MARCADORES MOLECULARES

Universidade Federal do Espírito Santo

CONCEITO

Portanto, são partes do DNA que são utilizadas na identificação, para se fazer analises comparativas entre seres distintos.

Todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um geneexpresso ou de um segmento de DNA (Ferreira e

Grattapaglia, 1996).

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)

TIPOS

STR (Short Tandem Repeat)

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

RFLP(Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição)

Consiste na fragmentação do DNA através do uso de enzimas de restrição e na hibridização desses fragmentos com seqüências homólogas de DNA marcadas por compostos radioativos ou luminescentes.

Para a detecção do polimorfismo é necessário que as seqüências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivíduos comparados sejam distintas.

Causas dos polimorfismos

Criação ou eliminação de sítios de restrição:

• substituição ou modificação de pares de bases (mutação);

• deleções, inserções,inversões ou translocações ocorridas na fita de DNA.

Consequência: Alteração da distância entre dois sítios de restrição adjacentes.

Extração e purificação do DNA;

Clivagem de moléculas de DNA por enzimas de restrição;

Separação dos fragmentos por eletroforese em gel;

Southern blot;

Visualização em forma de bandas.

RFLP(Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição)

Ex1

Ex.: Milho e sorgo(mapeamento comparativo)

• Enquanto o milho possui cerca de 4 picogramas de DNA o sorgo possui apenas 1 picograma.

• Apesar de tamanha disparidade no tamanho físico do genoma estas espécies possuem ampla sintonia genômica .

•O locus de RFLP em sorgos revelaram conservação das ligações com os mapas de ligação do milho e a maioria dos locus ligados em milho também se mostrou ligados em sorgo.

•A ordem dos locus também foram em grande parte conservadas. Segmentos distintos, duplicados em milho, tendem a corresponder a uma única região genômica em Sorgo, o que explica o maior tamanho físico do genoma do milho.

•Resultado: Elaboração da hipótese de escala evolucionária: mostra que o milho surgiu antes do sorgo.

• Biossistemática, evolução e genética de animais e plantas;

• Estudos de genética de populações, biogeografia e polimorfismo em populações de diversos organismos;

• Medicina forense, determinação de paternidade e no diagnóstico de doenças hereditárias.

Aplicações

Limitações da técnicas de RFLP

•Processo de alto custo;

•Grande investimentos em pessoal, equipamentos, químicos;

•Cuidados especiais quando sondas radioativas são empregadas;

•Não permite a automatização de suas etapas.

VNTR(Minisatélite)(Repetições em tandem de número variável)

Número variável de seqüências idênticas repetidas lado a lado com 15 a 100 pares de bases e são repetidas até 50 vezes em cada loco hipervariável.

•A obtenção e detecção destes tipos de marcadores têm princípio semelhante ao utilizado para RFLP. •A única diferença entre os marcadoresRFLP e VNTR é o tipo de sonda empregada na detecção do polimorfismo de DNA.

•As sondas são homólogas às seqüências repetidas dos minisatélites, de forma que são detectados todos os locos hipervariáveissimultaneamente, sendo obtido um perfil complexo de bandas múltiplas.

Ex.: Teste de paternidade

Por locus, cada sonda hibridiza com dois segmentos de DNA, correspondentes aos alelos materno e paterno de cada indivíduo.

Metodologia:

•Extração de DNA genômico;

•Digestão com enzima de restrição:Hae III, Pst I e Hinf I;

•os produtos da digestão são separados em gel de agarose, desnaturados;

•Southern-blot. Uma sonda quimioluminescente, ou marcada radioativamente, complementar às seqüências detectar as seqüências alvo;

•visualização em filmes de raios-X;

•A mesma membrana, com o DNA fixado, pode ser utilizada para hibridizações seqüenciais com diferentes sondas, específicas para seqüências VNTR em diferentes cromossomos .

De maneira geral, como resultado da utilização de apenas 5 sondas VNTR, são obtidos índices de paternidade/maternidade superiores a 100.000, gerando probabilidades de paternidade/maternidade superiores à 99,999%.

