Lysspredningogendal/personal/lho/lysspredning.pdf · 2012. 2. 21. · store molekyler, f. eks. BSA,...

LysspredningLars Øgendal

Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet, 7. januar 2011

Indhold

1 Indledning 3

1.1 Hvad er lysspredning? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2 Simpel teori for statisk lysspredning 7

2.1 Rayleigh forholdet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.2 Dipoler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.3 Spredning af lys fra én lille usammensat partikel . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.4 Spredning fra et lille, sammensat molekyle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.4.1 Uden brug af komplexe tal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.4.2 Med brug af komplexe tal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.5 Spredning fra flere ens molekyler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.6 Resumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3 Molekylvægts- og størrelsesbestemmelse 27

3.1 Koncentrationseffekter for små molekyler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.2 Formfaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

3.3 Størrelsesbestemmelse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.3.1 Guinierapproximationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.4 Molekylvægt og størrelse i blandinger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.4.1 Gennemsnitsbestemmelser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.4.2 Detaljerede bestemmelser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.5 Resumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

iii

iv Indhold

4 Simpel teori for dynamisk lysspredning 414.1 Intensitetsfluktuationer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.2 Autokorrelationsfunktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.3 Data-analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.3.1 Monodisperse opløsninger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.3.2 Polydisperse opløsninger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

5 Lysspredning i praksis 555.1 Apparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

5.1.1 Koncentrationsmåling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

5.1.2 Inline måling af koncentration i forbindelse med SEC . . . . . . . . . . 58

5.1.3 Inline måling af lysspredning i forbindelse med SEC . . . . . . . . . . 61

5.1.4 Bestemmelse af molekylvægt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

A Komplekse tal 65

B Data fitning 69

0 Indhold

Forord

Dette notesæt handler om lysspredning forstået som en måleteknik. Selve det fysiske fænomen

lysspredning bliver gennemgået i det omfang, det er relevant for forståelsen af måleteknikken og

dermed for fortolkningen af data. Der er tilstræbt en blid indføring i emnet, så flere fænomener

bliver berørt gentagne gange men udfra forskellige anskuelser. Selve lyset bliver beskrevet som

elektromagnetisk stråling eller som fotoner afhængigt af, hvad der i den aktuelle sammenhæng

giver den simpleste beskrivelse.

1

2 Indhold

1Indledning

1.1 Hvad er lysspredning?

Det fænomen, at lys, der rammer en partikel (molekyle eller lign.), derved ændrer retning, kaldes

lysspredning.

Lidt forenklet kan man sige, at lys – ligesom anden elektromagnetisk stråling – vekselvirker

med stof på to måder:

1. Absorption (fotonerne forsvinder)

2. Spredning (fotonerne ændrer retning)

Hvis spredningen foregår på en tilpas ordnet måde, kan det på makroskopisk niveau give sig ud-

tryk i refleksion eller i brydning (refraktion). I disse noter forudsætter vi at spredningen foregår

på en (men – vil det vise sig – ikke fuldstændig) uordnet måde.

Begge vekselvirkningsfænomener giver anledning til at lysstråler svækkes på deres vej gennem

opløsninger1 (se figur 1.1). Lyset svækkes p.g.a. enten absorption eller spredning. I begge til-

fælde er den transmitterede intensitet eksponentielt aftagende med tykkelsen x af stoflaget. I

1Dette gælder også gasser og faste sto�er.

3

4 Kapitel 1. Indledning

forbindelse med absorption skrives I = I0 · 10−αx medens svækkelse ved spredning beskri-

ves som I = I0 · e−τx. Størrelserne α og τ kaldes hhv. absorptionskoefficienten og turbidite-

ten. Forskellen i grundtal for eksponentialfunktionen beror udelukkende på en konvention. Når

x

x

I = I0α x-10

I = I0 e τ x-

Figur 1.1: Det transmitterede lys svækkes p.g.a. absorption (øverst) eller spredning (nederst).

man indenfor fysik eller i kemi taler om lysspredning eller lyssprednings-målinger, underfor-

stås næsten altid at systemet, man måler på, er en opløsning af det stof, der er genstand for ens

undersøgelser.

Principperne for lysspredningsmåling diskuteres lettest ud fra en principskitse af en typisk må-

leopstilling for statisk lysspredning (dynamisk lysspredning kræver visse modifikationer). En

sådan ses i figur 1.2. Prøven befinder sig i en kuvette, der normalt har form som en cylin-

der. Prøven belyses med en monokromatisk lyskilde (dvs. en lyskilde, hvor lyset udsendes ved

kun én bølgelængde), hvis intensitet (eller effekt) monitoreres kontinuerligt. Intensiteten (el-

ler effekten) af det spredte lys registreres af en detektor, der kan være en fotodiode eller et

fotomultiplikatorrør (PMT), der betragter prøven under en kendt vinkel, θ.

Medens absorption af lys (og dermed detektoren) bedst forstås ud fra fotonbegrebet, forstås

1.1. Hvad er lysspredning? 5

LaserHalvgennemsigtigtspejl

Prøve-kuvette

Reference detektorDetektor

A/Dcon-verter

PC

θ

Figur 1.2: Principskitse af opstilling til måling af statisk lysspredning. Intensiteten af det spredte lys må-les som funktion af spredningsvinklen (detektorens betragtningsvinkel), θ. Den målte intensitet divideresmed intensiteten af den indkommende laserstråling, der derfor også måles vha. en reference detektor.

spredning af lys lettest ud fra en bølgebeskrivelse, jvf. elektromagnetisk strålingsteori (EMS).

Spredning af lys kan forklare en række dagligdags fænomener såsom, hvorfor himlen er blå,

hvorfor skyer er synlige når den vanddamp skyerne er dannet af ikke er det, hvorfor mælk er

hvidt, etc. . . . . Men spredning af lys kan som nævnt også anvendes som en eksperimentel meto-

de til at opnå information om makromolekyler og partikler i opløsning, nemlig om molekylvægt,

diffusionskoefficient, størrelse, form (i et vist omfang) og endelig vekselvirkningskræfter.

Disse noter behandler to lyssprednings-teknikker, nemlig statisk lysspredning (SLS) og dyna-

misk lysspredning (DLS), som vil blive omtalt i nævnte rækkefølge. Allerede nu kan det afslø-

res at statisk lysspredning benytter måling af den spredte middel lysintensitet som funktion af

spredningsvinklen (betragtnings-vinklen) θ, medens dynamisk lysspredning udnytter måling af

tidslige korrelationer i fluktuationerne (på µs skala) i intensiteten af det spredte lys, der til gen-

gæld normalt kun måles i en enkelt spredningsvinkel. Figur 1.3 illustrerer hvilke egenskaber

ved det spredte lys, der benyttes i de to teknikker.

Sammenfattende kan siges om forskellen mellem statisk og dynamisk lysspredning:

6 Kapitel 1. Indledning

0

2

4

8

10

0 1 2 3 4 5

6 In

tens

itet

< I >

Dynamisk lysspredning

Statisk lysspredning

tid (µ s)

Figur 1.3: Lys, der spredes fra en opløsning af makromolekyler, har en middelintensitet, der afspej-ler molekylvægten, medes intensitets-�uktuationerne har en karakteristisk �uktuationstid, der afspejlermolekylernes di�usionskoe�cient.

• Statisk lysspredning benytter måling af det spredte lys’ in-tensitet ved mange vinkler (typisk 10 – 100). Intensiteten,der benyttes er normalt en middelintensitet opnået ved atmidle i mindst 1 sekund. Den molekylære størrelsesinfor-mation ligger i selve intensiteterne ved de forskellige vink-ler.

• Dynamisk lysspredning benytter måling af lange serier aflysets middelintensitet, hvor midlingen foregår over så korttid (ned til 200 ns) at der er store fluktuationer i intensite-ten indenfor serien. Den molekylære størrelsesinformationligger i de karakteristiske fluktuationstider for intensiteten.

2Simpel teori for statisk lysspredning

Siden slutnigen af det 19. århundrede har lys været anvendt til bestemmelse af partikelstørrelser

(Tyndall 1869, Rayleigh 1871 og 1881) og senere til bestemmelse af makromolekylers mo-

lekylvægt (Debye 1944 og 47). Måleteknikken, der benyttes kaldes statisk lysspredning eller

SLS. Den bygger på det faktum, at når lys går igennem en opløsning af molekyler (partikler),

vil en del af lyset spredes ud i alle mulige retninger. Den del af lyset, der spredes kan være

så stor, at opløsningen virker helt ugennemsigtig. Dette gælder f. eks. mælk, der er hvidt for-

di lyset spredes af mikroskopiske fedtpartikler og proteinpartikler (caseinmiceller) i væsken. I

andre situationer er den brøkdel af lyset, der spredes så lille, at opløsningen virker fuldstændig

gennemsigtig for det blotte øje. Denne situation ville man have, hvis man så på en opløsning

af f. eks. 1 mg/mL BSA (bovin serum albumin, et protein med en molekylvægt på ca 66000

g/mol). For at se det spredte lys med øjnene kræves der en meget intens lyskilde (en laser), men

så ses det spredte lys også som et lysende spor, der trækkes gennem opløsnigen af laserstrålen

(se figur 2.1). Det er den sidstnævnte situation man er i, når lysspredning benyttes i praksis til

bestemmelse af molekylvægte.

Der er to betingelser, som lyset skal opfylde for at kunne anvendes til kvantitativ lysspredning.

Den ene er, at det benyttede lys skal være monokromatisk, dvs. have en veldefineret bølgelæng-

de. Den anden betingelse er, at lyset skal være kollimeret, dvs. det skal bevæge sig som et bundt

7

8 Kapitel 2. Simpel teori for statisk lysspredning

Figur 2.1: Laseren til højre i billedet udsender en intens lysstråle, der i princippet er usynlig set frasiden � med mindre der er støvpartikler til stede i luften. Når laserstrålen går igennem en opløsning afstore molekyler, f. eks. BSA, spredes noget af lyset af de opløste molekyler, således at strålen trækker etsynligt lysende spor gennem opløsningen.

af parallelle lysstråler. Almindelig hvidt lys består af bølgelængder mellem 300 og 700 nm og

er således ikke monokromatisk. Man kan så ved brug af passende farvefiltre, der kun tillader

en snæver gruppe af bølgelængder at passere (eller et prisme der skiller lyset i de forskellige

farvekomponenter, for derefter at udvælge en bestemnt farve (bølgelængde) ved at blokere for

de uønskede bølgelængder med en blænde). Jo mere præcis bølgelængden skal være, desto me-

re af det oprindelige lys skal fjernes, dvs. lyset bliver svagt. Betingelsen om at lyset skal være

kollimeret opnår man ved at sætte en lille blænde foran lyskilden, så det udsendte lys kommer

fra et lille område. Dernæst gøres de udsendte lysstråler parallelle ved at blive sendt gennem

et system af linser. Jo mindre hul der er i blænden jo mere parallelle kan linsen gøre strålerne.

Da målingens præcision afhænger af hvor godt lyset er monokromatiseret og hvor godt det er

kollimeret, ses det, at det benyttede lys nødvendigvis må blive ret svagt, hvis udgangspunktet er

hvidt lys. Og svagt lys sænker – alt andet lige – målingernes præcision.

Dette dilemma har i dag kun historisk interesse, da man nu benytter lasere som lyskilde. Statisk

lysspredning er i de senere år blevet genstand for fornyet interesse efter fremkomsten af kom-

mercielle laserbaserede instrumenter. Fordelen ved at benytte en laæser som lyskilde er, at den

udsender meget intenst lys, som samtidig er praktisk taget monokromatisk og som – uden brug

2.1. Rayleigh forholdet 9

af blændere – er kollimeret så godt som det er teoretisk muligt. Desuden er laserens lys som

regel polariseret (dvs. at lysets elektriske felt kun svinger i én retning), i modsætning til lys, der

er frembragt ved farvefiltrering af lyset fra f. eks. en glødelampe eller wn udladningslampe. At

lyset er polariseret er spredningsteknisk en fordel, men har den praktiske ulempe, at de formler

der benyttes til tolkning af måleresultaterne er forskellige for polariseret og for upolariseret lys.

Dette indebærer, at formler taget fra litteratur før 1960 (laserens opfindelsesår) skal benyttes

med stor varsomhed.

