables pour la détermination

structurale des saccharides, des équilibres forme ouverte/forme cyclique et anomériques mais sont

rapidement limitées par la complexité des signaux obtenus en mélange. Les méthodes

chromatographiques sont quant à elle très efficaces pour séparer des sucres isomères [5,6] ou

énantiomères [7] mais sont longues à mettre en œuvre.

En revanche, la spectrométrie de masse peut distinguer et/ou quantifier avec succès des sucres en

mélange. La discrimination purement qualitative de pentoses et d’hexoses par comparaison du

profil de fragmentation induite par collision (CID) d’adduits métalliques [8,9], azotés [10,11] ou

plus complexes [12] est une méthode déjà largement utilisée, mais la quantification d’isomères en

mélange binaire ou ternaire nécessite la comparaison de l’abondance de plusieurs ions fragments

dans le spectre MS/MS couplée à un développement d’algèbre matricielle [13]. Une autre méthode,

basée sur des réactions ion/molécule en phase gazeuse, permet de distinguer des composés

énantiomères en comparant la cinétique d’échange d’un ligand entre un adduit chiral et un gaz

neutre, qui varie avec la chiralité de l’analyte inclus dans l’adduit [14]. Toutes ces opérations

peuvent être effectuées grâce à la méthode cinétique développée par Cooks [15] et déclinée sous de

nombreuses formes. Cette méthode, dont les bases sont développées dans la première partie de ce

travail, permet de distinguer et quantifier des composés énantiomèr

l’étude des cinétiques de fragmentation de complexe

d’un ion central, d’une molécule de référence

succès à la distinction et quantification

la distinction isomérique et quantification

pour la distinction isomérique de monosaccharides.

donc une nouvelle application de la méthode cinétiq

en mélange binaire et ternaire de monosaccharides isom

galactose (Figure 1).

Figure 1 : Structure cyclique à six chaî

Les objectifs de cette étude sont dans un

discriminant les trois monosaccharides,

sucres en mélange binaire et ternaire

possible.

de distinguer et quantifier des composés énantiomères ou isomères en mélange

l’étude des cinétiques de fragmentation de complexes dimériques [16] ou trimériques,

central, d’une molécule de référence et d’un des analytes considérés

et quantification chirale d’acides aminés [17] et de sucres [

t quantification de peptides [20], la méthode cinétique a été évaluée ici

pour la distinction isomérique de monosaccharides. Le travail présenté dans ce rapport démontre

donc une nouvelle application de la méthode cinétique permettant la distinction et la quantification

mélange binaire et ternaire de monosaccharides isomères, le D-glucose,

tructure cyclique à six chaînons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés

Les objectifs de cette étude sont dans un premier temps d’obtenir un en

les trois monosaccharides, puis de tester ces systèmes pour quantifier ces mêmes

sucres en mélange binaire et ternaire, dans une gamme de fractions molaires

Introduction 4

es ou isomères en mélange par

] ou trimériques, composés

et d’un des analytes considérés. Déjà appliquée avec

sucres [18,19], ainsi qu’à

la méthode cinétique a été évaluée ici

Le travail présenté dans ce rapport démontre

la distinction et la quantification

glucose, le D-fructose et le D-

nons (pyranose) des trois monosaccharides étudiés.

premier temps d’obtenir un ensemble de systèmes

ces systèmes pour quantifier ces mêmes

de fractions molaires aussi large que

5

Principes de la méthode cinétique

Méthode cinétique pour la thermochimie

La méthode cinétique standard développée par Cooks [15] dans les années 1970 est une méthode

approchée pour la détermination de propriétés thermochimiques, basée sur la mesure des cinétiques

de dissociation compétitive d’un ion cluster. Dans sa forme première, le cluster simplement chargé

est formé d’un ion central monovalent (noté C) coordinant une molécule de référence (notée réf)

dont on connait une propriété thermochimique, et l’analyte considéré (noté A) pour qui ladite

propriété thermochimique est inconnue. La fragmentation de ce cluster est supposée limitée aux

pertes compétitives de la référence et de l’analyte. Dans le cadre d’une expérience ESI-MS/MS, où

le cluster est soumis à dissociation induite par collision, ce processus peut être décrit comme suit :

��

��

��

��

��

��

��

��

φ��

(1)

Les constantes de vitesse de dissociation k1 et k2 reflètent l’affinité de l’analyte et de la référence

pour le cation central C, l’intérêt du spectre MS/MS tenant du fait que ces constantes peuvent être

imagées par l’abondance des ions fragments associés, soit :

�� (2)

Un développement thermodynamique approché [21] permet d’écrire :

�� (3)

où RGP est la constante des gaz parfaits, T la température et �� l’énergie libre d’activation.

Soit dans le cas de deux cinétiques de dissociation, à partir de l’équation (3) :

�� ! � �� (4)

En supposant qu’il n’existe pas de barrière d’activation (�� ) et que les phénomènes

entropiques sont négligés (cf. plus bas), on obtient :

�� ! � ��"� � � �# �� ! � ��"� � �$%% (5)

Méthode cinétique pour la thermochimie 6

La température effective (notée Teff), insérée ici artificiellement pour contourner le fait que les

clusters en phase gazeuse sont des espèces isolées, donc ne sont en équilibre thermodynamique à

aucune température [22], peut trouver un sens plus fondamental en la considérant comme l’énergie

interne d’une population de clusters activés, homogène à une température [23-26], et une origine

plus formelle en utilisant le formalisme de la physique statistique pour obtenir les équations

précédentes, réalisé par Ervin [22] dans le cas microcanonique.

Prenons pour exemple de propriété thermochimique à déterminer pour un analyte A l’affinité

ionique AI pour un ion C+, que l’on définit comme l’enthalpie de la réaction suivante :

&' # & ( ' (a) &)�&� � �"*�+� � �"%�&� ( �"%�' � � �"%�&' � (6)

On définit de la même façon l’affinité ionique d’une référence pour l’ion C+ :

,-.' # ,-. ( ' (b)

&)�,-.� � �"*�/� � �"%�,-.� ( �"%�' � � �"%�,-.' �(7)

Le logarithme népérien du rapport des constantes de vitesses k1 et k2 peut s’écrire :

�� ! � ��"�� $%% � �"*�0� � �"*�1�� $%%� 2�"%�,-.� ( �"%�&' �3 � 2�"%�&� ( �"%�,-.' �3�� $%%

(8)

L’expression (8) peut se réécrire en terme d’affinité ionique d’après les équations (6) et (7) :

�� ! � &)�,-.� � &)�&�� $%% (9)

Si l’affinité ionique du composé de référence est connue, et si l’on dispose d’une série de références

d’affinité ionique AI(réf) distinctes, le tracé du logarithme népérien du rapport des constantes de

vitesse mesuré pour chaque mélange analyte/référence en fonction de ces même affinités ioniques

AI(réf) apporte l’affinité ionique inconnue AI(A) de l’analyte A (en tant qu’ordonnée à l’origine).

Il est à noter que la non-implication des phénomènes entropiques, argumentée par l’absence de

réarrangement pré-dissociatif et d’isomères du cluster, est une approximation simple et assurément

simpliste du problème. Des exemples de non linéarité et d’erreurs conséquentes dans la

détermination de propriétés thermochimiques lui ont d’ailleurs été attribués [27] (ainsi qu’à la

mesure de la température effective), et des premiers pas dans la modélisation des clusters ont

Méthode cinétique pour la thermochimie 7

pointé l’existence d’isomères des clusters et de réarrangements pré et post-dissociation. D’autres

versions de la méthode cinétique (isentropique, étendue) ont d’ailleurs été développées pour tenter

d’inclure l’entropie dans le traitement des données [27-30], malgré les doutes de certains auteurs

quant à leur réelle faisabilité et justesse [31-33].