Desvantagens:

•Requer DNA íntegro e em grande quantidade, tornando praticamente inviável a tipagem de amostras biológicas antigas, degradadas ou com pouca quantidade de DNA.

Por isso, a metodologia é pouco utilizada em investigações criminais.

 

 

Teste de paternidade

Enzima de restriçãoEnzima de restrição

RAPD

O princípio desta técnica é o uso de primers mais curtos (10 nucleotídeos) e de seqüência arbitrária durante a reação de amplificação, eliminando a necessidade do conhecimento prévio da seqüência.

(Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso)

RAPD

Metodologia:

•Escolha de um primer de sequência arbitrária ;

•Amplificação em gel de agarose, corado com Brometo de Etídio e visualizado sob luz UV. As duas regiões do genoma complementares ao primer devem estar separados por até 4000 pares de bases e orientações opostas;

•Produtos da amplificação separados em gel de poliacrilamida;

•Bandas visualizadas por autoradiografia ou por Nitrato de Prata.

Os marcadores RAPD se comportam como marcadores genéticos dominantes, ou seja, um indivíduo diplóide homozigoto para um dado loco RAPD possui dois alelos RAPD idênticos (AA), a partir dos quais ocorre a amplificação;

O indivíduo heterozigoto (Aa) para o mesmo loco RAPD possui um alelo (A) que é amplificado e o outro (a) que não é; já o genótipo homozigoto recessivo (aa) é identificado pela ausência de banda no gel.

RAPD

Vantagens do RAPD em relação ao RFLP

•Dados obtidos mais rapidamente ;

• Pode ser utilizado um conjunto único de primers arbitrários;

•É preciso uma quantidade mínima de DNA para a análise genotípica de um indivíduo;

•Possibilita amostrar regiões de DNA repetitivo; •Técnica mais sensível na detecção de polimorfismo ao nível de DNA devido aos primers serem curto;

•Apresenta custo mais baixo, em virtude dos gastos com mão-de-obra, reagentes e suplementos serem menores e não necessitar de instalações sofisticadas de laboratório.

Identificação de populações de cochonilhas

Na região mitocondrial 16S rDNA o gene tem sido usado em inúmeros estudos em relações filogenéticas.

No instituto tropical de agricultura, tem utilizado técnicas de RAPD para caracterizar diferentes populações de cochonilhas e caracterizar o gene mitocondrial do rDNA de quatro populações representadas por três espécies da África e América do Sul.

É um método diagnóstico para uma rápida identificação das espécies.

Ex.:

Ex. Identificação de espécies

Capsicum sp. (pimentão/pimenta)

Em estudo da diversidade genética e classificação botânica em 70 exemplares do gênero, observou-se que o marcador RAPD foi eficaz para estimar a diversidade genética e agrupá-los em espécies.

Desta forma esse marcador molecular pode ser usado na classificação de espécies não identificas botanicamente e na reclassificação de alguns indivíduos erroneamente identificados apenas por padrões morfológicos.

Variação na sequência de nucleotídeos do DNA que ocorre quando um único nucleotídeo é alterado em regiões codificantes ou não-codificantes. Para uma variação ser considerada SNP é necessário que esteja presente em no mínimo 1% da população.

Muitos SNP não possuem efeito da função celular, porém cientistas acreditam que possam influenciar na predisposição a doenças e a respostas a drogas.

SNP

Polimorfismo de nucleotídeo único

Metodologia

•PCR- amplificação do alelo específico;

•Cada alelo na amostra é quantificado. Isto é amostrado dividindo alíquotas iguais do DNA analisado em duas reações de PCR distintas, cada uma contendo um par de primers específico para uma ou outra variante do alelo do SNP;

•Para amostras com iguais quantidades dos dois alelos pode-se detectar mesma quantidade de ciclos de fluorescência;

•Para alelos distintos, há um desequilíbrio da proporção do número de ciclos de fluorescência, o que é utilizado para calcular a quantidade relativa de alelos diferentes.