2.1 Rayleigh forholdet

Når man foretager en lysspredningsmåling på en opløsning af partikler, er det jo som regel med

det formål at opnå viden om opløsningen og ikke om apparaturet. Det er klart, at hvis man

erstatter lyskilden i spredningsapparaturet med en dobbelt så kraftig lyskilde, så vil den spredte

intensitet også fordobles ligesom en fordobling af afstanden mellem detektoren og prøven vil

resultere i en reduktion i den registrerede intensitet med en faktor 4, da denne jo er omvendt

proportional med anden potens af afstanden mellem spredende objekt og modtager. For at få en

størrelse, der er uafhængig af apparaturet, men kun afhænger af det studerede system, definerer

man Rayleigh forholdet Rθ for opløsningen, man studerer som

Rθ =Is(θ) · r2

I0 · Vs(θ)(2.1)

hvor Is(θ) er intensiteten af den spredte stråling målt i betragtningsvinklen θ jvf. figur 1.2, I0er intensiteten af den anvendte laser, Vs(θ) er spredningsvolumenet (dvs. det volumen som både

er belyst af laseren og som samtidig kan ses af detektoren – se figur 2.2), og r er afstanden fra

spredningsvolumenet til detektoren. Når vi i afsnit 2.4 går bort fra at beskrive spredningspro-

cesser ved hjælp af spredningsvinklen θ, men i stedet benytter længden q af spredningsvektoren

(se senere i kapitlet samt figur 2.8), defineret ved q = (4πn/λ) sin(θ/2), er det dermed naturligt

at opfatte Rayleighforholdet som en funktion af q:

R(q) =Is(q) · r2

I0 · Vs(q)(2.2)


θLaserstråle d1

d2

sigteområde

Vs

Figur 2.2: På grund af de blændere, der normalt anvendes i en detektor, ser den kun, hvad der liggerindenfor et vist sigteområde (en cylinder) af diameter d2, medens det belyste område tilnærmelsesvis eren cylinder med diameter d1. Skæringen mellem disse to områder kaldes spredningsvolumenet, Vs, og harden minimale værdi V0 når θ = 90◦. Der gælder tilnærmelsesvis, at Vs(θ) = V0/ sin(θ)

Det vil fremgå af de følgende afsnit, at R(q) er en funktion, der i første tilnærmelse afhænger

af• Molmassen af de opløste molekyler

• Koncentrationen af de opløste molekyler

• Brydningsindex af opløsningsmidlet

• Brydningsindex af de opløste molekyler

• Størrelsen af de opløste molekyler

men som derudover også afhænger af vekselvirkningskræfter mellem partiklerne.

2.2 Dipoler

For at forstå hvordan lys kan spredes af partikler eller molekyler, er det nødvendigt at vide hvad

en elektrisk dipol er.

En elektrisk dipol er et objekt, der har en asymmetrisk ladningsfordeling, normalt således at

der er en netto positiv ladning i den ene ende og en netto negativ ladning i den anden ende

(se figur 2.3). Dipolmomentet µ defineres for det simple tilfælde vist til venstre på figuren

som µ = d · Q, altså som produktet af separationen mellem den positive ladning Q og den

negative ladning −Q. Dipolmomentet kan være permanent eller induceret, dvs. fremkaldt af

et udefra kommende elektrisk felt. I forbindelse med spredning af lys er det kun inducerede

2.3. Spredning af lys fra én lille usammensat partikel 11

dipolmomenter, der er af betydning. I det mere generelle tilfælde, til højre på figuren, må man

definere dipolmomentet ved et integral 1. Det interessante ved det inducerede dipolmoment er,

at dets størrelse afhænger af styrken af det ydre elektriske felt, E, ved relationen µ = α · ϵ0 ·E,

(hvor ϵ0 = 8.85 · 10−12 F ·m−1 er vacuumpermittiviteten) ialtfald så længe det ydre felt ikke er

for stærkt. Størrelsen α kaldes polarisabiliteten for partiklen og udtrykker ladningernes villighed

til at lade sig flytte af et ydre elektrisk felt (en slags elektrisk "fjederkonstant").

d

- Q

+ Q

µ = d • Q

+ 300 V

- 300 V

----

E

Figur 2.3: Til vestre er vist en elektrisk dipol. Dipolmomentet µ de�neres som produktet af den halveladningsforskel (mellem de to ender) og deres afstand. Til højre er vist hvordan en partikel bliver til endipol når den udsættes for et ydre elektrisk felt.

2.3 Spredning af lys fra én lille usammensat partikel

Når spredning af lys skal diskuteres, er det formålstjenligt at beskrive lys som elektromagnetisk

stråling: Et elektrisk og et magnetisk felt svinger vinkelret på hinanden og på udbredelses- ret-

ningen med frekvensen ν (og dermed med den cykliske frekvens ω = 2πν). Kun det elektriske

felt er af betydning for lysspredning, idet det påvirker ladningerne i molekylet, så det polarise-

res (figur 2.4).

Ladningerne i molekylet flytter sig i takt med det indkommende felt, og molekylet bliver der-

ved til en oscillerende dipol, der svinger med samme frekvens, ν, som det lys, der rammer

det. Herved udsender molekylet ifølge elektromagnetisk strålingsteori (EMS)– som enhver an-

1Dipolmomentet er egentlig en vektor, µ⃗. Det kan beregnes som µ⃗ = 12

∫∫∫r⃗ (ρ(r⃗)−ρ)dV , hvor ρ(r⃗) er

ladningstætheden og ρ er middelladningstætheden, og integralet udstrækkes over legemet, der indeholderladningen.


t = 0

t = λ/(2c)

Figur 2.4: Det udefra kommende, svingende elektriske felt E forskyder ladningerne i molekylet, så detbliver positivt i den ene ende og negativt i den anden. Herved bliver molekylet til en svingende dipol medet dipolmoment µ = µ(t) = αE = E0 cos(ωt− kx) = µ0 cos(ωt− kx).

den oscillerende dipol – elektromagnetisk stråling i alle retninger, men med en intensitet, der

afhænger af retningen.

Vi vil her betragte den situation, at det indkommende lys er polariseret 2, dvs. at det elektriske

felt hele tiden svinger i samme plan (se figur 2.5)

Endvidere vil vi se på spredning af lyset fra én partikel, der antages at være meget mindre i

udstrækning end lysets bølgelængde λ. Partiklen er for nemheds skyld anbragt i koordinatsy-

stemets begyndelsespunkt. Det elektriske felt i lyset, der rammer den viste partikel (molekyle),

kan beskrives som en bølge, der udbreder langs x-aksen:

E(x, t) = Ey(x, t) = E0 cos(2πν(t− x/c)) (2.3)

hvor ν er lysets frekvens, c er dets hastighed og E0 er amplituden af lysets elektriske feltkompo-

nent. Hvis man definerer bølgetallet k = 2π/λ, hvor λ er lysets bølgelængde i det pågældende

medium 3 og benytter at ν/c = 1/λ kan 2.3 omskrives til:

E(x, t) = Ey(x, t) = E0 cos(ωt− kx) (2.4)

hvor ω som nævnt er lysets (feltets) cykliske frekvens.

Ifølge EMS er intensiteten I0 af det indkommende lys givet ved tids-middelværdien af anden

2Grunden hertil er, at det indkommende lys i vore dage normalt er udsendt af en (polariseret) laser. Iældre litteratur (før 1960) er alle udregninger i den sidste ende henført til upolariseret lys, da dette var,hvad der blev benyttet som standard i lysspredningsudstyr før laserens fremkomst. Dette gør at formlerfor lysspredning i ældre litteratur skal benyttes med stor varsomhed hvis de skal anvendes til tolkning afresultater opnået ved anvendelse af polariseret lys.

3Hvis lysets bølgelængde i vacuum benævnes λ0 og brydningsindex for mediet er n, skrives bølgetalletogså k = 2πn/λ0

2.3. Spredning af lys fra én lille usammensat partikel 13

φ

θMolekyle

z

x

y

r

EE 0 s,1(r)

Figur 2.5: Lys, der er polariseret i xz-planen, rammer et lille (meget mindre end lysets bølgelængde)molekyle, der derved selv kommer til at udsende lys i alle retninger. Intensiteten af det spredte lysafhænger af dets udbredelsesretning givet ved de to vinkler θ og ϕ.

potens af det elektriske felt:

I0(x) = ϵ0c⟨E2(x, t)⟩ = ϵ0c⟨E20 cos

2(ωt− kx)⟩ = ϵ0cE20⟨cos2(ωt− kx)⟩ (2.5)

hvor ϵ0 er vacuumpermittiviteten og c er lysets hastighed. Konstanten ϵ0c har værdien 2.656 ·10−3 F/s. Da middelværdien af cos2(ωt− kx) beregnet over selv meget kort tid er 1

2, fås

I0(x) =1

2ϵ0cE

20 (2.6)

Det elektriske felt Es,1(r) af den spredte stråling (fra én partikel; deraf 1-tallet i subskriptet) i

afstanden r fra molekylet (jvf. figur 2.5) er iflg. EMS givet ved

Es,1(r) = E0 ·(πα sinϕ

rλ2

)cos(ωt− kr) (2.7)

hvor λ er lysets bølgelængde (i det pågældende medium), α er molekylets polarisabilitet og r er

afstanden fra molekylet til detektoren. Bemærk, at Es,1(r) ikke afhænger af vinklen θ i forhold

til x-aksen.


Ved anvendelse af ligning 2.6 fås at intensiteten af det spredte lys er givet ved

Is,1(r) = ⟨ϵ0cE2s,1(r)⟩ =

1

2ϵ0cE

20 ·

π2α2 sin2 ϕ

r2λ4(2.8)

eller, ved anvendelse af ligning 2.6

Is,1(r) = I0 ·π2α2 sin2 ϕ

r2λ4(2.9)

Da lysspredningsapparatur normalt har detektoren anbragt i x-y-planen vil vi fra nu af forud-

sætte, at ϕ = 90◦, og vi får derfor at der for et lille molekyle gælder, at den spredte lysintensitet

er

Is,1(r) = I0 ·π2α2

r2λ4(2.10)

Heraf fremgår, ikke overraskende, at intensiteten af det spredte lys er proportional med inten-

sititen af det indkommende lys og omvendt proportional med kvadratet på afstanden fra det

spredende molekyle og detektoren. Hvad der derimod ikke umiddelbart var at forvente er, at

den spredte intensitet er omvendt proportional med λ4, dvs. at (når de spredende partikler er

små), blåt lys (λ ≈ 480 nm) spredes ca. 4.5 gange så effektivt som rødt lys (λ ≈ 700 nm).

Dette er som bekendt forklaringen på, hvorfor himlen er blå. Denne form for spredning, der

gælder når de spredende partikler er meget mindre end lysets bølgelængde4, kaldes Rayleigh

spredning, og er karakteriseret ved at være isotrop, dvs. lige kraftig i alle retninger i forhold

til det indkommende lys, og ved at det spredte lys har samme bølgelængde som det indkom-

mende lys. Hvis man måler Is,1(r), kan polarisabiliteten α bestemmes af ligning 2.10, idet de

øvrige størrelser er kendt. Ved at betragte figur 2.6 er det ikke vanskeligt at indse intuitivt, at

α er proportional med molekylets "størrelse"(volumen eller molekylvægt), idet sidestilling af

to småpartikler, hver med den molekylære polarisabilitet α1 i et givet felt giver dipolmomentet

µ = (2Q) · d, og endestilling af partiklerne giver dipolmomentet µ = Q · (2d). I begge tilfælde

bliver dipolmomentet det dobbelte af, hvad det er for en enkelt partikel.

På lignende måde indser man, at n partikler har dipolmomentet µ = nµ1, hvormed den sam-

mensatte partikel får polarisabiliteten α = nα1. Da n = M/M1, hvor M er den sammensatte

partikels molekylvægt og M1 er den lille partikels molekylvægt, fås, at α = (α1/M1) · M .

Det fremgår herved af ligning 2.10, at den spredte lysintensitet for et enkelt molekyle er pro-

portional med molekylvægten i anden potens. For molekyler, der er store i forhold til lysets4der kræves i virkeligheden også at α er lille; herom senere

2.4. Spredning fra et lille, sammensat molekyle 15

+ 300 V

- 300 V

E d

d

d- Q

- Q

- Q

- Q

+ Q

+ Q

+ Q

+ Q

Figur 2.6: To små partikler har hver dipolmomentet µ0 = Q · d. Sidestilling af to partikler giver dipol-momentet µ = (2Q) ·d medens endestilling giver µ = Q · (2d), idet +Q og -Q i midten ophæver hinanden.Resultatet er i begge tilfælde at µ = 2µ1. Argumentet kan let generaliseres til n partikler.

bølgelængde, kan argumentet ikke anvendes, da molekylet ikke har en veldefineret polarisa-

tionstilstand. Denne situation vil vi nu begynde at se på, men gør det først grundigt i afsnit 3.2.

2.4 Spredning fra et lille, sammensat molekyle

Vi skal her se, hvordan den måde lysets måde at spredes på, er bestemt af interferens mellem

de forskellige bidrag til den samlede spredte stråling, der stammer fra forskellige punkter i

den sammensatte partikel. Hvis man er fortrolig med anvendelsen af komplexe tal, kan denne

beskrivelses mellemregninger laves simpelt. Men vi starter med at gennemgå teorien uden brug

af komplexe tal og viser så bagefter, i afsnit 2.4.2, hvordan mellemregningerne bliver simplere

med brug af komplexe tal.

2.4.1 Uden brug af komplexe tal

Dette afsnit kan som sagt springes over, hvis man foretrækker beskrivelsen baseret på komplexe

tal.

Som sædvanlig kunne vi ligeså godt tale om "partikler"som om molekyler, det afgørende for

udledningerne i dette og i det følgende afsnit er, at partiklerne kan tænkes opdelt i mindre

partikler, der alle har samme polarisabilitet, α.