Méthode cinétique pour la distinction chirale

La méthode cinétique appliquée à la reconnaissance chirale fait bien évidemment appel au même

formalisme que la méthode cinétique standard. Dans ce cas, le cluster utilisé est un complexe

trimérique simplement chargé, composé d’un ion central (noté M), le plus souvent un métal de

transition divalent coordinant deux molécules de référence (notées réf) et l’analyte chiral (noté A),

cluster que l’on notera par la suite [M(réf)2(A)-H]+.

Le principe, similaire à celui de la chromatographie chirale [34], consiste à créer un

environnement asymétrique susceptible de discriminer deux molécules énantiomères par la

différence d’interactions que leur conformation propre impose. Ici, l’ion central crée cet

environnement asymétrique en imposant une proximité entre les molécules de référence, chirales

elles aussi, et l’analyte. Des interactions analyte/référence, analyte/métal et référence/métal sont

ainsi établies et seront, si le système est bien choisi, de force ou de nature différentes selon

l’énantiomère considéré. La fragmentation de ce cluster conduit (dans des conditions appropriées)

aux seules pertes compétitives d’une molécule de référence et de l’analyte. Les constantes de

vitesse associées, imagées par les abondances des ions fragments (notés [M(réf)(A)-H]+ et [M(réf)2-

H]+) dans le spectre MS/MS, seront fonction de la stabilité de ces mêmes ions fragments, qui

dépend des interactions précitées et donc de l’énantiomère lui-même.

Si l’on note Ai un des énantiomères de l’analyte A, le schéma global de fragmentation s’écrit :

�

��

��

��

��

�

�

��

��

�

��

�

��

��

(10)

La mesure de l’abondance d’un des ions fragments re

caractéristique d’un énantiomère pour un système

Par analogie avec le développement thermodynamique effe

on peut relier ce ratio Ri à la variation d’enthalp

Si l’on note Aj un énantiomère de Ai, son ratio Rj s’écrira de la même façon

Figure 2 : Spectres ESI-MS/MS des deux

la distinction énantiomérique des acides aminés L et D

On observe bien sur les spectres MS/MS

relative de l’ion fragment m/z 358

fragment m/z 292 issu de la perte de l

Méthode cinétique pour la distinction chirale

La mesure de l’abondance d’un des ions fragments relativement à l’autre définit un ratio, noté R,

caractéristique d’un énantiomère pour un système M/réf donné. On écrit Ri pour l’énantiomère i

analogie avec le développement thermodynamique effectué dans la méthode cinétique standard,

on peut relier ce ratio Ri à la variation d’enthalpie :

de Ai, son ratio Rj s’écrira de la même façon :

MS/MS des deux clusters trimériques [M(réf)2(A)-H]+ avec le système Cu/Pro

énantiomérique des acides aminés L et D-Tyrosine [45]

On observe bien sur les spectres MS/MS, selon l’énantiomère choisi, la différence d’abondance

358 issu de la perte de l’analyte (L- ou D-Tyr

issu de la perte de la référence (L-Pro) qui induit une forte différence de ratio R.

Méthode cinétique pour la distinction chirale 8

lativement à l’autre définit un ratio, noté R,

pour l’énantiomère i :

(11)

ctué dans la méthode cinétique standard,

(12)

(13)

le système Cu/Pro, pour

[45].

la différence d’abondance

Tyr) par rapport à l’ion

différence de ratio R.

Méthode cinétique pour la distinction chirale 9

C’est ensuite le rapport des deux ratios R mesurés pour chacun des énantiomères, noté Rchiral, qui

détermine la qualité du système pour la discrimination énantiomérique, qui est d’autant plus grande

que ce ratio s’éloigne de l’unité.

�456*78 � �6�9 (14)

L’intérêt de la méthode cinétique à ce niveau concerne sa capacité à quantifier les énantiomères en

mélange. La mesure du ratio R en mélange sera une combinaison des deux ratios des analytes

chiraux i et j pris séparément, puisque les clusters formés pourront contenir chacun l’un ou l’autre

des énantiomères, et par conséquent se fragmenteront selon la cinétique décrite par Ri ou Rj

respectivement.

Les cinétiques de dissociation observées en mélange sont alors une combinaison linéaire des

enthalpies de réaction de chaque analyte, soit :

�� :;�,-.�<&6=9> � "� ;�,-.�� "� ? � @ � ��"6 ( �0 � A� � ��"9�� $%% (15)

où α est la fraction molaire de l’analyte i en mélange i/j

Ce qui se réécrit, en terme de ratio, comme une combinaison linaire semi-logarithmique :

BC�D� � E � BC�DF� ( �G � E� � BC<DH> (16)

La mesure du ratio R, rapport des abondances des deux ions fragments dans le spectre

MS/MS fournit ainsi la fraction molaire (soit l’excès énantiomérique) des deux énantiomères

en mélange puisque les ratios des deux analytes pris séparément sont connus.

D’après Cooks [18], cette dépendance linéaire permet l’utilisation d’une calibration à deux points,

à A6 � I�JK�A6 � 0 (soit la mesure des ratios pour chaque analyte pur), pour caractériser le système.

Méthode cinétique pour la distinction isomérique

Ce même principe de séparation par un environnement chiral, créé ici par la coordination de

deux molécules chirales de référence autour d’un ion métallique divalent, peut être utilisé de façon

tout à fait remarquable pour la distinction d’isomères, comme ce fut réalisé avec succès pour la

distinction isomérique de peptides [20]. Il n’y a bien évidemment qu’une seule évolution de

Méthode cinétique pour la distinction isomérique 10

terminologie par rapport à la méthode cinétique appliquée à la distinction chirale, les principes et

développements étant rigoureusement les mêmes. Riso remplacera Rchiral pour l’évaluation de la

qualité discriminante d’un système M/réf. Le raisonnement peut alors être étendu à un nombre N de

composés isomères, à la condition que l’on dispose de N-1 systèmes M/réf discriminants pour les N

analytes.

La mesure des N-1 ratios en mélange, connaissant le ratio de chaque analyte pris séparément

pour chacun des N-1 systèmes, apporte les N fractions molaires par la résolution d’un système à N-

1 inconnues (le nombre N d’analyte et leur nature étant déjà supposés connus).

L�-MN@KOP�Q��RSSSTSSSUL � 0�QVQKWXJQ � L � 0�-MN@KOP�Q�

RSTSU��<�Y=*-%> � ZA6 � ��<�6Y=*-%>[

6\�]

^

ZA6 � 0[6\� ��L�@�@�VKJQ�J��X-�@�_J�

^

�

11

Résultats et discussion

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique

La première partie du travail concerne bien évidemment la recherche systématique de systèmes

discriminants pour les trois monosaccharides étudiés, D-glucose, D-galactose et D-fructose. De

nombreuses études précédentes, pour l’application de la méthode cinétique à diverses classes de

composés chiraux (acides alpha-hydroxylés, acides aminés, sucres, …) [20,35-38] ont permis de

sélectionner une gamme d’ions centraux et de références possiblement adaptés à notre recherche. Il

n’existe pas en effet de règle bien définie quant à l’adéquation métal/référence/analyte et seules

quelques pistes et constatations empiriques peuvent guider ce choix. L’ion central est ainsi le plus

souvent un métal de transition divalent, Mn2+

, Fe2+

, Co2+

, Cu2+

et Zn2+

[39] (la littérature présente

également l’utilisation de Ni2+

[40], mais les résultats médiocres obtenus avec ce métal ne seront

pas présentés ici). Le calcium Ca2+

est également très utilisé [41,42], puisqu’il permet comme les

ions précédents de coordiner l’ensemble référence/analyte, bien qu’il n’appartienne pas à la classe

des métaux de transition.