Aplicações:

Detecção para pré-disposição genética para doenças como:

•Diabetes Tipo II;

•Hipertensão arterial;

•Alzheimer.

Além de estudos para o melhoramento de carcteristicas vegetais.

EX.: Pré-disposição ao Alzheimer

Um dos genes associado ao Alzheimer, ApoE, é um bom exemplo de como os SNP’s podem afetar o desenvolvimento de doenças. Esse gene contém dois SNP’s, o que possibilita três possibilidades de alelos para esse gene – E2, E3, E4. Em cada alelo é alterado apenas uma base e a proteína produzida por cada gene difere em apenas um aminoácido.

Cada indivíduo herda uma cópia de ApoE do pai e outra da mãe. Pesquisas mostram que um indivíduo que herda no mínimo um alelo E4 possui chance muito maior de ter Alzheimer.

A herança do alelo E2, ao contrário, parece indicar que o indivíduo tem menos propensão de desenvolver a doença.

Constata-se a importância do estudo dos SNP’s para a detecção precoce da pré-disposição a certas doenças.

STR(Microssatélite)

Pequenas regiões em tandem

•São sequências de 2- 6 pares de bases em tandem.

•Distribui-se uniformemente por todo genoma humano.

•Eleita para a tipagem por DNA de vestígios biológicos em geral devido a sua simplicidade técnica, a pequena quantidade de DNA requerida, ao baixo custo, ao grande poder de resolução e aos altos níveis de polimorfismo.

• Técnica de PCR, onde vários pares de “primers” orientam simultâneas reações de amplificação, gerando produtos de múltiplos loci.

• Os alelos amplificados são separados em eletroforese em gel de poliacrilamida.

Tecnologia avançada:

• Acoplou-se a produção de primers marcados com diferentes corantes fluoróforos e sistemas de detecção a laser em aparatos de separação eletroforética.

• Os produtos de PCR marcados com fluorocromos podem ser detectados em tempo real mediante eletroforese capilar ou pode-se realizar a detecção pós-eletroforética em escaner de fluorescência

Metodologia

• Monitoramento de transplante de célula do tecido hematopoiético; • Teste forense;

• Reconstrução filogenética.

Aplicações

EX.:Rastreamento de linhagens paternas

Uma seqüência específica dos cromossomos X e Y, denominada amelogenina, também pode ser amplificada simultaneamente em um sistema multiplex, proporcionando a determinação do sexo do indivíduo doador da amostra biológica.

Este haplotipo é transmitido de pai para filho, ou seja, é perpetuado pelas gerações descendentes. Portanto, a tipagem de STRs de cromossomo Y proporciona o rastreamento de linhagens paternas.

Com análises de STR pôde-se mondar uma árvore filogenética que aponta três diferentes grupos basais que correspondem à três grupos étnicos –Africano, Caucasiano e Oriental

Referências

•Marcadores moleculares / Aluízio Borém, Eveline Teixeira Caixeta, editores. Viçosa, MG, 2006. 374p. :il.

•http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/faq/snps.shtml#snps (acessado em 27/04/2007)

•http://www.crbm1.com.br/bio65/artigocien_65.asp (acessado em 27/04/2007)

•http://www.ufv.br/dbg/trab2002/GMOL/GMOL003.htm(acessado em 28/04/2007) •http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/p_ci13_1.htm (acessado em 28/04/2007) •http://www.cnpsa.embrapa.br/met/palestra06.pdf (acessado em 28/04/2007)

•http://www.e-escola.pt/site/topico.asp?topico=402&ordem=0&canal=5 (acessado em 28/04/2007)

•http://www.cpatsa.embrapa.br/catalogo/livrorg/marcadormolecular.pdf (acessado em 29/04/2007)

•Griffits,I.S.,Anthony.2002 . Introdução à genética 7ª. Ed.Guanabara.Vogan.794p.