For at beskrive spredning af lys er det hensigtsmæssigt at gå bort fra at anvende sprednings-


vinklen, θ, men i stedet benytte den såkaldte spredningsvektor, q⃗. Denne er defineret ud fra bøl-

gevektoren, k⃗, der er en vektor, der peger i lysets (fotonernes) udbredelsesretning, og som har

længden |⃗k| = 2π/λ, dvs det i afsnit 2.3 definerede bølgetal. Når en foton med bølgevektoren

k⃗ind rammer et molekyle og derved ændrer retning (spredes), får den bølgevektoren k⃗ud (se k-

vektorerne i figur 2.7) Ændringen i bølgevektoren kaldes spredningsvektoren q⃗ = k⃗ud − k⃗ind.

k ind

R

k ud

r

E1

E2

l

Figur 2.7: Monokromatisk lys med bølgelængden λ, og bølgevektoren k⃗ind, rammer to små partikler ad-skilt ved vektoren r⃗. Detektoren tænkes anbragt i afstanden R fra koordinatsystemets begyndelsespunkt.De to partikler spreder lyset, der detekteres langt fra partiklerne, hvor feltbidragene er hhv. E1 og E2,der har samme amplitude.

Længden q af spredningsvektoren beregnes let ved at betragte figur 2.8. Man ser, at q = 2a, hvor

a = k · sin θ2

og længden af bølgevektoren k = 2πλ

. Heraf fås, at længden af spredningsvektoren

kan skrives q = 4πλsin θ

2. Her står λ for lysets bølgelængde i udbredelsesmediet. Det er imidler-

tid praksis, at benytte lysets bølgelængde λ0 i vacuum (i praksis det samme som i luft) i stedet

for. Hertil benyttes, at λ = λ0/n, hvor n er mediets brydningsindex. Brydningsindexet for et

stof angiver med hvilken faktor lysets hastighded i stoffet er reduceret i forhold til hastigheden


i vacuum. Altså:

n =cvacuumcmedium

(2.11)

Herefter kan vi så skrive længden af spredningsvektoren

q =4πn

λ0

sinθ

2(2.12)

k

k qa

aq /2

q /2q

k ind

k udq

Figur 2.8: Til venstre ses, at spredningsvektoren q⃗ = k⃗ud − k⃗ind. Til højre ses, at q = 2a, hvor a =k · sin θ

2 . Da det spredte lys har samme bølgelængde som det indkommende lys er |⃗kud| = |⃗kind| ≡ k, hvor

længden af bølgevektoren k = 2πλ . Heraf fås længden af spredningsvektoren q = 4π

λ sin θ2 . Det bemærkes,

at λ er bølgelængden af lyset i det pågældende medium. Indføres vacuumbølgelængden λ0 og medietsbrydningsindex n, kan men også skrive q = 4πn

λ0sin θ

2

De spredte elektriske felter stammende fra de to partikler i figur 2.7 kan beskrives som plane

bølger med samme amplitude, når man befinder sig i stor afstand fra de spredende partikler.

Egentlig er det spredte felt fra hver partikel jo en kuglebølge, men betragtet i stor afstand og

indenfor et begrænset område kan de betragtes som værende plane:

E1 = E0 cos(ωt− R⃗ · k⃗ud) (2.13)

E2 = E0 cos(ωt− R⃗ · k⃗ud +∆ϕ)

hvor faseforskellen ∆ϕ (ikke at forveksle med den tidligere benyttede vinkel ϕ mellem det

spredte lys’ udbredelsesretning og koordinatsystemets z-akse) skyldes at der er en vejlængde-

forskel, ∆s, for lys der når detektoren fra de to molekyler. Vejlængdeforskellen kan udregnes at


have værdien ∆s = r⃗ · q⃗/|⃗kud|, hvor r⃗ er en vektor, der går fra den ene partikel til den anden,

og giver anledning til faseforskellen

∆ϕ = r⃗ · q⃗ (2.14)

Intensiteten Itotal af det totale felt E = E1 + E2 beregnes vha. ligning 2.13:

Itotal = ϵ0c⟨E2⟩

= ⟨(E0 cos(ωt− R⃗ · k⃗ud) + E0 cos(ωt− R⃗ · k⃗ud +∆ϕ))2⟩

= ϵ0cE20⟨cos2(ωt− R⃗ · k⃗ud) + cos2(ωt− R⃗ · k⃗ud +∆ϕ) +

2 cos(ωt− R⃗ · k⃗ud) · cos(ωt− R⃗ · k⃗ud +∆ϕ)⟩ (2.15)

De to første led i 2.15 (dem med cos2) har begge middelværdien 12. Det sidste led i 2.15

beregnes ved brug af en af de utallige trigonometriske formler:

cos x · cos y =1

2· [cos(x+ y) + cos(x− y)]

hvormed:

2 cos(ωt− R⃗ · k⃗ud) · cos(ωt− R⃗ · k⃗ud +∆ϕ) = cos(2ωt− 2R⃗ · k⃗ud +∆ϕ) + cos(∆ϕ) (2.16)

Middelværdien af det første led på højre side i 2.16 er 0, det sidste led er konstant og har derfor

middelværdien cos(∆ϕ)

Ialt fås så:

Itotal = ϵ0cE20 · (1 + cosϕ) = 2 · Is, 1 · (1 + cos(∆ϕ)) (2.17)

Dvs at lyset, der er spredt fra to partikler, kan være fra 0 til 4 gange så intenst som lyset spredt

fra en enkelt partikel. Dette resultat skal nu generaliseres:

I stedet for at tillægge feltbidraget E2 den ekstra fase ϕ kunne man naturligvis ligeså godt have

tillagt E1 fasen ϕ1 og E2 fasen ϕ2, så ϕ2 − ϕ1 = ∆ϕ.

Vi skal nu generalisere ligning 2.17, så hvis vi i stedet for to små partikler betragter et molekyle

sammensat af n underenheder (f. eks. aminosyrer), der tænkes nummereret i = 1, 2, . . . , n, (se

figur 2.9) bliver det totale, spredte elektriske felt (fra de n underenheder; deraf n i subskriptet)

på detektorens plads, Es, n, tilsvarende:

Es, n =n∑

j=1

E0 cos(ωt+ ϕj) (2.18)


i

j

rij

ri

rj

x

y

z

Figur 2.9: Molekylet består af n ens underenheder ("sub units"), og belyses på samme måde som visti �gur 2.7. I detektorens afstand fra molekylet giver de feltbidrag med samme amplitude E0 men medforskellige faser ϕ1, ϕ2, ϕn. Positionerne af de enkelte underenheder er beskrevet ved stedvektorerne r⃗1,r⃗2. . . , r⃗n

hvormed den totale spredte intensitet Is, n er givet ved

Is, n = ϵ0c⟨E2s, n⟩

= ϵ0c⟨

n∑j=1

E0 cos(ωt+ ϕj)

·(

n∑i=1

E0 cos(ωt+ ϕi)

)⟩

= ϵ0cE20⟨

n∑j=1

n∑k=1

cos(ωt+ ϕi) · cos(ωt+ ϕj)⟩

= ϵ0cE20⟨

n∑j=1

n∑k=1

1

2[cos(2ωt+ ϕi + ϕj) + cos(ϕi − ϕj)]⟩ (2.19)

Her ser man, at leddene cos(2ωt+ ϕi + ϕj) har middelværdi 0 og at de øvrige led er konstante.

Hermed fås så:

Is, n = Is, 1n∑

j=1

n∑k=1

cos(ϕj − ϕk) (2.20)

hvor Is, 1 som sædvanlig betegner intensiteten af lyset spredt fra én underenhed af molekylet.

Hvis molekylets udstrækning, d, er meget mindre end lysets bølgelængde, så d·k = d·2π/λ ≈ 0,

er faseforskellene |ϕj − ϕk| = |r⃗j · q⃗ − r⃗k · q⃗| = |r⃗jk · q⃗| ≤ d · 2k ≈ 0. Herved fås, at for samt-

lige led i ligning 2.20 er cos(ϕj − ϕk) ≈ cos(0) = 1. Da dobbeltsummen indeholder ialt n2 led


fås:

Is, n ≈ Is, 1 · n2 (2.21)

og da n = M/M1, hvor M er molekylvægten og M1 er massen af en molekylær underenhed, er

Is, n ≈ (Is, 1/M21 ) ·M2 (2.22)

altså det samme resultat som blev udledt i afsnit 2.3, at spredningsevnen for et enkelt, lille

molekyle er proportionalt med molekylvægten i anden potens. Bemærk, at resultatet er gyldigt

når molekylet er så lille, at lysets faseforskelle indenfor molekylet er nær 0. Hvordan denne

indskrænkning undgås, behandles i afsnit 3.2

2.4.2 Med brug af komplexe tal

Dette afsnit er et alternativ til afsnit 2.4.1. Beskrivelsen er baseret på kompleks notation af

sinusformede bølger. Dette fører til en stærk simplifikation af de efterfølgende beregninger.

Appendix A beskriver kort, hvordan komplexe tal anvendes. Ordlyden er i det store hele en

gentagelse af ordlyden i afsnit 2.4.1, så dette afsnit kan læses uafhængigt af det foregående

afsnit.

For at beskrive spredning af lys er det hensigtsmæssigt at gå bort fra at anvende sprednings-

vinklen, θ, men i stedet benytte den såkaldte spredningsvektor, q⃗. Denne er defineret ud fra

bølgevektoren, k⃗, der er en vektor, der peger i lysets (fotonernes) udbredelsesretning, og som

har længden |⃗k| = 2π/λ, dvs det i afsnit 2.3 definerede bølgetal. Når en foton med bølge-

vektoren k⃗ind rammer et molekyle og derved ændrer retning (spredes), får den bølgevekto-

ren k⃗ud (se k−vektorerne i figur 2.7). Ændringen i bølgevektoren kaldes spredningsvektoren

q⃗ = k⃗ud − k⃗ind. Længden q af spredningsvektoren beregnes let ved at betragte figur 2.8. Man

ser, at q = 2a, hvor a = k · sin θ2

og længden af bølgevektoren k = 2πλ

. Heraf fås, at længden

af spredningsvektoren kan skrives q = 4πλsin θ

2. Her står λ for lysets bølgelængde i udbredel-

sesmediet. Det er imidlertid praksis, at benytte lysets bølgelængde λ0 i vacuum (i praksis det

samme som i luft) i stedet for. Hertil benyttes, at λ = λ0/n, hvor n er mediets brydningsindex.

Brydningsindexet for et stof angiver med hvilken faktor lysets hastighded i stoffet er reduceret

i forhold til hastigheden i vacuum. Altså:

n =cvacuumcmedium

(2.23)


Herefter kan vi så skrive længden af spredningsvektoren

q =4πn

λ0

sinθ

2(2.24)

De spredte elektriske felter stammende fra de to partikler er begge beskrevet som bølger, der

har samme amplitude:

E1 = E0ei(ωt−R⃗·⃗kud) (2.25)

E2 = E0ei(ωt−R⃗·⃗kud+∆ϕ)

hvor faseforskellen ∆ϕ (ikke at forveksle med den tidligere benyttede vinkel ϕ mellem det

spredte lys’ udbredelsesretning og koordinatsystemets z-akse) skyldes, at der er en vejlængde-

forskel, ∆s, for lys der når detektoren fra de to molekyler. Vejlængdeforskellen kan udregnes

at have værdien ∆s = r⃗ · q⃗/|⃗kud|, hvor r⃗ er en vektor, der går fra den ene spredende partikel til

den anden, og giver anledning til faseforskellen

∆ϕ = r⃗ · q⃗ (2.26)

Intensiteten Itotal af det totale felt E = E1 + E2 beregnes vha. ligning 2.25:

Itotal =1

2ϵ0c|E|2

=1

2ϵ0cE · E∗

= (E0ei(ωt−R⃗·⃗kud) + E0e

i(ωt−R⃗·⃗kud+∆ϕ)) · (E0e−i(ωt−R⃗·⃗kud) + E0e

−i(ωt−R⃗·⃗kud+∆ϕ))

=1

2ϵ0cE

20(1 + 1 + ei∆ϕ + e−i∆ϕ)

=1

2ϵ0cE

20(2 + 2 cos(ϕ)) (2.27)

hvor E∗ betegner komplekskonjugering af E. Ligning 2.27 kan også skrives

Itotal = ϵ0cE20 · (1 + cosϕ) = 2 · Is, 1 · (1 + cos(∆ϕ)) (2.28)

dvs. samme resultat som fundet i foregående afsnit i ligning 2.17

I stedet for at tillægge feltbidraget E2 den ekstra fase ∆ϕ kunne man naturligvis ligeså godt

have tillagt E1 fasen ϕ1 og E2 fasen ϕ2, så ϕ2 − ϕ1 = ∆ϕ.