Le choix de l’ion central arrêté, une sélection de références potentielles doit être effectuée, en

essayant de suivre quelques « règles » tout à fait empiriques :

� Référence et analyte doivent avoir une affinité ionique similaire pour l’ion central (dans

notre cas une affinité métallique) [40]. Comme ces données sont le plus souvent inconnues (la

méthode cinétique pourrait dans le même temps permettre de déterminer ces affinités [43],

mais l’absence de toute donnée de référence n’a pas permis ce travail), on peut se référer à

l’affinité protonique comme approximation de l’affinité ionique même si cette analogie n’est

pas rigoureuse [44].

� Une analogie structurale et fonctionnelle entre la référence et l’analyte est souhaitable [45],

qui limite alors la variation d’entropie lors de la fragmentation (réarrangement pré et post-

dissociation), variation considérée comme nulle dans la méthode cinétique standard présentée,

ou constante dans la variation isentropique de la méthode [26].

Le choix d’une gamme de référence s’est toutefois porté, et malgré l’importance du second critère,

sur les acides aminés, molécules largement utilisées dans ce rôle [18] et qui, si elles ne respectent la

similarité structurale avec les sucres étudiés, peuvent présenter des fonctions chimiques semblables

ou similaires.

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique 12

C’est le cas de sept des huit acides aminés choisis :

� Sérine (Ser) et Thréonine (Thr) pour les fonctions alcools,

� Acide aspartique (Asp) et Acide glutamique (Glu) pour les groupes carboxyles (présents

chez les monosaccharides en forme acyclique),

� Asparagine (Asn), Glutamine (Gln) et Arginine (Arg) pour les fonctions amides ou amines.

Le huitième acide aminé, la Phénylalanine (Phe), a été considéré pour sa capacité éventuelle à

former des interactions « sucre – composé aromatique » décrites dans la littérature [46,47].

Tableau 1 : Acides aminés L utilisés comme références dans le cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+.

NH2

H

OH

O

OH

��

NH2

H

OH

O

OH

��

NH2

H

C

O

OH

OH

O

��

NH2

H

O

OH

COHO

�� !��" ��

NH2

H

O

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�#��$ � ��#��

NH2

H

C

O

OH

NH2

O

��

NH2

H

O

OH

CNH2O

�" ��!��" ��

NH2

H

O

OH

NH

CNH2NH

��

Nota :

Les références utilisées sont des molécules chirales. Les formes L et D de chaque acide aminé ont été utilisées pour la

recherche systématique des systèmes M/réf discriminants. Les résultats étant remarquablement semblables entre les

deux formes, en termes de capacité à former le cluster trimérique et de ratio R, seuls ceux associés aux formes L des

références sont présentés.

Une dernière molécule de référence, choisie quant à elle pour sa grande proximité structurale et

fonctionnelle avec les trois isomères est le D-fucose, soit le D-déoxygalactose. L’utilisation des

références structurellement les plus proches des analytes, soit lesdits analytes marqués


isotopiquement (le carbone C1 devient un carbone 13, soit un décalage de masse de +1 en MS et

MS/MS) constitue une perspective à cette étude mais augmente substantiellement le coût de

l’analyse.

La recherche des systèmes M/réf discriminants à partir des métaux de transition et acides aminés

sélectionnés s’articule autour de deux points :

� La formation du cluster trimérique [M(réf)2(A)-H]+ en ESI-MS, condition sine qua non

de l’application de la méthode cinétique à la distinction isomérique ;

� La fragmentation de ce cluster, qui doit permettre le calcul d’un ratio R défini

précédemment à partir des deux ions fragments, ce ratio devant enfin être caractéristique

d’un isomère.

Les résultats selon ces deux « critères » sont présentés dans les tableaux 2 et 3 :

Tableau 2 : Récapitulatif des comportements observés pour une série de références et de métaux en ESI-MS.

� !�� %%��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

��

trimère non formé

trimère formé : fragmentation

secondaire

trimère formé : - réf uniquement

trimère formé : - sucre uniquement

trimère formé : dissociations

compétitives

On notera l’absence de tendance évidente entre le numéro atomique du métal et son

comportement avec une référence donnée, justifiant a posteriori la recherche empirique de systèmes

discriminants.

Les systèmes ne permettant pas la formation du trimère ne peuvent évidemment pas être retenus

(` � �a= bc�de�f � �egdhi= bc�jk��ilimjni�. D’autres engendrent le trimère attendu

[M(réf)2(A)-H]+ mais le spectre MS/MS présente une fragmentation « secondaire » issue de l’ion

précurseur et des deux ions fragments souhaités, ce qui n’est pas acceptable dans le cadre de la

méthode cinétique, les fragmentations donnant les ions fragments [M(réf)(A)-H]+ et [M(réf)2-H]

+

devant être les seules voies de dissociation du cluster trimérique [17]. D’autre part, si les ions

fragments se dissocient à leur tour, leur abondance ionique se trouvera faussée et le ratio mesuré


entaché d’une erreur dont on ne pourra garantir la répétabilité. Certains systèmes présentent une

seule voie de dissociation pour les trois monosaccharides :

� La perte de référence uniquement, ce qui pour le moment tout du moins ne conduit à

rien d’exploitable en distinction ou en quantification ;

� La perte de sucre uniquement, la référence devenant alors un candidat pour la variation

en ligand fixe de la méthode cinétique (voir plus bas), observée dans la grande majorité pour

les acides aminés à fonction amide, L-Asn et L-Gln.

Les systèmes permettant la formation du trimère et présentant une fragmentation compétitive entre

les deux voies de dissociation pour les trois sucres sont présentés dans le tableau 3.

Tableau 3 : Récapitulatif des systèmes potentiellement discriminants pour les trois sucres.

�� !�" �#"�$%&�'�� !�"��$%& �#��

�� !(�� akn� ang� ��e� aknoang� akno��e� ango��e�

��&�

�� 0p=q� 0=rs� r=t� 0I=r� 1=s� I=1q�

�� I=rt0� I=IsI� I=11q� p=r� 1=rp� I=uI�

�� s=Is� I=tsv� v=Iv� 0I=1� v=II� I=1s�

��&�� 1=p1� I=ur� 0=00� r=t� 1=vp� I=u0�

�� 1u� 0=sp� v=1v� 01� q=u� I=p0�

�& �� 1=1q� I=u00� I=urr� r=r1� u=ss� I=sI�

��& �� s=1p� I=qup� I=rrq� 01=u� 0p=p� 0=vu�

��& �� I=u1I� I=0p0� I=Iuv� 1=p0� s=t� v=q�

��&

�� 0=uv� I=v0q� I=v01� u=r0� u=rt� 0=I1�

�� u=1� I=0s1� I=0q1� 10=s� 1u=u� 0=01�

�� u=0q� I=vs1� I=u1� 0I=p� s=s� I=sv�

(les écart-types ne sont pas indiqués par souci de clarté, le nombre de chiffres significatifs renseigne sur la précision des

mesures)

Les complexes au calcium sont tous prometteurs en termes de distinction isomérique, mais le

bouchage systématique du spectromètre lors du traitement de ces solutions a rendu leur utilisation

hasardeuse puis tout à fait indésirable. Néanmoins ces trois systèmes ne doivent pas être écartés, le

nitrate de calcium utilisé ici n’étant peut être pas adapté (produit ancien, hydraté). Les trois

systèmes Zn/réf ne discriminent pas suffisamment le D-glucose du D-fructose (Riso trop proche de

l’unité) et sont donc écartés, ainsi que le système Fe/Asp pour la même raison. Enfin, le système

Mn/Thr a été jugé susceptible d’induire de trop gra

associée au ratio obtenu pour le D

le tableau, mais le nombre de chiffres significatifs renseigne sur la précision d

Il reste donc trois systèmes aptes à quantifier les

Co/Thr et Cu/Ser. Puisque deux systèmes sont nécessaires et suffisant

isomères, seuls Cu/Ser er Mn/Asp

des Riso.