Hvis vi i stedet for to små partikler betragter et molekyle sammensat af n underenheder (f. eks.

aminosyrer), der tænkes nummereret i = 1, 2, . . . , n, (se figur 2.9), bliver det totale, spredte

elektriske felt på detektorens plads, Es, n, tilsvarende:

Es, n =n∑

j=1

E0ei(ωt+ϕj) (2.29)

hvormed den totale spredte intensitet Is, n er givet ved

Is, n =1

2ϵ0cEs, nE

∗s, n

=1

2ϵ0c

n∑j=1

E0ei(ωt+ϕj)

( n∑k=1

E0e−i(ωt+ϕk)

)

=1

2ϵ0cE

20

n∑j=1

n∑k=1

ei(ϕj−ϕk)

= Is, 1n∑

j=1

n∑k=1

ei(ϕj−ϕk)

= Is, 1n∑

j=1

n∑k=1

(cos(ϕj − ϕk) + i sin(ϕj − ϕk))

= Is, 1n∑

j=1

n∑k=1

cos(ϕj − ϕk) (2.30)

hvor Is, 1 betegner (middel)intensiteten af lyset spredt fra én underenhed af molekylet, og hvor

der ved overgangen til den sidste linie er benyttet, at sin(ϕj − ϕk) = − sin(ϕk − ϕj), så si-

nusleddene parvis går ud mod hinanden. Hvis molekylets udstrækning, d, er meget mindre end

lysets bølgelængde, så d · k = d · 2π/λ ≈ 0, er faseforskellene |ϕj − ϕk| = |r⃗j · q⃗ − r⃗k · q⃗| =|r⃗jk · q⃗| ≤ d · 2k ≈ 0. Herved fås, at for samtlige led i ligning 2.30 er cos(ϕj − ϕk) ≈ cos(0) = 1.

Da dobbeltsummen indeholder ialt n2 led fås:

Is, n ≈ Is, 1 · n2 (2.31)

og da n = M/M1, hvor M er molmassen og M1 er massen af en molekylær underenhed, er

Is, n ≈ (Is, 1/M21 ) ·M2 (2.32)

altså det samme resultat som blev udledt i afsnit 2.3, at spredningsevnen for et enkelt, lil-

le molekyle er proportionalt med molvægten i anden potens. Bemærk, at resultatet er gyldigt

når molekylet er så lille, at lysets faseforskelle indenfor molekylet er nær 0. Hvordan denne

indskrænkning undgås behandles i afsnit 3.2

2.5. Spredning fra �ere ens molekyler 23

2.5 Spredning fra flere ens molekyler

Vi vil nu se på den situation, at lyset spredes fra N molekyler, der befinder sig i et volumen,

V , som er jævnt belyst af den indkommende stråling og som samtidig kan ses af detektoren.

Molekylerne antages alle at være af samme art som diskuteret ovenfor (se figur 2.10) Man

i

j

ri

rij

rj

x

y

z

Figur 2.10: N ens molekyler be�nder sig i et jævnt belyst volumen af en størrelse, så lyset spredt frasamtlige molekyler kan nå detektoren.

kan nu genbruge ligning 2.20, men hvor de individuelle spredere nu er hele molekyler, hvis

spredningsintensitet er givet ved ligning 2.22

Is, total = Is, nN∑j=1

N∑k=1

cos(ϕj − ϕk) (2.33)


Da man i statisk lysspredning interesserer sig for middelintensiteten af det spredte lys skal denne

beregnes:

⟨Is, total⟩ = Is, nN∑j=1

N∑k=1

⟨cos(ϕj − ϕk)⟩ (2.34)

Da molekylerne bevæger sig uafhængigt af hinanden, ændrer faserne ϕj og ϕk sig hele ti-

den uafhængigt af hinanden, hvorfor ϕj − ϕk kan antage alle værdier, hvis j ̸= k. Derfor er

⟨cos(ϕj − ϕk)⟩ = 0 hvis j ̸= k medens de N led, hvor j = k har ⟨cos(ϕj − ϕk)⟩ = ⟨cos(0)⟩ = 1.

Derfor kan ligning 2.34 skrives

⟨Is, total⟩ = Is, n ·N (2.35)

Da antallet, N , af partikler i volumenet V er givet ved den molære koncentration c ved udtrykket

N = V · c kan ligning 2.35 omskrives ved hjælp af ligning 2.22:

⟨Is, total⟩ = Is, n ·NAcV

= (Is, 1/M21 ) ·NAcV ·M2

= (Is, 1NAV/M21 ) · c ·M2

= (Is, 1NAV/M21 ) · C ·M (2.36)

hvor NA er Avogadros tal og C er vægtkoncentrationen.

Idet spredningsintensiteten for én molekylær underenhed, Is, 1, er proportional med laserens

intensitet og omvendt proportional med detektorens afstand, r kvadreret, dvs. Is, 1NA/M21 =

K · I0/r2, kan ligning 2.36 også skrives

Is, total = KI0V CM/r2 (2.37)

eller med definitionen 2.2 på Rayleighforholdet, R(q):

R(q) = KCM (2.38)

Konstanten K kan ret nemt vises5 at være relateret til opløsningens og de opløste partiklers

brydningsindex ved udtrykket:

K =4π2n2

0(dn/dC)2

NAλ40

(2.39)

5Se f.eks. udledningen i Physical Biochemistry, second edition, K. E. van Holde, Prentice Hall 1985

2.6. Resumé 25

hvor n0 er brydningsindex for opløsningsmidlet, λ0 er laserens bølgelængde i vakuum og dn/dC

er opløsningens brydningsindex differentieret mht. vægtkoncentrationen af opløst stof. Størrel-

sen dn/dC kaldes det differentielle brydningsindex increment, og har for de fleste proteiner i

vand værdier i området 0.18 – 0.20 ml g−1 og for de fleste polysakkarider værdier på omkring

0.15 ml g−1.

I ligning 2.38 er Rayleighforholdet R(q) en målt størrelse. Koncentrationen C kan som regel

også let bestemmes. Derved kan molekylvægten M øjensynlig let bestemmes, idet K kan bereg-

nes på forhånd ud fra 2.39 ved at man i en separat måling bestemmer dndC

, benytter en tabelværdi

for dndC

eller benytter er "sandsynlig"værdi herfor.

2.6 Resumé

Her følger de vigtigste formler fra kapitlet:

Brydningsindex:

n =cvacuumcmedium

Den optiske kontrastkonstant:

K =4π2n2

0(dn/dC)2

NAλ40

Spredningsvektoren:

q⃗ = k⃗ud − k⃗ind

Spredningsvektorens længde:

q = |q⃗| = 4πn

λ0

· sin(θ

2

)

Rayleighforholdet:

R(q) =Is(q) · r2

I0 · Vs(q)

3Molekylvægts- og størrelsesbestemmelse

En væsentlig grund til at foretage lysspredningsmålinger er, som ligning 2.38 viser, muligheden

for at bestemme molekylvægte. Dette kompliceres imidlertid af en række forhold, der vil blive

gjort rede for i det følgende. Hvis de undersøgte molekyler imidlertid er små (i praksis mindre

end λ/20), og deres koncentration er lav (her er et kriterium vanskeligt at stille op), er det

imidlertid uproblematisk, ialtfald i princippet. Denne situation vil vi nu se på:

3.1 Koncentrationseffekter for små molekyler

Den simple sammenhæng (ligning 2.35 eller 2.38), at den spredte lysintensitet er proportio-

nal med vægtkoncentrationen af de opløste molekyler, holder normalt ikke for vilkårligt høje

koncentrationer. Årsagen hertil er indlysende, idet ligning 2.35 jo var baseret på, at de en-

kelte opløste molekyler bevæger sig uafhængigt af hinanden. At dette ikke i praksis kan være

tilfældet ligger bl.a. i at, dér hvor der ligger ét molekyle, kan der jo ikke ligge et andet, så i

den forstand er molekylernes positioner trivielt afhængige af hinanden. Det er vel også intuitivt

klart at denne effekt af pladsmangel vil blive mere og mere udtalt jo højere koncentrationen af

de opløste molekyler er. Mere generelt skyldes den indbyrdes afhængighed mellem molekyler-

nes positioner at der virker kræfter imellem dem, som bevirker at nogle afstande vil være mere

27

28 Kapitel 3. Molekylvægts- og størrelsesbestemmelse

sandsynlige end andre. Den førnævnte effekt benævnes "excluded volume"effekten, og kan ses

som et udtryk for at der på kort afstand virker stærke frastødningskræfter mellem molekylerne,

som forhindrer at de trænger ind i hinanden.

Dobbeltsummen i ligning 2.34 divideret med antallet N af molekyler i spredningsvolumenet

kaldes for den statiske strukturfaktor, og betegnes S(q):

S(q) = N−1 ·N∑j=1

N∑k=1

⟨cos(ϕj − ϕk)⟩ (3.1)

Antagelsen om, at molekylerne bevæger sig uafhængigt af hinanden leder som vist til at dob-

beltsummen i ligning 2.34 antager værdien N , eller med andre ord, at S(q) = 1. Herved kan

udtrykket 2.38 for Rayleighforholdet generaliseres:

R(q) = KCMS(q) (3.2)

Problemet er naturligvis, at beregne S(q). For små (isotropt spredende) partikler, kan det vises

(se f.eks. Physical Chemistry of Macromolecules, C. Tanford, OUT-OF-PRINT-BOOKS-ON-

DEMAND 1992) at Rayleighforholdet er relateret til de opløste molekylers osmotiske tryk, Π

ved udtrykket:KC

R(q)=

1

RT

(∂Π

∂C

)T,P

(3.3)

hvor R er gaskonstanten. Da det osmotiske tryks koncentrationsafhængighed normalt beskrives

ved rækkeudviklingen:Π

RT=

1

MC + A2C

2 + A3C3 + · · · (3.4)

hvor konstanterne A2, A3, . . . betegnes den 2., 3. virialkoefficient osv., kan ligning 3.3 skrives:

KC

R(q)=

1

M+ 2A2C + 3A3C

2 + · · · (3.5)

I praksis bryder man normalt af efter den 2. virialkoefficient. Denne er en størrelse som un-

der visse omstændigheder kan beregnes teoretisk, men som normalt bestemmes eksperimentelt.

Så vidt koncentrationseffekter. Men vi mangler at se på effekten af at molekylerne ikke nød-

vendigvis er så små, at de spreder isotropt, før vi kan anvise en metode til bestemmelse af

molekylvægte:

3.2. Formfaktoren 29

3.2 Formfaktoren

At lyset fra et molekyle spredes isotropt hænger som før nævnt på, at de forskellige sprednings-

bidrag fra molekylets enkelte dele er i fase, og dette hænger igen på, at molekylets udstrækning

er lille i forhold til lysets bølgelængde. Hvis ikke molekylerne er meget mindre end lysets bøl-

gelængde spredes lyset normalt med en effektivitet,der aftager med stigende spredningsvinkel

og dermed med stigende q-værdi. Dette gælder for partikler uden markant symmetri (som f.eks.

ens kugler eller ens cylindre) medens spredningsintensiteten som funktion af q for eksempel-

vis kugler udviser maxima og minima. Hvis man for en opløsning af partikler af en bestemt

størrelse og form måler intensiteten af det spredte lys, Is(q), som funktion af q definerer man

formfaktoren for disse partikler, P (q) som den normaliserede spredningsintensitet:

P (q) = Is(q)/Is(0) (3.6)

hvor Is(0) normalt må findes ved ekstrapolation af Is(q) til q = 0, da denne værdi ikke er tilgæn-

gelig for direkte måling. En anden måde at opfatte formfaktoren på er, at den udrykker forholdet

mellem spredningsintensiteten for de aktuelle partikler divideret med spredningsintensiteten for

uendeligt små partikler med samme partikelmasse. For meget små partikler er P (q) ≈ 1 for selv

de største værdier af q (der for λ = 633 nm og en spredningsvinkel på 180◦ i vand med bryd-

ningsindex n = 1.333 giver qmax = 0.026 nm−1). For større partikler fås formfaktor-kurver der

kvalitativt ser ud som vist på figur 3.1 Det skal bemærkes at funktionen P (q) undertiden kaldes

spredningsfunktionen. Formfaktoren kan beregnes ved at benytte ligning 2.20 og 2.21 idet man

husker, at ϕj − ϕk = r⃗j · q⃗ − r⃗k · q⃗ = r⃗jk · q⃗. Idet ligning 2.20 gælder generelt og ligning 2.21

gælder for uendeligt små partikler med samme masse, fås formfaktoren ved at dividere den

første ligning med den sidste og dernæst midle over alle mulige orienteringer af molekylet1:

P (q) = ⟨ 1n2

n∑j=1

n∑k=1

cos(ϕj − ϕk)⟩ =1

n2

n∑j=1

n∑k=1

⟨cos(r⃗jk · q⃗)⟩ (3.7)

Middelværdien kan let beregnes ved at indføre et koordinatsystem med z-aksen i q⃗’s retning og

dernæst udføre beregningen i polære koordinater (med de to vinkler θ i forhold til z-aksen og ϕ

i xy-planen). Man bemærker, at r⃗jk · q⃗ = q rjk ·cos(θ) i dette koordinatsystem, så middelværdien

1Da formfaktoren gælder spredning fra en opløsning af molekyler med tilfældige orienteringer, skal dernaturligvis blot midles over alle orienteringer for ét molekyle


0 0.01 0.02 0.03q (1/nm)

0

0.5

1

P(q

)

r = 25 nmr = 100 nmr = 400 nm

Figur 3.1: Formfaktoren bliver mere og mere stejlt aftagende jo større partikler den repræsenterer.Bemærk at formfaktoren altid har værdien 1 for q = 0

af ét led i ligning 3.7 er givet ved

1

4π

∫ 2π

0

∫ π

0cos(q rjk · cos(θ)) · sin(θ) dθ dϕ =

sin(q rjk)

q rjk(3.8)

der er udregnet ved anvendelse af substitution (sæt x = q rjk cos(θ) ). Herved fås det generelt

gyldige udtryk for formfaktoren for et vilkårligt molekyle:

P (q) =1

n2

n∑j=1

n∑k=1

sin(q rjk)

q rjk(3.9)

Dette generelle udtryk for formfaktoren kan naturligvis beregnes (på computer) hvis man kender

molekylernes struktur, eller man kan approximere molekylerne med simple geometriske former,

som kugler, ellipsoider, cylindre etc. og dernæst foretage en analytisk beregning ved integration

(hvis det er muligt). Eksemler herpå er vist i afsnit 3.5. Men ofte er man interesseret i at foretage

en approximativ beregning af P (q) ud fra ligning 3.9 ( se næste afsnit).

Ved brug af formfaktoren kan Rayleighforholdet i ligning 2.38 (hvis koncentrationen er så

lav, at partiklerne ikke vekselvirker) altså skrives R(q) = KCP (q)M , hvormed KC/R(q) =

1/(MP (q)). Det er derfor ikke overraskende at vi kan generalisere ligning 3.5 ved det endelige

udtryk:KC

R(q)=

1

MP (q)+ 2A2C + 3A3C

2 + · · · (3.10)

3.3. Størrelsesbestemmelse 31

Princippet i molekylvægtsbestemmelse er nu oplagt: Man skal ’bare’ for et antal koncentratio-

ner, C1, C2, C3, . . . , hvor Cn → 0, måle Rayleighforholdet R(q) ved et antal q-værdier, q1,

q2, q3, . . . , hvor qn → 0. Herefter foretager man en ekstrapolation af KCR(q)

til C = 0 for hver

q−værdi, hvorved man finder 1/(MP (q)), svarende til den såkaldte tilsyneladende molekylvægt

Mapp ved den pågældende spredningsvinkel (eller q-værdi). Den tilsyneladende molekylvægt

for en bestemt q-værdi er altså defineret som

Mapp = MP (q) (3.11)

Når de tilsyneladende molekylvægte ved de forskellige q-værdier er bestemt, ekstrapoleres de

til q = 0. Herved får man så den sande molekylvægt M , idet jo P (0) = 1. I praksis fortages

denne ekstrapolation til q = 0 ved at man laver et Guinier-plot som beskrevet i afsnit 3.3.1.

3.3 Størrelsesbestemmelse

Som lige vist afspejler molekylernes (partiklernes) størrelse og form sig i formfaktoren. Hvis

ikke partiklerne er meget små, så formfaktoren kan anses for at være konstant lig med 1, er

det nødvendigt at måle intensitetens af det spredte lys ved flere vinkler, så man kan foretage

ekstrapolationen af den spredte intensitet til en spredningsvinkel på 0◦ (q = 0). Dette kan

naturligvis virke som en besværlig fremgangsmåde, hvad det også er, hvis man kun er intersseret

i molekylvægten. På den anden side, hvis formfaktoren ikke er konstant lig med 1, så indholder

den oplysninger om molekylernes form og størrelse. I mange tilfælde er man tilfreds med et

forholdvis groft mål for størrelsen af molekylerne, og vi skal her se hvordan dette kan opnås.

Det størrelsesmål man er i stand til at bestemme kaldes for molekylernes gyrationsradius og

betegnes Rg. Vejen til at finde gyrationsradius går gennem beregning af nyttige approximationer

til formfaktorudtrykket3.9.

3.3.1 Guinierapproximationen

Hvis q rjk < 1, kan funktionerne i ligning 3.9 approximeres ved deres rækkeudvikling til 1.

orden. Da sin(x) = x− 13x3 + · · · fås så, at

P (q) ≈ 1

n2

n∑j=1

n∑k=1

(1− 1

6(q rjk)

2) (3.12)


Da 1n2

∑nj=1

∑nk=1(1) =

1n2 · n2 = 1, kan ligning 3.12 skrives som

P (q) ≈ 1− 1

3q2 R2

G (3.13)

hvor RG kaldes for partiklernes gyrationsradius og er defineret ved

R2G =

1

2 n2

n∑j=1

n∑k=1

r2jk (3.14)

Bemærk at enhver partikel har en gyrationsradius; approximationen til formfaktoren ligger i at

se bort fra partiklens detaljerede struktur og erstatte denne med en enkelt parameter: Gyrations-

radius. Approximationen 3.13, der kaldes for Debye approximationen benyttes undertiden som

en er, men lider af den skavank, at falde meget hurtigt til 0 (approximationen er en parabel,

der skærer q-aksen) i strid med, hvad man hyppigst ser ved spredningsmålinger, hvor der sker

et ret blødt henfald mod 0. Dette kan man (simpelt, men arbitrært) reparere på ved at sige, at

ligning 3.13 blot er de to første led i rækkeudviklingen for e−13q2 R2

G . Formfaktoren er herved

approximeret med en Gauss-funktion:

P (q) ≈ e−13q2 R2

G (3.15)

Dette kaldes for Guinier approximationen, og den antages normalt at være gyldig i q-området

hvor q Rg < 1. Hvor god approximationen faktisk er, afhænger af partiklernes form.

Guinier approximationen anvendes til at størrelsesbestemme partikler: Man måler den spredte

intensitet ved mange q-værdier (mange spredningsvinkler) og antager så, at

Is(q) = Is(0) · e−13q2 R2

G (3.16)

Heraf fås, at

ln Is(q) = ln Is(0)−1

3q2 R2

G (3.17)

så hvis ln Is(q) plottes mod q2 fås en ret linie med hældningskoefficient −13R2

G. Dette kaldes et

Guinier-plot. I praksis bestemmes hældningen ved lineær regression og, heraf fås RG. Man

skal så bagefter kontrollere om betingelsen q Rg < 1 er opfyldt for den fundne gyrationsradius

og samtlige de benyttede q-værdier. Hvis ikke, må nogle mindre q-værdier anvendes. Da der

i praksis er grænser for hvor små spredningsvinkler der kan måles ved, er der herved også en

øvre grænse for, hvor store partikler, man kan bestemme gyrationsradius for ved denne metode.

3.4. Molekylvægt og størrelse i blandinger 33

Ligeledes er der en grænse for, hvor små partikler man kan bestemme gyrationsradius for, idet

meget små partikler vil give en hældningskoefficient i Guinier-plottet, der er så lille, at den

lineære regression kun kan bestemme den med meget stor usikkerhed (eventuelt kan den blive

negativ ved regressionen). Grænsen ligger i praksis ved Rg ≈ λ/20, hvor λ er den benyttede

lasers bølgelængde.

3.4 Molekylvægt og størrelse i blandinger

Hvis man i opløsningen har flere forskellige subpopulationer af partikler (molekyler) med vægt-

koncentrationerne C1, C2, . . . , Cn,

molekylvægtene M1,M2, . . . ,Mn og gyrationsradierne R1G, R2G, . . . , RnG vil vi gå ud fra, at

den totale lysspredning fra opløsningen er summen af de enkelte subpopulationers lysspredning,

altså at

Rtotal(q) =n∑

i=1

Ri(q) = Kn∑

i=1

CiMiPi(q) (3.18)

3.4.1 Gennemsnitsbestemmelser

Hvis man måler lysspredningen af en sådan opløsning på samme måde som hvis det var en

opløsning af ens molekyler (dvs. måler ved flere spredningsvinkler og ved forskellige fortyn-

dinger af opløsningen), kan man bagefter underkaste data den samme analyse som hvis der var

tale om en opløsning af ens molekyler. Herved vil man selvfølgelig finde en værdi for molekyl-

vægten som er en gennemsnitsværdi for de molekylvægte, der er til stede i opløsningen. Hvis

en gyrationsradius kan bestemmes (ved et Guinier-plot) bliver denne selvfølgelig også en gen-

nensnitsværdi for de gyrationsradier molekylerne i opløsningen har. For at kunne forstå/bruge

de fundne gennemsnitsværdier er det vigtigt at vide, hvordan de enkelte molekylvægte og gyra-

tionsradier er vægtet i forhold til hinanden. Dette vi vi nu se på:

Hvis vi vil beregne en gennemsnitsmolekylvægt ⟨M⟩, må den tilhørende vægtkoncentration af

dette "gennemsntsmolekyle"være summen af vægtkoncentrationerne for de indgående stoffer.

Dvs. at den totale lysspredning også kan skrives:

Rtotal(q) = K

(n∑

i=1

Ci

)⟨M⟩⟨P (q)⟩ (3.19)

Hvis vi sætter de to udtryk for Rtotal i ligning 3.18 og 3.19 lig hinanden og sætter q = 0, hvorved


alle formfakorer antager værdien 1, så fås, ikke overraskende, at gennemsnitsmolekylvægten

kan beregnes som

⟨M⟩ =

n∑i=1

Ci Mi

n∑i=1

Ci

(3.20)

Dette kaldes den vægtmidlede middelmolekylvægt. På grund af lysspredningens q-afhængighed

er det stadig nødvendigt at måle ved mange vinkler for til slut at ekstrapolere til q = 0.

Tilsvarende kan vi beregne en gennemsnitsgyrationsradius for alle molekylerne i blandingen.

Hertil benytter vi Debye-approximationen 3.13 for formfaktoren og sætter ind i ligning 3.18.

Herved fås

Rtotal(q) =n∑

i=1

Ri(q) = Kn∑

i=1

CiMi(1−1

3R2

iGq2) (3.21)

Hvis spredningen igen antages a stamme fra nogle "gennemsnitsmolekyler"med gennemsnits-

molekylvægten ⟨M⟩ og gennemsnitsgyrationsradius (i anden potens) ⟨R2G⟩, så kan det totale

Rayleigh forhold også skrives:

Rtotal(q) = K

(n∑

i=1

Ci

)⟨M⟩(1− 1

3⟨R2

G⟩q2) (3.22)

Sammenholdes ligning 3.21 og 3.22 fås udtrykket for gennemsnitsgyrationsradius:

⟨R2G⟩ =

n∑i=1

CiMi R2iG

⟨M⟩n∑

i=1

Ci

(3.23)

dvs., at gennemsnitsgyrationsradius er givet ved at vægte de enkelte gyrationsradier efter de

pågældende partiklers bidrag til den totale lysspredning. Ved anvendelse af udtrykket for mid-

delmolekylvægten 3.20 kan ligning 3.23 omskrives til den mere almindeligt anvendte form:

⟨R2G⟩ =

n∑i=1

CiMi R2iG

n∑i=1

Ci Mi

(3.24)

Kvadratroden heraf kaldes for z-middelværdien af gyrationsradierne og betegnes ⟨RG⟩z.

3.4. Molekylvægt og størrelse i blandinger 35

3.4.2 Detaljerede bestemmelser

Hvis man ikke er tilfreds med at få gennemsnitsværdier som vist i ovenstående afsnit, kan man

undertiden ved en mere kompliceret datanalyse regne sig til molekylvægte og gyrationsradier

for de enelte molekyler i opløsningen. Man benytter hertil ligning 3.21 og foretager et ulineært

mindstekvadraters fit (se Appendix B). Uden at komme ind på detaljer her kan det nævnes

at man ved fittemetoden betragter koncentrationerne C1, C2, . . ., molekylvægtene M1,M2, . . .

og gyrationsradierne R1G, R2G, . . . som parametre, som fitteprogrammet søger at tilpasse, så

det efter ligning 3.21 beregnede totale Rayleighforhold ved alle vinkler passer bedst muligt

med det målte Rayleighforhold. Dette problem har imidlertid uendeligt mange løsninger fordi

molekylvægt og koncentration kun indgår via deres produkt (C1M1 , C2 M2 osv.): En given

værdi for f.eks. C1M1 kan jo opnås ved uendeligt mange kombinationer af værdier for C1 og

M1. Man er derfor nødt til at vide (antage) mere om opløsningen, f.eks. at der er en bestemt

sammenhæng mellem gyrationsradius og molekylvægt.

Der findes imidlertid en måde hvorpå disse problemer kan undgås, ved at ændre på den ekspe-

rimentelle teknik. Målingerne foregår i et væske-flow i en opstilling som vist i figur 3.2.