Nota : La similitude des résultats observés pour les forme

formes L et D des monosaccharides étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomè

distinguer convenablement les énantiomères d’un mêm

Figure 3 : Spectres ESI/MS-MS des trois clusters [M(réf)

Les spectres MS/MS de la figure 3

les trois isomères étudiés. L’abondance ionique de

référence (- L-Ser) varie avec la nature du

272 issu de la perte de l’analyte (pic de base dans les

isomère.

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomér

Mn/Thr a été jugé susceptible d’induire de trop grandes erreurs en quantification,

D-galactose (les écart-types des ratios mesurés ne figure

chiffres significatifs renseigne sur la précision de la mesure).

Il reste donc trois systèmes aptes à quantifier les trois monosaccharides en mélange, Mn/Asp,

Puisque deux systèmes sont nécessaires et suffisants pour le traitement de troi

Mn/Asp seront utilisés désormais, sélectionnés par simple

La similitude des résultats observés pour les formes L et D des références se retrouve logiquement pou

étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomère

distinguer convenablement les énantiomères d’un même isomère.

MS des trois clusters [M(réf)2(A)-H]+ des sucres étudiés pour le système Cu/Ser

figure 3 illustrent la discrimination apportée par le systèm

les trois isomères étudiés. L’abondance ionique de l’ion fragment m/z 347

) varie avec la nature du sucre, relativement à l’abondance de l’ion fragment

issu de la perte de l’analyte (pic de base dans les trois cas) d’où un ratio R spécifique à chaque


ndes erreurs en quantification, vue l’incertitude

pes des ratios mesurés ne figurent pas dans

chiffres significatifs renseigne sur la précision de la mesure).

trois monosaccharides en mélange, Mn/Asp,

pour le traitement de trois

seront utilisés désormais, sélectionnés par simple comparaison

s L et D des références se retrouve logiquement pour les

étudiés. Les systèmes discriminants les trois isomères sont alors incapables de

des sucres étudiés pour le système Cu/Ser.

illustrent la discrimination apportée par le système Cu/Ser pour

347 issu de la perte de

sucre, relativement à l’abondance de l’ion fragment m/z

trois cas) d’où un ratio R spécifique à chaque


Remarque : Afin de rationaliser la recherche de systèmes discriminants, une approche basée sur

des calculs théoriques a été mise ne place. La modélisation des clusters trimériques et dimériques

principalement effectuée pour un système simple (Ca/Thr) s’est soldée par un arrêt des calculs. En

effet, la différence d’énergie de liaison [Ca(Thr)(A)-H]+ -- Thr et [Ca(Thr)2-H]

+ -- A est de l’ordre

de 5 kcal.mol-1

, ce qui tend vers la limite de précision de la méthode. Or le système Ca/Thr présente

un comportement radical puisqu’il ne perd que la référence lors de la fragmentation. Les mêmes

calculs effectués pour des systèmes présentant des dissociations compétitives ne seraient donc pas

exploitables car fourniraient des résultats inférieurs à cette valeur déjà critique.

A noter enfin que la section Conditions expérimentales rappelle les protocoles utilisés pour

l’obtention des résultats présentés.

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique : variante en ligand fixe

Comme son nom l’indique assez clairement, la variante en ligand fixe est une évolution de la

méthode cinétique standard appliquée à la reconnaissance chirale ou isomérique, dans laquelle l’une

des molécules de référence est remplacée par un ligand fixe, c’est-à-dire non éliminé lors des

dissociations compétitives. Ce ligand fixe est en fait le siège unique de la déprotonation (qui peut se

produire sur les trois molécules dans la méthode standard, d’où la formation d’isomères pour le

complexe trimérique) et implique une limitation des isomères du cluster ainsi que cette fixité par

rapport au métal [48].

réf*

sucre

MIILfixe

- H

unité fixe

réf*

sucre

MIIréf*

- H

+

ligand fixe

+

(17)

La détection des références candidates au rôle de ligand fixe passe bien évidemment par

l’observation d’une perte de sucre quasi-exclusive pour tous les isomères lors de la fragmentation

du cluster trimérique incluant ce même ligand fixe. La fragmentation du cluster trimérique formé de

ce ligand, d’une autre référence non fixe et de l’analyte ne conduit alors à aucune perte de ligand

fixe. Le ligand fixe pourra par exemple exalter la discrimination isomérique, en augmentant les

interactions référence/analyte, ou limiter les problèmes entropiques par la diminution du nombre

d’isomères du clusters et des réarrangements post-fragmentation.

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomér

Dans le cas présent, l’utilisation du ligand fixe r

de situations problématiques, que

� La non-formation du cluster trimérique, qui peut être liée

rigidité structurale de la référence

� La trop forte fragmentation secondaire du cluster t

� La faible discrimination ou l’absence de discrimina

monosaccharides ;

ou tout simplement de celle d’améliorer la discrimination déjà effective d’un s

c’est le cas dans la grande majorité des articles [48,

Cette application s’est révélée

� le système Fe/Thr présente une

fixe Fe/Asn/Thr ne présente plus cette fragmentatio

discriminant pour les trois sucres

� le D-fucose utilisé comme seule référence ne permet

aucun des métaux, tandis que le nouveau système Cu/Asn/D

complexe pour les trois sucres et est également dis

� le système Zn/Asp a été précédemment éliminé pour s

glucose et D-fructose (

trois monosaccharides (

Figure 4 : Comparaison des spectres ESI

[Fe(Thr)2(sucre)-H]+

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique – variante en ligand fixe

Dans le cas présent, l’utilisation du ligand fixe relève de la volonté de résolution ou d’amélioration

, que sont :

formation du cluster trimérique, qui peut être liée à une gène stérique

rigidité structurale de la référence ;

La trop forte fragmentation secondaire du cluster trimérique et des ions fragments

La faible discrimination ou l’absence de discrimination entre deux des trois

d’améliorer la discrimination déjà effective d’un système M/réf, comme

nde majorité des articles [48,49].