Buffer reservoir

HPLC pumpeSampleinjektion Kromatografisk

søjleLysspredningsmålerMåler MCP(q)

BrydningsindexmålerMåler C

Bufferstrøm

Blandedemolekylstørrelser

Adskiltemolekylstørrelser

Figur 3.2: HPLC-pumpen sørger for at der konstant løber en bestemt mængde væske (bu�er) gen-nem gel-søjlen. Prøven (f.eks. 100 µL) føres ind i væskestrømmen gennem en særlig ventil. Når prøvensmolekyler passerer gennem gel-søjlen sker der en forsinkelse af de så molekyler; jo mindre molekylerjo større forsinkelse. De forskellige størrelsesklasser af molekyler får dernæst målt deres Rayleighforhold(KCM) i en lysspredningsmåler og deres koncentration C i et refraktometer. Herefter kan molekylvægtenbestemmes ved forholdet mellem de to målte størrelser.


Princippet er, at man foretager lysspredningsmålingerne på en væskestrøm, der indeholder ens

opløsning. Opløsningen presses vha. en væskestrøm igennem en gel-søjle, der størrelsesad-

skiller molekylerne i blandingen. Materialet i gel-søjlen tillader store molekyler at løbe hur-

tigt igennem, medens små molekyler løber langsomt igennem. Væskestrømmen, der forlader

gelsøjlen indeholder derfor først store moleyler og sidenhen mindre og mindre molekyler ef-

terhånden som tiden går. Væskestrømmen ledes derefter gennem lysspredningsmåleren, der

måler lysspredningen ved mange vinkler på én gang. Lysspredningen i en bestemt vinkel er

jo beskrevet ved Rayleighforholdet R(q) = KCMP (q) ved den givne vinkel, hvor K er den

optiske kontrastkonstant, C er vægtkoncentrationen og M er molekylvægten som netop denne

molekylklasse har, og P (q) er den tilhørende formfaktors værdi ved spredningsvektorværdien

q. Da lysspredningen måles i mange vinkler, kan der foretages en ekstrapolation til q = 0,

hvorved R(0) = KCM kendes. Væske/molekylstrømmen ledes videre gennem et differential-

refraktometer, der måler opløsningens brydningsindexforskel n − n0 i forhold til rent opløs-

ningsmiddel. Denne forskel kan skrives

n− n0 =dn

dC· C (3.25)

idet højere ordens led kan negligeres ved lave koncentrationer. Da størrelsen dndC

i princippet

kan bestemmes ved særskilte målinger (eller findes i en tabel) er måling af brydningsindex en

måde at bestemme molekylernes koncentration på. Da lysspredningsmåleren måler MC og da

refraktometeret måler C, kan molekylvægten bestemmes ved forholdet mellem signalet fra de

to instrumenter.

Princippet i målemetoden gennemgås i detaljer i kapitel 5

Da lysspredningsmåleren jo måler ved mange vinkler samtidig, fås samtidig formfaktoren for

de eneklte størrelsesklasser. Det er herefter simpelt at beregne gyrationsradius af de enkelte

størrelsesklasser, hvis de q-værdier instrumentet kan måle ved ellers tillader det:

1. Hvis molekylerne/partiklerne er meget små, er instrumentets q-værdier ikke store nok til

at formfaktoren afviger måleligt fra 1, selv ved den største q-værdi. I dette tilfælde kan

der kun sættes en øvre grænse for gyrationsradius.

2. Hvis partiklerne er meget store er selv de mindste af instrumentets q-værdier ikke små

nok til at kravet q ·RG < 1 kan opfyldes.

3.5. Resumé 37

3.5 Resumé

Her følger de vigtigste formler fra kapitlet:

Formfaktoren:

P (q) =Is(q)

Is(q = 0)

Tilsyneladende molekylvægt:

Mapp = MP (q)

Gyrationsradius:

R2g =

1

2N2

N∑j=1

N∑k=1

r2jk

Debye approximationen:

P (q) ≈ 1− 1

3q2R2

g for Rg · q ≤ 1

Guinier approximationen:

P (q) ≈ e−13q2R2

g for Rg · q ≤ 1

Generelle formel for statisk lysspredning:

KC

R(q)=

1

MP (q)+ 2A2C + 3A3C

2 + · · ·


Eksempler på gyrationsradier, der kan beregnes

analytisk:

Massiv kugle med radius r:

Rg =

√3

5r

Ellipsoide med halvakser a, b og c:

Rg =

√a2 + b2 + c2

5

Kugleskal (uendeligt tynd) med radius r:

Rg = r

Cylinder med radius r og længde L:

Rg =

√r2

2+

L2

12

Kasse med kantlængder a, b og c :

Rg =

√a2 + b2 + c2

12

Bemærk, at den sidste formel også angiver gyrationsradius for enuendeligt tynd rektangulær plade (c = 0) og for en uendeligt tyndstang (b = 0 og c = 0)

3.5. Resumé 39

Specialtilfælde:

Statisk lysspredning for meget tynde opløsninger:

KC

R(q)=

1

MP (q)

Statisk lysspredning for meget små partikler:

KC

R(q)=

1

M+ 2A2C + 3A3C

2 + · · ·

Statisk lysspredning formeget tynde opløsninger og meget

små partikler:KC

R(q)=

1

M

4Simpel teori for dynamisk lysspredning

Dynamisk lysspredning er en ret ny teknik (i princippet opfundet i 1964), der fra midten af

70’erne har vundet stigende udbredelse. Årsagen til den sene fremkomst af teknikken er, at den

på flere måder er teknologisk langt mere krævende end statisk lysspredning; dels skal lyskil-

den være både ekstremt monokromatisk og ekstremt intens, dels skal kilden være kohærent,

så strålen kan fokuseres meget snævert (dvs. der skal anvendes en laser). Endvidere skal de-

tektorsystemet være hurtigt og meget støjsvagt og signalbehandlingen kræver en veludviklet

computerteknologi.

Hensigten med måling af dynamisk lysspredning er normalt at få oplysning om diffusionsko-

efficienten af molekyler i opløsning, men kan også være at få oplysninger om karakteristiske

relaxationstider i f.eks. en gel. Vi vil her gå ud fra at formålet er studiet af diffusionsprocesser.

Gennem måling af diffusionskoefficienten for en opløsning af molekyler kan man foretage en

indirekte størrelsesbestemmelse af molekylerne, idet man kan beregne deres såkaldte hydrody-

namiske radius. Denne måde at foretage størrelsesbestemmelse på, er baseret på Stokes-Einstein

relationen, der angiver diffusionskoefficienten, D, for en opløsning af kugleformede partikler

med radius r i en væske med viskositeten η og den absolutte temperatur T :

D =kBT

6πηr(4.1)

41

42 Kapitel 4. Simpel teori for dynamisk lysspredning

hvor kB = 1.38 · 10−23 J · K−1 er Boltzmanns konstant. Hvis man således for en opløsning

af kugleformede partikler måler deres diffusionskoefficient, kan deres radius beregnes ud fra

ligning 4.1. Hvis man har en opløsning af ens partikler, definerer man generelt den hydrodyna-

miske radius, rh, for disse partikler ved udtrykket

rh =kBT

6πηD(4.2)

hvor D er den målte diffusionskoefficient for partiklerne. For kugler er der eksakt overens-

stemmelse mellem den hydrodynamiske og den geometriske radius, medens der for objekter

med andre former (cylinder, ellipsoide, . . . ) gælder, at den hydrodynamiske radius nogenlunde

svarer til radius af kugler, der har samme rumfang som de partikler, hvis diffusionskoefficient

er blevet målt. Dette gælder så længe partiklerne ikke er meget lange eller meget flade. Som

en tommelfingerregel kan benyttes, at for hver gang aksialforholdet vokser med 1, vokser den

hydrodynamiske radius med 5 – 7 % i forhold til kuglen med samme rumfang .

Diffusionskoefficienten er – ligesom Rayleighforholdet – bestemt termodynamisk ud fra det os-

motiske tryk Π. Ligning 4.1 er et specialtilfælde af den generaliserede Stokes-Einstein ligning:

D =M

NAf(1− ϕ)2

(∂Π

∂C

)T,P

(4.3)

hvor ϕ er volumen fraktionen af de opløste molekyler og f er den såkaldte friktionsfaktor, der

for ikke vekselvirkende kugler med en overflade der klæber til opløsningsmidlet gælder at f =

6πηr. I modsætning til tilfældet med bestemmelse af molekylvægten, er det i dette tilfælde er det

ikke nok at foretage virial-rækkeudviklingen af det osmotiske tryk, idet også friktionsfaktoren f

afhænger af koncentrationen (og i almindelighed af vekselvirkningskræfter mellem partiklerne

og mellem partiklerne og opløsningsmidlet). En teoretisk udredning af koncentrationseffekters

indflydelse på diffusionskoefficienter er derfor ekstremt vanskelig. Man kan naturligvis rent

fænomenologisk skrive:

D = D0(1 + kDC + · · ·) (4.4)

hvor kD er en virialkoefficient for diffusionskoefficienten. Teoretisk beregning af denne virial-

koefficient er meget vanskelig og ikke generelt mulig. Til gengæld antyder ligning 4.4, at man

for at bestemme et stof difusionskoefficient må foretage måling heraf ved et antal koncentratio-

ner, så man kan ekstrapolere til en koncentration på 0.

Hvordan diffusionskoefficienter kan måles gennemgås i det følgende.

4.1. Intensitets�uktuationer 43

4.1 Intensitetsfluktuationer

Når man foretager måling af dynamisk lysspredning anvendes en lidt anderledes opstilling end

ved statisk lysspredning (se figur 4.1). Laserstrålen fokuseres ned til en diameter på ca 120

mm,

Laser

PMT

PAD

Fokusserende linse

Afbildnings-linse

Pinhuller

Autokorrelator

PC

Målekammer

Prøvei kuvette

θ

Figur 4.1: Opstilling til måling af dynamisk lysspredning. Detektoren er et fotomultiplikatorrør (PMT),der kan tælle enkeltfotoner. Detektionen foregår gennem et system af blændehuller, hvor det mindstesidder nærmest PMT'en og har en diameter på normalt 100 � 200 µm. Endvidere er målekuvettenomgivet af vand, der er termostateret, da den målte di�usionskoe�cient afhænger af temperaturen.

og de spredte fotoner registreres af et hurtigt fotomultiplikatorrør, der kan registrere enkeltfoto-

ner. De enkelte fotoner giver anledning til små strømstød på udgangen af fotomultiplikatorrøret

og disse sendes videre til en PAD (Pulse Amplifier and Discriminator), hvor de forstærkes, sor-

teres (så kun stød over en vis tærskelværdi slippes videre) og omformes til standard pulser på

5 V høje og 30 ns længde inden de sendes videre til den digitale autokorrelator.

Som nævnt i afsnit 2.5 kan den spredte intensitet fra N partikler skrives (ligning 2.33):

Is, total(t) = Is, nN∑j=1

N∑k=1

cos(ϕj(t)− ϕk(t))

Her er intensitetens tidsafhængighed markeret eksplicit. At intensiteten afhænger af tiden skyl-

des, at partiklerne bevæger sig ved diffusion (Brown’ske bevægelser), hvorved faserne ϕj(t) og

ϕk(t) og dermed faseforskellene ændrer sig på tilfældig måde. Hvis f.eks. partiklerne diffunde-

rer langsomt (dvs. hvis de er store og/ eller hvis væsken, de diffunderer i, har høj viskositet),


vil ϕj(t) − ϕk(t) ændre sig langsomt og Is, total(t) bliver en langsomt fluktuerende funktion af

tiden. Fluktuationernes hastighed bliver således et mål for partiklernes diffusionshastighed eller

deres diffusionskoefficient, D.

4.2 Autokorrelationsfunktionen

Selvom det er intuitivt klart, at hurtigt fluktuerende intensitet svarer til stor diffusionskoefficient

(dvs. små partikler) og langsomt fluktuerende intensitet til lille diffusionskoefficient, er det ikke

umiddelbart indlysende, hvordan man udleder kvantitativ information af disse fluktuationer.

Det viser sig, at redskabet hertil er den såkaldte autokorrelationsfunktion G2(t), der (som det

vil fremgå) lader sig bestemme løbende som målingen af den spredte lysintensitet skrider frem.

Autokorrelationsfunktionen af den spredte lysintensitet er defineret ved ligningen

G2(τ) = limT→∞

1

T

∫ T

0Is, total(t) · Is, total(t+ τ) dt (4.5)

dvs. at der i integralet indgår intensiteter, der er registreret med en tidsforskel på τ . I praksis må

intensiteten måles til diskrete tidspunkter, og det er derfor mest praktisk (og nøjagtigt) i stedet

for intensiteten at tælle hvor mange fotoner detektoren registrerer i løbet af en fast tid, ∆t kaldet

sampletiden. I stedet for den kontinuerte størrelse Is, total(t) måles altså en følge af fotontælletal,

n(0 ·∆t), n(1 ·∆t), n(2 ·∆t), n(3 ·∆t), . . ., der alle er talt op i løbet af tiden ∆t. Sampletiden

∆t er typisk af størrelsesorden 1 – 10 µs, men er en størrelse ekperimentatoren bestemmer over

(på ældre autokorrelatorer dvs. fra før 1985 er der simpelthen en omskifterknap, der kan variere

∆t fra f.eks. 0.1 µs til 50 ms). Til brug for denne diskrete måling af intensiteten definerer man

så autokorrelationsfunktionen til de diskrete tidspunkter τ = 0·∆t, τ = 1·∆t, τ = 2·∆t, τ =

3 ·∆t, τ = 4 ·∆t, . . . således:

G2(0 ·∆t) =1

N

N∑j=1

n(j ·∆t) · n([j + 0] ·∆t)

G2(1 ·∆t) =1

N

N∑j=1

n(j ·∆t) · n([j + 1] ·∆t)

G2(2 ·∆t) =1

N

N∑j=1

n(j ·∆t) · n([j + 2] ·∆t)

...