Cette application s’est révélée efficace dans certains cas pour les problèmes cités

le système Fe/Thr présente une fragmentation secondaire forte alors que

fixe Fe/Asn/Thr ne présente plus cette fragmentation, comme le montre la F

;

me seule référence ne permet la formation du cluster trimérique avec

le nouveau système Cu/Asn/D-fucose conduit à la formation du

complexe pour les trois sucres et est également discriminant ;

le système Zn/Asp a été précédemment éliminé pour son absence de discrimination entre D

) mais le système Zn/Asn/Asp permet la discrimination des

, , ).

omparaison des spectres ESI-MS/MS des clusters trimériques [Fe(Asn)(Thr)(sucre)

+ quant à la fragmentation secondaire (indiqué en rouge)

variante en ligand fixe 17

elève de la volonté de résolution ou d’amélioration

à une gène stérique ou une

rimérique et des ions fragments ;

tion entre deux des trois

d’améliorer la discrimination déjà effective d’un système M/réf, comme

efficace dans certains cas pour les problèmes cités :

fragmentation secondaire forte alors que le système à ligand

, comme le montre la Figure 4, et est

u cluster trimérique avec

fucose conduit à la formation du

discrimination entre D-

le système Zn/Asn/Asp permet la discrimination des

).

[Fe(Asn)(Thr)(sucre)-H]+�et

en rouge).�

Méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique – variante en ligand fixe 18

L’observation de résultats opposés à ceux souhaités (perte de discrimination par exemple) rendent

cependant, comme la recherche de système, l’exploration hasardeuse et malheureusement

systématique.

Toutefois, pour la quantification d’isomères en mélange, l’utilisation d’un ligand fixe peut devenir

un moyen simple et rapide d’augmenter le nombre de systèmes discriminants. Ainsi, les systèmes

Co/Thr, Mn/Asp et Cu/Ser étant déjà discriminants, et les acides aminés Asn et Gln étant considérés

comme fixes pour les métaux précités, l’ensemble des systèmes (Mn, Co, Cu)/(Asn, Gln)/(Asp, Ser,

Thr) pourraient devenir 18 systèmes potentiellement discriminants, pouvant idéalement traiter 19

isomères en mélange.

Quantification en mélange

Mélange binaire

L’étape suivante et la finalité réelle du travail concerne la quantification des trois

monosaccharides isomères type en mélange par la méthode cinétique. D’après les développements

présentés, trois analytes nécessitent deux mesures de ratio dans des conditions différentes, soit deux

systèmes métal/référence [36]. Mn/Asp et Cu/Ser ont été sélectionnés pour ces mesures. D’après

Cooks et al. et comme présenté précédemment, la méthode cinétique appliquée à la reconnaissance

chirale (ou isomérique) est intrinsèquement linéaire, même si certains auteurs [50,51] (dont Cooks

[45]) ont pu observer des cas de non linéarité. C’est précisément le cas ici, puisque la mesure des

fractions molaires de deux des trois isomères en mélange (par la mesure d’un seul ratio, pour un

seul système) par l’application de la relation linéaire (16) a fourni des résultats largement biaisés

(des erreurs de plus de 40% par rapport à la fraction réelle ont été relevées). Le tracé du logarithme

népérien du ratio mesuré pour le système Cu/Ser en fonction de la fraction molaire d’un des

isomères en mélange binaire, linéaire en théorie, est présenté ci-après et illustre bien les non

linéarités observées.

Figure 5 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en f

d’un des sucres : ( ) D-galactose en mélange avec D

( ) D-galactose en mélange avec D

est représenté en ligne pointillée, les droites thé

La linéarité de la méthode cinétique étant mise en

explicites et implicites de cette méthode. En parti

l’indépendance de la formation du cluster trimériqu

isomères en mélange [52]. Pour un mélange binaire par exemple, si les analyte

identiquement avec le métal et les références pour

[M(réf)2(Ai)-H]+ et [M(réf)2(Aj)

fractions molaires des analytes en phase liquide

quantification juste. Cependant, tout

formation des clusters imposerait un biais entre la

même analyte impliqué dans le cluster correspondant, c’est

gazeuse.

Afin de vérifier si un tel phénomène de compétition est à l’origine des biais

ionique dans le spectre MS du cluster trimérique associé à un analyte i

croissantes a été mesurée en présence d’un

isotopiquement avec un 13

C (pour

dont les rapports m/z seront alors séparés


ogarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction

galactose en mélange avec D-fructose, ( ) D-fructose en mélange avec D

galactose en mélange avec D-glucose. Le « tracé » expérimental à partir des trois points de mesure

est représenté en ligne pointillée, les droites théoriquement attendues sont en trait plein

La linéarité de la méthode cinétique étant mise en défaut, il est nécessaire de revenir aux hypothèses

explicites et implicites de cette méthode. En particulier, un pré-requis

l’indépendance de la formation du cluster trimérique associé à un isomère vis

Pour un mélange binaire par exemple, si les analyte

identiquement avec le métal et les références pour former les clusters trimériques correspondant

)-H]+, l’abondance des clusters en phase gazeuse reflètera

ions molaires des analytes en phase liquide et la mesure du ratio en MS/MS fournira une

ntification juste. Cependant, tout phénomène de compétition entre les deux isomère

formation des clusters imposerait un biais entre la fraction d’un analyte en solution

s le cluster correspondant, c’est-à-dire la fraction

phénomène de compétition est à l’origine des biais observés

du cluster trimérique associé à un analyte i,

n présence d’une concentration donnée en

C (pour distinguer les deux clusters [M(réf)2(Ai)-H]

seront alors séparés d’une unité de masse).

Quantification en mélange – mélange binaire 19

onction de la fraction molaire liquide

fructose en mélange avec D-glucose,

à partir des trois points de mesure

s sont en trait plein.

défaut, il est nécessaire de revenir aux hypothèses

élémentaire concerne

é à un isomère vis-à-vis des autres

Pour un mélange binaire par exemple, si les analytes Ai et Aj réagissent

former les clusters trimériques correspondants

l’abondance des clusters en phase gazeuse reflètera les

et la mesure du ratio en MS/MS fournira une

phénomène de compétition entre les deux isomères pour la

action d’un analyte en solution et celle de ce

fraction de l’analyte en phase

phénomène de compétition est à l’origine des biais observés, l’abondance

à trois concentrations

e concentration donnée en analyte j marqué

H]+ et [M(réf)2(Aj)-H]

+

Ces mesures sont réalisées pour une gamme croissant

obtenus pour le système Cu/Ser et le

le graphe ci-dessous :

Figure 6 : Abondance ionique du cluster trimérique [Cu(Ser)

D-fructose, pour différentes concentrations en D

Un phénomène d’exaltation est clairement mis en évi

trimérique du fructose est bien une fonction linéaire de

pente de cette droite est une fonction sigmoïdale d

alors ici le rôle d’isomère « compétiteur

formation/ionisation du cluster trimérique d’

puisque la fraction molaire « réelle

gazeuse telle que mesurée par la méthode cinétique.

toutefois différente selon le système binaire envis

influence pourrait être un changement de structure

anomérique d’un isomère, par interac

différences de formation/ionisation du cluster trimérique associé.


Ces mesures sont réalisées pour une gamme croissante de concentration en analyte j. Les résultats

pour le système Cu/Ser et le mélange binaire D-fructose/D-glucose (13

cluster trimérique [Cu(Ser)2(fru)-H]+ en fonction de la concentration en

fructose, pour différentes concentrations en D-glucose (13C1) exprimées en mM

Un phénomène d’exaltation est clairement mis en évidence ici, puisque si l’abondance du cluster

une fonction linéaire de la concentration de ce même fructose, la

pente de cette droite est une fonction sigmoïdale de la concentration en D-glucose marqué, qui joue

compétiteur ». La présence d’un second isomère impacte bien la

formation/ionisation du cluster trimérique d’un isomère donné, influence à l’origine d’un biais

réelle » de l’analyte en phase liquide diffère de sa

mesurée par la méthode cinétique. La portée de cet effet de compétition est

toutefois différente selon le système binaire envisagé. Une description envisageable de cette

influence pourrait être un changement de structure principale, ou la modification de l’équilibre

par interaction faible entre monosaccharides [5

nisation du cluster trimérique associé.


e de concentration en analyte j. Les résultats

13C1) sont présentés sur

en fonction de la concentration en

exprimées en mM

dence ici, puisque si l’abondance du cluster

la concentration de ce même fructose, la

glucose marqué, qui joue

isomère impacte bien la

, influence à l’origine d’un biais

diffère de sa fraction en phase

a portée de cet effet de compétition est

Une description envisageable de cette

principale, ou la modification de l’équilibre

[53,54], entrainant des


Zhang et al [50] ont proposé l’introduction d’une constante d’équilibre w66=9 susceptible de

caractériser la distribution d’un analyte i dans les phases liquide et gazeuse en présence d’un

isomère j:

&68 xyy=z{| &6} (18)

Cette constante d’équilibre concerne bien évidemment un analyte donné dans un mélange donné

(binaire ici), puisqu’il doit rendre compte des phénomènes d’interactions entre analytes et ne pourra

en aucun cas caractériser un analyte de façon universelle.

En définissant une constante similaire pour l’analyte j (en présence de l’analyte i), on peut alors

définir la fraction molaire en phase gazeuse de l’analyte i en fonction des fractions molaires en

phase liquide des analytes i et j, et des constantes d’équilibre définies :

A6} � w66=9 � A68w66=9 � A68 ( w96=9 � A98 (19)

Ce qui se réécrit, en considérant qu’il s’agit d’un mélange binaire [51] :

A6} �w66=9 w96=9~ � A68

w66=9 w96=9� � A68 ( <0 � A68> (20)

En reprenant l’équation (15), mais en y substituant le terme A, classiquement associé à la fraction

molaire en phase liquide dans la méthode cinétique standard, à la fraction molaire en phase

gazeuse d’un des analytes, on obtient : �� A6} � ��6� ( <0 � A6}> � ��<�9> (21)

où Ri et Rj sont les ratios des analytes i et j considérés séparément, valeurs expérimentales donc

soumises à aucune correction ou modification. En combinant les équations (19) et (20), on écrit le

ratio mesuré en mélange R en fonction d’une fraction molaire en phase liquide :

�� w66=9 w96=9~ � ��6� � ��<�9>� � A68 ( ��<�9>

��w66=9 w96=9� � 0

�� A68 ( 0 (22)

La détermination du rapport

monosaccharides étudiés (gal/fru, gal/glc, fru/

celles déjà effectuées. Une régression de la forme

fraction molaire liquide) a été appliquée aux points

aux mesures du ratio R pour ces même

0, 50 et 100%. Cette régression permet

constantes d’équilibre, comme présent

validation, correspondant aux fractions molaires 25 et 75%

donc de la correction. Ainsi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j p

fraction molaire des analytes i ou j

obtenant ainsi les fractions en phase gaz

retrouvant ainsi les fractions molaires en phas

Figure 7 : Logarithme népérien du ratio en mélange binaire en f

d’un des analytes. ( ) D-galactose en mélange avec D

( ) D-galactose en mélange avec D

Le tracé de la régression de la forme (21)

Puisque la régression est excellente et appuyée par

le calcul des rapports des constantes d’équi

une régression trois points. On obtient ainsi

Des mesures du ratio R et les calculs des fractions


rapport dans le cas des mélanges

étudiés (gal/fru, gal/glc, fru/glc) ne demande pas de mesures supplémentaires à

celles déjà effectuées. Une régression de la forme de l’équation (21) (fonction rationnelle de la

appliquée aux points expérimentaux de la Figur

aux mesures du ratio R pour ces mêmes mélanges binaires et des fractions molaires en phase liquide

. Cette régression permet une corrélation excellente et la détermination du

, comme présenté sur la Figure 7 dans le cas du système Cu/Ser

fractions molaires 25 et 75%, assurent la validité de la régre

insi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j permet de r

des analytes i ou j sans biais, soit en considérant la relation linéair

obtenant ainsi les fractions en phase gazeuse, soit en considérant la fonction rationnelle (21)

retrouvant ainsi les fractions molaires en phase liquide.

ogarithme népérien du ratio en mélange binaire en fonction de la fraction molaire liquide

galactose en mélange avec D-fructose, ( ) D-fructose en mélange avec D

se en mélange avec D-glucose – points de validation à 25 et 75%.

de la forme (21) effectuée sur trois points (0, 50 et 100%) est réalisé

Puisque la régression est excellente et appuyée par les points de validation pour le système Cu/Ser,

le calcul des rapports des constantes d’équilibre pour le système Mn/Asp a également été

On obtient ainsi ,

Des mesures du ratio R et les calculs des fractions


mélanges binaires des trois

glc) ne demande pas de mesures supplémentaires à

(fonction rationnelle de la

igure 4, correspondant

binaires et des fractions molaires en phase liquide

la détermination du rapport des

igure 7 dans le cas du système Cu/Ser. Des points de

assurent la validité de la régression et

insi, la mesure du ratio R en mélange binaire i/j permet de retrouver la

sans biais, soit en considérant la relation linéaire (20) en

, soit en considérant la fonction rationnelle (21) en

onction de la fraction molaire liquide

fructose en mélange avec D-glucose,

points de validation à 25 et 75%.

est réalisé en trait plein.

pour le système Cu/Ser,

libre pour le système Mn/Asp a également été réalisé par

et

Des mesures du ratio R et les calculs des fractions molaires associées


par la relation (21), soit la correction phase liquide/phase gazeuse, sont alors effectués pour les

fractions 25 et 75% à partir des rapports des constantes d’équilibre calculés, et comparés aux

résultats obtenus avec la méthode linéaire standard. Ces données sont présentées dans le Tableau 4.

Tableau 4 : Résultats de quantification des fractions molaires en mélange binaire, par une calibration deux

points (standard) et trois points (corrigé) pour les trois monosaccharides étudiés. a écart type, b utilisé

comme point de calcul dans la calibration trois points.

� ��!� �� &��'��

!� ��(�� (��)��

�!��

�� (��

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*� ��

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��

��

��

��

��

��

��

Une calibration trois points, qui permet d’obtenir le rapport des constantes d’équilibre régissant

l’équilibre phase liquide/phase gazeuse, permet également de bien corriger la non linéarité observée

précédemment en fournissant des valeurs de fractions molaires en phase liquide en bon accord avec

les fractions réelles, pour les deux systèmes métal/référence engagés. A noter que le système

Mn/Asp pour le mélange binaire gal/fru fournit de bons résultats pour une calibration deux points,

tendance reflétée par la valeur du rapport des constantes d’équilibre, w}78}78=%*� w%*�}78=%*�� 0=I0.

Les deux isomères se comportent dans ce cas d’une façon très similaire avec le métal et la

référence, impliquant des phénomènes de compétition limités. A noter enfin que cette valeur diffère

tout à fait du rapport des constantes d’équilibres obtenu avec le système Cu/Ser pour le même

mélange binaire (w}78}78=%*� w%*�}78=%*�� 1=r0), ce qui montre que la constante d’équilibre phase

liquide/phase gazeuse d’un analyte dépend également du système discriminant métal/référence

utilisé.