4.2. Autokorrelationsfunktionen 45

G2(k ·∆t) =1

N

N∑j=1

n(j ·∆t) · n([j + k] ·∆t) (4.6)

...

eller sagt på en anden måde:

G2(k ·∆t) = ⟨n(t) · n(t+ k ·∆t)⟩t (4.7)

Tiden k · ∆t kaldes for korrelationstiden og er altså et multiplum af sampletiden ∆t. I prak-

sis har k den maximale værdi 128 eller 256 og værdierne G2(k · ∆t) gemmes i ligeså mange

hukommelses-registre, kaldet kanaler. For hver gang tiden ∆t er gået tilføjes endnu et led i samt-

lige 256 summer og da de tilføjede led er produkter af formen n(j ·∆t) · n([j + 2] ·∆t), skal

der altså udføres 256 additioner samt 256 multiplikationer1 i løbet af tiden ∆t. Hvis ∆t = 1 µs

kræver dette en regnehastighed på 256 millioner multiplikationer + 256 millioner additioner pr.

sekund. Dette kan ingen enkeltprocessor-computer endnu (2005) klare, så til bestemmelse af

auokorrelationsfunktionen benyttes speciel hardware, en såkaldt autokorrelator, der består af

f.eks. 256 parallelt arbejdende, meget primitive computere.

Det kan her bemærkes, at autokorrelationsfunktionen er en statistisk bestemt størrelse, hvis

præcision (eller statistiske kvalitet) afhænger af størrelsen af summerne i ligning 4.6. De enkelte

led, der jo er produkter af fotontælletal i en fast tid, ∆t, vil være kvadratisk afhængige af såvel

laserintensiteten som af opløsningens lysspredningsevne, der i sig selv er proportional med

C · M . Med andre ord, sænkes laserens effekt med en faktor 5, eller sænkes opløsningens

middelmolekylvægt eller vægtkoncentration med en faktor 5, så skal måletiden (N ·∆t) forøges

med en faktor 25 for at bibeholde samme kvalitet af autokorrelationsfunktionen. Derfor er det af

afgørende betydning, at lyskilden har høj intensitet (dvs. er en laser). Typiske laserintensiteter

er i praksis ca. 100 mW, hvor lasere, der anvendes i skoleundervisningen maximalt må være på

1 mW.

Da fluktuationerne i hvor mange fotoner,n(t), der registreres i løbet at tiden ∆t skyldes, at de

spredende partikler ændrer indbyrdes position p.g.a. Brown’ske bevægelser, er det klart at n(t+

k ·∆t) med stor sandsynlighed er det samme som n(t), hvis korrelationstiden k ·∆t er meget1Alternativt skal hele sekvensen n(0 ·∆t), n(1 ·∆t), . . . , n(N ·∆t) gemmes, hvorefter summerne i 4.6

beregnes. Hvis n(1 · ∆t) gemmes med en præcision på 4 bit, kan der i 16 MB RAM gemmes i alt ca.32 · 106 tælletal svarende til 32 sekunders dataopsamling, hvis ∆t = 1 µs. Men normalt skal der måles ivæsentligt længere tid for at opnå tilstrækkelig god statistik, så måleserierne må gentages.


kort tid, medens der ingen sammenhæng er mellem n(t+k ·∆t) og n(t) hvis k ·∆t er meget lang

tid. Derfor gælder, at G2(k ·∆t) → ⟨n(t)⟩2t for k → ∞ Autokorrelationsfunktionen får derfor

et udseende som vist i figur 4.2 Henfaldet ligner et eksponentielt henfald mod en asymptote

n

n

2

2

<<

< <

Figur 4.2: Autokorrelationsfunktionen for den spredte lysintensitet for en opløsning af partikler, derundergår Brown'ske bevægelser falder altid fra ⟨n2⟩ for k∆t = 0 til ⟨n⟩2 for meget lange korrelationstider

værdi men er normalt af mere kompliceret karakter. Den simple undtagelse har man, hvis alle

partiklerne i opløsningen har samme diffusionskoefficient, D. Man kan argumentere kvalitativt

for udseendet af autokorrelationsfunktionen ved at betragte figur 4.3 Lad os betragte diffusion i

én dimension. Den kvadrerede middeldiffusionsvej partiklerne flytter sig fra udgangspositionen

i løbet af tiden t, er som bekendt givet ved

⟨x2⟩ = 2Dt (4.8)

En såkaldt karakteristisk længde i forbindelse med lysspredning er 1/q, hvor q er længden

af spredningsvektoren: Ifølge ligning 2.14 vil lys, der spredes fra en partikel, der fjerner sig

strækningen π/q fra en anden partikel interferere destruktivt med lyset spredt fra den første

patikel. Heraf kan ved hjælp af ligning 4.8 udledes en karakteristisk tid, τ0 for diffusionen:(1

q

)2

= 2Dτ0 (4.9)

hvormed τ0 = 1/(2Dq2). Man kunne så gætte på, at autokorrelationsfunktionen i dette simple

4.2. Autokorrelationsfunktionen 47

Detektor

Figur 4.3: Lyset, der når den lille detektor-indgang udviser intensitetsvariationer, der skyldes at interfe-rensmaxima "skanner"hen over detektoren når partiklerne �ytter sig. For at få store udsving i intensitetpå detektoren skal indgangshullet være så lille, at der i gennemsnit kun er ét maksimum på detektorenad gangen.

tilfælde var et eksponentielt henfald med denne karakteristiske henfaldstid:

G2(τ) = Ae−τ/τ0 +B

= Ae−2Dq2t +B (4.10)

Dette resultat viser sig at være korrekt, men vil ikke her blive givet en stringent udledning2 her.

I det mere generelle tilfælde, hvor der er n forskellige partikeltyper til stede i opløsningen med

hver deres diffusionskoefficient, D1, D2, D3, . . . , Dn, generaliseres udtrykket 4.10 til:

G2(τ) = (A1e−D1q2τ + A2e

−D2q2τ + . . .+ Ane−D1q2τ )2 +B (4.11)

hvor amplitudefaktorerne A1, A2, . . . , An er relateret til hver enkelt species lysspredningsbi-

drag gennem relationen Aj ∝ Pj(q)CjMj , hvor Pj er formfaktoren for den j’te specie, Cj er

vægtkoncentrationen og Mj er molekylvægten.

Som regel normaliserer man den målte autokorrelationsfunktion, G2, så den får den asymptoti-

ske værdi 1 og kalder resultatet for g2 (eller i nogle bøger, g(2)):

g2(τ) = G2(t)/G2(∞) (4.12)

2Man kan se, hvordan en stringent udledning foretages ved at se kapitel 10 i Dynamic Light Scattering,R. Pecora, Ed., Plenum Press 1985 og samtidig læse kapitel 10 i Biophysical Chemistry, C. Cantor & P.Schimmel, Freeman and Company 1980


og med ovenstående udtryk for amplituderne kan denne således skrives

g2(τ) = Kc(a1e−D1q2τ + a2e

−D2q2τ + . . .+ ane−D1q2τ )2 + 1 (4.13)

hvor a1, a2, . . . , an betegner brøkerne P1(q)C1M1/∑

Pi(q)CiMi, P2(q)C2/∑

Pi(q)CiMi, . . . ,

Pn(q)Cn/∑

Pi(q)CiMi og Kc betegner den rumlige kohærensfaktor. Dette er et tal, der er min-

dre end 1 og som afhænger af detektorgeometrien (altså en apparatkonstant). Det er på denne

såkaldte intensitets-autokorrelationsfunktion man foretager sin data-analyse.

4.3 Data-analyse

At analysere autokorrelationsdata er et næsten uudtømmeligt emne, som det vil fremgå af det

følgende. Problemet er: Givet en målt autokorrelationsfunktion g2(t), hvordan kan denne skrives

på formen 4.13? Eller lidt mere generelt, hvis man erstatter summen i ligning 4.13 med et

integral:

g2(τ) =(∫ ∞

0A(D)e−Dq2τdD

)2

+ 1 (4.14)

hvor A(D) er fordelingen af diffusionskoefficienter, der "frembragte"den målte autokorrela-

tionsfunktion. Hvordan finder man fordelingen A(D)?

Man kan gøre simplificerende antagelser, i et (u)begrundet håb om at det virker, eller ud fra

en faktisk viden om det system, man har målt på. Den simpleste antagelse er, at systemet kun

består af én slags partikler:

4.3.1 Monodisperse opløsninger

Hvis den opløsning, man har optaget et autokorrelationsspektrum for, er monodispers, dvs. kun

indeholder partikler med én diffusionskoefficient, vil den normaliserede autokorrelationsfunk-

tion, g2, ifølge ligning 4.10 og 4.12 kunne omskrives til

g2(τ) = Kc · e−2Dq2τ + 1 (4.15)

hvor Kc er den føromtalte kohærensfaktor. Ligning 4.15 kan logaritmiseres:

ln(g2(τ)− 1) = lnKc − 2Dq2τ (4.16)

4.3. Data-analyse 49

så, hvis ln(g2(τ) − 1) plottes mod q2τ fås en ret linie med hældningskoefficient −2D (som i

praksis bestemmes ved lineær regression). Hvis man til gengæld ikke får en ret linie ved det

omtalte plot, er der mere end én diffusionskoefficient til stede i opløsningen:

4.3.2 Polydisperse opløsninger

Normalt er der partikler med flere forskellige diffusionskoefficienter til stede i ens opløsning.

Sådanne opløsninger kaldes polydisperse. Igen kan man gøre simplificerende antagelser, som

f.eks. at diffusionskoefficienterne er normalfordelt, at de er fordelt efter en anden fordelings-

funktion (som er beskrevet ved et lille antal parametre) som tillader, at man beregner korrela-

tionsfunktionen g2 analytisk ud fra fordelingsfunktionens parametre, eller at der er et endeligt

antal (f.eks. maximalt 4) diffusionskoefficienter til stede. I alle disse tilfælde kan man benytte

regressionsmetoder til at fitte den modelberegnede g2, model(t) til den målte autokorrelations-

funktion. Detaljerne i fitteproceduren afhænger bl.a. af, hvilke antagelser, man har gjort om sin

diffusionskoefficient-fordelingsfunktion, A(D), se mere herom i Appendix B.

Cumulant analyse

Hvis diffusionskoefficienterne er normalfordelt, kan fordelingsfunktionen A i ligning 4.14 skri-

ves

A(D) = A0e− (D−D0)

2

2σ2 (4.17)

hvor A0 er en konstant, så∫∞0 A(D)dD = 1, D0 er middeldiffusions- koeffficienten og σ er

fordelingens spredning. Herved får ligning 4.14 formen

g2(τ) =(∫ ∞

0A0e

− (D−D0)2

2σ2 e−Dq2τdD)2

+ 1 (4.18)

som efter et par integralsubstitutioner bliver til

g2(τ) =

(e−D0q2τ+σ2q4τ2/2A0

√2σ∫ ∞

−D0/√2σ+σq2τ/

√2e−x2

dx

)2

+ 1 (4.19)

Hvis t er så lille,at D0/√2σ ≫ σq2τ/

√2, er integralet tilnærmelsesvis konstant, og

g2(τ) ≈ C · e−2D0q2τ+σ2q4τ2 + 1 (4.20)


hvor C er en konstant. Man ser, at ln(g2(τ)−1) plottet mod den variable q2τ fremstiller en para-

bel, hvor koefficienten til 1.-gradsleddet er 2D og koefficienten til 2.-gradsleddet giver fordelin-

gens varians, σ2. Et parabelfit til ln(g2(τ)−1) giver således såvel middel-diffusionskoefficienten

som variansen. Størrelsen σ/D0 betegnes som regel polydispersiteten. Ved at sammenligne lig-

ning 4.20 med ligning 4.15 ses, at hvis polydispersiteten (dvs. σ) er nul fås det allerede udledte

udtryk for monodisperse opløsninger.