La méthode peut alors être appliquée à tout système discriminant pour une quantification en

mélange binaire, en remplaçant la calibration deux points [18] de la méthode standard (0 et

100%) par une calibration trois points (0, 50 et 100% par exemple) [50].

Mélange ternaire

L’extension du raisonnement précédent à un mélange ternaire i/j/k est évidente, et l’obtention de

la relation entre logarithme népérien du ratio et fractions molaires en phase liquide immédiate :

�� w66=9=� � ��6� � A68 ( w96=9=� � ��<�9> � A98 ( w�6=9=� � �� A�8w66=9=� � A68 ( w96=9=� � A98 ( w�6=9=� � A�8 (23)

que l’on réécrit, avec l’hypothèse explicite d’un mélange ternaire :

�� w66=9=� w�6=9=�~ � ��6� � A68 ( w96=9=� w�6=9=�� <�9> � A98 ( �� <0 � A98 � A68>

�w66=9=� w�6=9=�~ � 0� � A68 (��w96=9=� w�6=9=�� 0

�� A98 ( 0

(24)

d’où la nécessité de deux mesures de ratios R sous deux conditions différentes (soit deux systèmes

métal/référence discriminants) afin d’expliciter les deux fractions molaires inconnues et d’en

déduire la troisième.

Si l’impact de la présence d’un isomère j sur la formation/ionisation du cluster d’un isomère i est

avéré, il peut sembler raisonnable, dans une première approximation, de négliger l’influence d’un

troisième isomère k sur cette compétition. Schématiquement cela revient à considérer, en termes

d’interactions entre isomères tout du moins, un mélange ternaire i/j/k comme une combinaison de

trois mélanges binaires i/j, j/k et i/k. Mathématiquement, cela se traduit par l’équation suivante :

�� w66=� w�6=�~ � ��6� � A68 ( w99=� w�9=�~ � ��<�9> � A98 ( �� <0 � A98 � A68>

�w66=� w�6=�~ � 0� � A68 ( �w99=� w�9=�~ � 0� � A98 ( 0 (25)

Quantification en mélange – mélange ternaire 25

Naturellement, et puisque les constantes d’équilibres sont attribuées pour un système

métal/référence et un mélange binaire donnés, la mesure d’un seul ratio R conduit à l’obtention de

trois valeurs possibles pour chaque fraction molaire, selon l’attribution de l’isomère k (le

« compétiteur ») au fructose, glucose ou galactose. Le Tableau 5 résume les résultats obtenus pour

trois mélanges ternaires gal/glc/fru distincts :

Tableau 5 : Résultats de quantification pour trois mélanges ternaires, par la méthode cinétique corrigée.

� ��!� �� &��'��

��

+� �� !�$��!��

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��

��

��

��

��

��

� ��a écart type

On observe que les trois valeurs possibles pour chaque fraction molaire sont, sans être aberrantes,

parfois éloignées de la valeur réelle. Il n’existe pas cependant de tendance simple reliant la justesse

des résultats à l’identification de l’isomère k (le « compétiteur ») dans la formule (24) au fructose,

glucose ou galactose. L’identification de l’isomère k au fructose apporte les fractions les plus justes

pour le glucose et le galactose dans le mélange II, pour le fructose et le glucose dans le mélange III,

ce qui rompt la tendance possible observée dans le mélange I, où la fraction la plus juste pour un

isomère est obtenue lorsque cet isomère est l’isomère k.

C’est par contre la moyenne arithmétique de ces trois valeurs qui constitue une bonne

approximation de la fraction en phase liquide comme l’attestent les valeurs présentées dans le

tableau 5. Cette opération mathématique correspond en fait à l’approximation i/j/k ~ i/j + i/k + j/k,

qui est de ce fait sinon vérifiée au moins validée.

Tous ces résultats sont également présentés dans Distinction and quantitation of sugar isomers in

ternary mixtures using the kinetic method, article soumis au Journal of the American Society for

Mass Spectrometry, ainsi que dans Distinction isomérique et quantification de monosaccharides

par la méthode cinétique, poster présenté au SMAP 2009 (Spectrométrie de Masse et Analyse

Protéomique), à Dijon du 14 au 18 septembre 2009.

26

Conclusion

La méthode cinétique appliquée à la distinction isomérique a été utilisée avec succès pour la

discrimination et la quantification de trois monosaccharides en mélanges binaire et ternaire, par

l’utilisation de cations métalliques divalents comme atome central et d’acides aminés pour

référence. La recherche de systèmes discriminants, largement empirique et par conséquent

systématique, fournit comme meilleurs systèmes des couples métal/référence dont ladite référence

présente effectivement une analogie structurale avec l’analyte (une fonction hydroxyle pour la

sérine et un groupement carboxyle pour l’acide aspartique).

L’hypothèse sous-jacente première de la méthode cinétique, i.e. la formation semblable du

cluster trimérique pour chaque analyte indépendamment des autres analytes, n’est pas respectée ici

puisque des phénomènes de compétition sont mis en évidence. Néanmoins la quantification des

isomères en mélange peut tout de même être assurée par une correction à la loi linéaire de la

méthode cinétique standard, en considérant que la fraction de l’analyte impliqué dans le cluster

trimérique (c’est-à-dire en phase gazeuse) n’est pas strictement égale à sa fraction molaire en

solution, mais qu’il existe un équilibre entre ces deux états. On ne peut cependant pas exclure

d’autres phénomènes susceptibles d’entrainer une non-linéarité, en particulier la présence de

complexes isobares de composition différente [55] et les phénomènes entropiques ignorés ici,

consciemment et à tort puisque analytes et références ne sont pas identiques structuralement et que

des interactions intramoléculaires existent. La signification physique des coefficients correcteurs,

décrits comme les rapports des constantes d’équilibre entre phase liquide et phase gazeuse, est donc

sans aucun doute plus complexe.

L’utilisation de la variation en ligand fixe de la méthode cinétique permettra de multiplier les

systèmes discriminants tout en limitant les changements de métal ou de référence, autorisant ainsi

une augmentation rapide de la capacité de quantification simultanée (N-1 systèmes pour N isomères

en mélange) et une limitation du nombre de manipulations associées. Les démarches préliminaires

concerneront alors la mesure du ratio de chaque analyte seul pour chaque système, et les 2 parmi N

calibrations trois points des mélanges binaires pour obtenir les coefficients correcteurs associés. La

moyenne arithmétique des N fractions molaires obtenues devrait fournir une bonne évaluation de la

fraction molaire en phase liquide réelle de chaque isomère.

Enfin, l’étude de la fragmentation du complexe dimérique [M(réf)(A)-H]+ (déjà explorée pour la

distinction isomérique de peptides [56]) peut constituer une source supplémentaire de systèmes et

fournir des avantages similaires à ceux apportés par le ligand fixe.

27

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method : alkali metal-bound dimeric cluster ions. Int. J. Mass Spectrom. 2004, 231, 103–111.

Conditions expérimentales

Produits et solvants utilisés :

Tous les produits ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO) et utilisés sans étape de

purification.

Sucres :

L/D-glucose ; L/D-fructose ; L/D-galactose ; D-glucose (13

C1) ; D-fructose (13

C1)

Acides aminés

L/D-Arginine ; L/D-Asparagine ; Acide L/D aspartique ; Acide L/D glutamique ; L/D-Glutamine ;

L/D-Phénylalanine ; L/D-Serine ; L/D-Thréonine ; L/D-Tyrosine.

Sels métalliques :

Ca(NO3)2 ; MnCl2 ; FeSO4 ; Co(CH3COO)2 ; ZnCl2 ; CuSO4

Solvants :

Méthanol grade HPLC (Sigma-Aldrich)

Eau grade HPLC (SDS, Peypin, France)

Les solutions ionisées par electrospray contiennent le métal de transition (1.10-4

M), la référence

(2.10-4

M) et le sucre (2.10-4

M), et sont préparées d’après le protocole ci-après.

Préparation des solutions de travail :

Les solutions sont préparées en utilisant les proportions proposées par Augusti et al. [18]

solution mère

1ère dilutionV = 5 ml de MeOHC = 3e-4 M

V = 5 ml de H2O

C = 6e-4 M

V = 2,7 ml de MeOH

+ 2,15 ml de H2O

C = 6e-4 M

x µlx µl

x µlsolution de travail

V = 3 x µl

Cmétal

= 1e-4 M

Créf

= 2e-4 M

Csucre

= 2e-4 M

Sel ( MnCl2, CoAc2, ...)

V = 5 ml de H2O

C = 1e-2 M

Référence (acide aminé)

V = 5 ml de H2O

C = 1e-2 M

Sucre

V = 5 ml de H2O

C = 2e-2 M

150 µl 300 µl 150 µl

Analyse par spectrométrie de masse :

Toutes les analyses et mesures ont été réalisées sur un

spectromètre de masse hybride QTrap 3200 (Applied

Biosystems SCIEX) équipé d’une source d’ionisation

electrospray utilisée en mode positif. Ce spectromètre de

masse est équipé de deux analyseurs quadripolaires en

tandem (Q1 et Q3) et d’une cellule de collision

intermédiaire. (ci-joint : vue du spectromètre de masse

Qtrap 3200 [Applied Biosystems]) Le quadripôle Q3 peut

être, moyennant l’application de tensions d’entrée et de

sortie spécifiques, transformé en trappe ionique.

Les ions précurseurs sont sélectionnés dans le premier quadripôle, et sont fragmentés dans la cellule

par collision avec un gaz inerte, le diazote dans ce cas. Différentes énergies de collision (CE) et

pressions de gaz dans la cellule de collision peuvent être définies, fournissant des modes de

collision variés pour les ions précurseurs. Les ions fragments sont ensuite analysés par le quadripôle

Q3 (mode MS/MS en triple quadripôle). D’autres modes (non utilisés dans cette étude) peuvent être

appliqués, notamment en effectuant les fragmentations au sein de la trappe ionique (mode MS/MS

Trap).

Schéma de fonctionnement du spectromètre de masse Qtrap 3200 [brochure 3200 Q TRAP system, Applied Biosystems]

Différents paramètres peuvent être réglés lors de l’analyse, et dans ce cas précis, sont constants pour

toutes les mesures réalisées. En particulier, la tension electrospray (Capillarity voltage) est réglée à

5500 V, la tension de cône (DP : Declustering Potential) à 20 V. Le gaz de nébulisation est de l’air

introduit à une pression de 10 psi (0,69 bar), le diazote est utilisé comme gaz rideau (séparation

entre la source d’ionisation à pression atmosphérique et le spectromètre sous vide) et comme gaz de

collision dans la cellule de collision, à une pression de 10 psi (0,69 bar). L’énergie de collision

appliquée aux ions précurseurs est de 5 eV (référentiel du laboratoire), qui est la valeur minimale

autorisée par l’instrument. La pression du gaz de collision dans la cellule est également réglée à son

minimum. Enfin, la solution de travail ionisée par electrospray est injectée dans la source

d’ionisation par une pompe pousse-seringue à un débit de 5 µl.min-1

. Le contrôle de tous ces

paramètres et de l’instrument, l’acquisition et le traitement des données sont réalisés avec le logiciel

Analyst (1.4.1) fourni par Applied Biosystems.

Le principe de toutes les analyses réalisées pour étudier un système métal/référence est le même :

� La solution contenant le métal, la référence et un sucre est ionisée par electrospray ;

� Un premier spectre MS (analyse des ions produits par la source d’ionisation) valide ou non la

formation du cluster trimérique. Le cas échéant, les réglages de la hauteur du capillaire dans la

source d’ionisation et de la hauteur de la source elle-même peuvent être effectués pour améliorer

le signal attendu.

� La fragmentation du cluster trimérique est réalisée en mode MS/MS triple quadripôle. Si le

spectre MS/MS répond aux impératifs de la méthode cinétique (pas de fragmentation secondaire,

deux voies de dissociation compétitives observées), la mesure du ratio R est effectuée à 5

reprises par accumulation de 50 scans. Pour les systèmes discriminants retenus pour la

quantification en mélange (Cu/Ser et Mn/Asp), trois solutions différentes ont été préparées et

analysées à des dates différentes.

� Le spectromètre est rincé avec une solution aqueuse de méthanol (50:50) puis de méthanol

pendant une durée jugée suffisante.

��

�

Annexes

Liste des abréviations utilisées .................................................................................... I

Article soumis .............................................................................................................. II

Poster présenté au SMAP 2009 ............................................................................. XIV

�

Liste des abréviations utilisées

fru : D-fructose

glc : D-glucose

gal : D-galactose

ESI : ionisation electrospray

CID : dissociation induite par collision

M : métal divalent

C : ion central

Réf : molécule de référence

A : analyte (Ai : analyte i )

i/j : mélange binaire des analytes i et j

i/j/k : mélange ternaire des analytes i, j et k

� : fraction molaire (�� : en phase liquide / ��: en phase gaz)

- réf : perte d’une molécule de référence / - sucre : perte d’un isomère de monosaccharide

13C1 : marquage isotopique du carbone 1 d’un monosaccharide (d’après la nomenclature IUPAC*)

[*: McNaught, A. D. Nomenclature of Carbohydrates. Carbohydrate Research. 1997, 297, 1-90.]�

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Poster présenté au SMAP 2009

Résumé

L'analyse isomérique quantitative de trois monosaccharides (D-fructose, D-galactose, D-

glucose), basée sur la dissociation de complexes trimériques simplement chargés formés par

electrospray, a été réalisée selon la méthode cinétique. Divers acides aminés L et cations

métalliques divalents ont été testés afin de choisir les meilleurs systèmes pour la distinction

isomérique et la quantification en mélange. Une forte discrimination est observée pour de

nombreux systèmes, dont le couple serine/Cu2+

et acide aspartique/Mn2+

, qui a été sélectionné

pour l'analyse quantitative. Des effets de compétition pour la formation/ionisation des

complexes ont été mis en évidence, mais une correction par des calibrations trois points assure

la justesse et la répétabilité de la quantification en mélange binaire et ternaire.

Abstract

Quantitative isomeric analysis of D-fructose, D-galactose and D-glucose was achieved

using collision-induced dissociation of electrosprayed trimeric ions with data analysis by the

kinetic method. Several L-amino acids and divalent metal cations were tested to select the

best systems for isomeric distinction and quantitation of each monosaccharide. Very high

distinction could be achieved for most tested systems amongst which serine/Cu2+

and aspartic

acid/Mn2+

were selected for quantitative analysis. Accurate quantitative results were obtained

for each analyte in binary and ternary mixtures using three-point corrected calibration curves,

which account for the competition effects evidenced to occur between sugars for the

formation of the trimeric complexes.

�

M2R - ECM 2009

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Transcript of M2R - ECM 2009