Metoden skal anvendes med varsomhed, da den forudsætter at der ikke er flere klart adskilte

størrelsesklasser til stede i opløsningen. Selv hvis dette ikke er tilfældet, er der et problem i

at bestemme hvor stor end del af autokorrelationsfunktionen, der skal tages hensyn til i fittet,

da man både skal have opfyldt,at D0/√2σ ≫ σq2t/

√2, og at man har tilstrækkeligt mange

punkter til at foretage et meningsfuldt fit. Bestemmelse af parametrene ved et 2.-gradsfit kaldes

2.-ordens cumulantanalyse. Hvis man tilsvarende fitter med et trediegradspolynomium, tales

der om 3.-ordens cumulantanalyse. Normalt går man ikke til højere polynomiumsorden end 3,

da de ekstra parametre dels bliver meget dårligt bestemt (dvs. varierer meget ved analyse af data

opnået ved gentagelsesmålinger), dels påvirker værdien af parametrene D0 og σ, som derved

også bliver dårligt bestemt. Man skal iøvrigt være opmærksom på, at når man foretager et fit til

ln(g2(t)− 1), så vægtes de enkelte datapunkter anderledes end vis man benytter en fittemetode,

hvor der fittes direkte til g2(t). Dette indebærer, at der kan være forskel på D0 og σ bestemt

ved cumulantanalyse og de samme parametre bestemt ved et ulineært fit til data med funktionen

4.20.

Man kan fundere over, hvad der egentlig ligger i antagelsen om, at diffusionskoefficienterne er

normalfordelt som antaget i ligning 4.17, og på hvilken måde de forskellige speciers molekyl-

vægte egentlig er blevet vægtet når cumulantanalysen giver en middeldiffusionskoefficient, D0.

For at se nærmere på dette kan man antage, at korrelationsfunktionen 4.13 for korte korrelation-

stider kan skrives som

g2(τ) ≈ Kc(e−D0q2τ )2 + 1 (4.21)

altså at ln(g2(τ)− 1) plottet mod q2τ , fremstiller en ret linie for tilstrækkeligt små værdier af τ .

Hvis man dernæst rækkeudvikler såvel ligning 4.21 som ligning 4.13 til første orden og sætter

de to fremkomne udtryk lig med hinanden, fås

n∑i=1

ai(1−Diq2τ) = 1−D0q

2τ (4.22)


hvoraf man får, at

D0 =n∑

i=1

aiDi (4.23)

eller, mere udførligt

D0 =

n∑i=1

Pi(q)CiMiDi

n∑i=1

Pi(q)CiMi

(4.24)

hvad der i analogi med udtrykket 3.24 for gyrationsradius betegnes z-middelværdien af de

indgående diffusionskoefficienter, og man skriver

D0 = ⟨D⟩z (4.25)

Invers Laplace transformation

At bestemme fordelingen af diffusionkoefficienter er i virkeligheden at foretage en invers La-

place transformation. At Laplacetransformere en funktion f(Γ) går ud på at beregne funktionen

g1(t) (den Laplace transformerede af f ) ved

g1(τ) =∫ ∞

0f(Γ)e−ΓtdΓ (4.26)

Man bemærker, at Γ har dimension af invers tid. Hvis man ud fra den målte autokorrelations-

funktion g2(t) definerer funktionen g1(t) =√g2(t)− 1, laver variabelsubstitutionen Dq2 = Γ

og definerer fordelingsfunktionen B(Γ) = 1q2A(D/q2), så ses at ligning 4.14 er ensbetydende

med

g1(τ) =∫ ∞

0B(Γ)e−ΓtdΓ (4.27)

Idet g1(τ) er eksperimentelt bestemt, skal man altså blot foretage en invers Laplace transfor-

mation af g1 for at finde fordelingsfunktionen B(Γ) og dermed fordelingsfunktionen A(D)

for diffusionskoefficienterne. Selvom der findes computeralgoritmer, der kan foretage den in-

verse Laplace transformation, viser det sig, at støj eller usikkerhed i den eksperimentelt be-

stemte funktion g1 gør, at resultatet af en invers Laplace transformation er mildt sagt man-

getydigt: Den fundne fordelingsfunktion kan afvige vilkårligt meget fra den "sande"fordeling.

Man siger at inversionsproblemet er "ill conditioned". Årsagen er nemmest at se gennem et

eksempel: Hvis man til en funden fordelingsfunktion B(Γ) lægger det ikke-negative bidrag


B0e−Γτ1(1 + sin(Γτ2)), hvor τ1 og τ2 er faste tider, fås at den Laplace transformerede heraf

bliver (slå op i en integraltabel)

g1(τ) +∫ ∞

0B0e

−Γτ1(1 + sin(Γτ2)) dΓ = g1(τ) +B0

(1

τ1+

τ2(t2 + τ1)2 + τ 22

)(4.28)

Da B0(1τ1+ τ2

(t2+τ1)2+τ22) ≤ B0(

1tau1

+ τ2τ21+τ22

) fremgår heraf, at det ekstra bidrag til g1 kan være

vilkårligt lille, selvom amplituden B0 er vilkårligt stor, hvis bare τ1 og τ2 er store nok.

ILT

Data-analysemetoden ILT (Inverse Laplace Transformation, Ostrowsky m.fl. (1981) ) er beteg-

nelsen for en bestemt måde at reducere graden af mangetydighed på, når autokorrelationsfunk-

tioner invers Laplace transformeres. Man fitter den eksperimentelt bestemte funktion g1(t) med

et udtryk af formen

f(τ) = a1e−Γ1τ + a2e

−Γ2τ + . . .+ aNe−ΓN τ (4.29)

hvor relaxationskonstanterne Γi er fordelt eksponentielt : Γi = φΓi−1. Det, man bestemmer ved

fitningen i ligning 4.29 er udelukkende konstanterne a1, a2, . . . , aN , medens "finheden af det

eksponentielle net", φ, er bestemt på forhånd ud fra støjen i den målte autokorrelationsfunktion.

CONTIN

En anden måde, at begrænse antallet af mulige fordelingsfunktioner B(Γ) på, er, at stille yder-

ligere krav til den fundne løsning. Metoden CONTIN ( Provencher 1982) benytter regularise-

ring, dvs. i stedet for at finde en løsning, hvor χ2 er minimaliseret søges en funktion B(Γ), hvor

χ2+α2∫∞0 (B′′(Γ))2 dΓ er minimaliseret. Vægtningskonstanten α kaldes for regularisatoren og

bestemmer hvor stor vægt, der skal lægges på selve fittets godhed (χ2) i forhold til løsningens

"detaljerigdom"3 målt ved∫∞0 (B′′(Γ))2 dΓ Det problem, som CONTIN løser, er at finde en

fornuftig værdi for α. Beregningsmæssigt er CONTIN en hel del tungere end ILT og forskellen

på løsninger fundet ved de to metoder er, at CONTIN altid giver færre og/eller bredere toppe i

B(Γ), dvs. at CONTIN udtaler sig vagere end ILT om fordelingen af diffusionskoefficienter.

3Jo �ere detaljer i B(Γ), jo hyppigere og kraftigere krummer grafen for B(Γ), og et mål for grafenskrumning (med fortegn) er netop B′′.


Andre metoder

Der er indenfor de sidste 20 år udviklet et antal metoder til at analysere autokorrelationsdata.

Cumulantanalyse er en af de ældste, men er stadig vidt udbredt selvom metoden har oplagte

svagheder (især med moderne korrelatorer, der arbejder med korrelationstider, der vokser eks-

ponetielt og ikke lineært, som antaget i afsnit 4.2. De nyere metoder er ofte beslægtede med

CONTIN eller med ILT, og omfatter regulariseringsmetoder som REPES og RNONLIN, der

begge analyserer g2 direkte (uden at beregne g1 først). Også MEM (maximum entropi metoden)

forsøges sommetider anvendt, men er endnu ikke ret udbredt. Princippet er at tildele enhver af

de mulige løsninger en entropi (sandsynlighed) og dernæst at vælge den mest sandsynlige af

dem.

Ofte er det nyttigt, at analysere sine data som en kvadreret eksponentialsum som angivet i

ligning 4.13, hvor man foretager et ulineært mindste kvadraters fit til parametrene a1, a2, . . .

og D1, D2, . . ., men begrænser antallet af led til f. eks. 3. Dette tillader at finde 3 skarpt

adskilte størrelsesklasser, men hvis dette fungerer dårligt, fordi de enkelte størrelsesklasser ikke

er "skarpe", men udviser polydispersitet, kan der tages højde for dette ved i stedet at fitte med

funktioner af typen

g2(τ) = Kc(a1e−(D1q2τ)β1 + a2e

−(D2q2τ)β2 + . . .+ ane−(D1q2τ)βn )2 + 1 (4.30)

hvor β1, β2, . . . , βn alle er tal der ligger mellem 0 og 1. Hvis samtlige β-eksponenter er lig

1, er det samme funktionsklasse som før, men jo nærmere βi er ved 0 jo bredere er fordelin-

gen hørende til dette led. De enkelte led i summen her er af formen e−xβ . Disse funktioner

betegnes i litteraturen som "stretched exponentials"og finder især anvendelse ved beskrivelse

af autokorrelationsfunktioner for gel-agtige substanser, dvs. for systemer, hvor fluktuationerne

ikke nødvendigvis stammer fra fri diffusion, men måske ligeså meget fra forskellige tilfældige

men koblede bevægelser i gelen.

5Lysspredning i praksis

Vi skal her se på nogle af de måder hvorpå lysspredningsmålinger foretages i praksis.

5.1 Apparatur

Det blev i afsnit 3.4.2 lovet at der skulle komme en grundigere gennemgang af hvordan detal-

jerede målinger af molekylvægte foretages. Princippet er, som tidligere nævnt, at man sørger

for at adskille molekylerne i den opløsning man har, så det bliver muligt at foretage mole-

kylvægtsbestemmelse på (del)opløsninger, der kun indeholder én slags molekyler. Dette gøres

ved at pumpe opløsningen igennem en kromatografisk gelsøjle, der lader store molekyler kom-

me hurtigt igennem, medens mindre molekyler er længere tid om passagen. Denne øjensynligt

"bagvendte"opførsel skyldes, at gelsøjlen er porøs, svampet, på mange størrelsesskalaer. De

store molekyler finder en forholdsvis kort vej gennem et netværk af forbundne store hulrum,

medens mindre molekyler under passagen hele tiden har mulighed for også at bevæge sig ind i

mindre hulrum, hvor væskestrømningshastigheden er mindre. Der sker således en sortering af

molekylerne efter deres størrelse snarere end efter deres molekylvægt.

For at se, hvordan denne adskillelse kan benyttes, kan vi ved at kombinere ligning 3.10 og 3.11,

55

56 Kapitel 5. Lysspredning i praksis

skrive

R = KCMapp. (5.1)

hvor vi har antaget, at koncentrationen er så lav, at vi kan se bort fra virialkoefficientleddene i

ligning 3.10. Gennem måling af Rayleighfoholdet R og koncentrationen C af de opløste mole-

kyler, kan den tilsyneladende molekylvægt beregnes:

Mapp. =R

KC(5.2)

hvor vi antager at den optiske kontrastkonstant K er kendt. I praksis bestemmer men normalt

ikke kontrastkonstanten, men mere herom nedenfor.

5.1.1 Koncentrationsmåling

Første trin i beregning i molekylvægten er måling af molekylernes koncentration. Dette gøres

bekvemt ved at måle opløsningens brydningsindex n, der jo afhænger af dels opløsningsmidlets

eget brydningsindex n0, dels af hvad og hvor meget, der er opløst i opløsningsmidlet. Til dette

formål benyttes en brydningsindexmåler, et såkaldt differentialrefraktometer, der kan måle en

væskes (opløsnings) brydningsindex. Apparatet indeholder en flowcelle, som man kan sende

den væske igennem, hvis brydningsindex man ønsker målt. Refraktometeret giver så (under

ideelle omstændigheder) en spænding fra sig, der er proportional med væskens brydningsindex.

Hvis man (i en buffer) fremstiller en række opløsninger med forskellig koncentration af et pro-

tein, f.eks. 0 g/l, 1.5 g/l, 2.0 g/l, 2.5 g/l, 3.0 g/l og 3.5 g/l, og sender disse gennem et sådant

refraktometer får man et output fra instrumentet, der kan se ud som vist på figur 5.1. Hvis man

dernæst i et koordinatsystem indtegner det målte brydningsindex som funktion af det opløste

proteins vægtkoncentration, kommer det til at se ud som i figur 5.2

Det vil sige, at vi til første orden i det opløste stofs koncentration C kan skrive

n = n0 +dn

dC· C (5.3)

Det viser sig, at værdien af dndC

ligger på ca. 1.85 · 10−4 m3 · kg−1 for proteiner og ca. 1.45 ·10−4 m3 · kg−1 for (poly)sakkarider. Den præcise værdi afhænger også af bufferens brydnings-

index, men de anførte værdier vil i de allerfleste tilfælde være korrekte indenfor ca. ±5%.

Man kan få et groft estimat for et stofs dndC

-værdi ved at se på forskellen i brydningsindex mellem

bufferen og det opløste stof i ren form (dvs. uden buffer). Når det opløselige stof er til stede på

5.1. Apparatur 57

1.3399

1.3400

1.3401

1.3402

1.3403

1.3404

1.3405

1.3406

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

minutter

Bry

dn

ing

sin

dex

n

0 g/l

0.5 g/l

1.0 g/l

1.5 g/l

2.0 g/l

2.5 g/l

3.5

Figur 5.1: Brydningsindex for en opløsning afhænger af selve opløsningsmidlets brydningsindex n0,som i dette tilfælde er 1.3400, samt af vægtkoncentrationen C af opløst stof. Der pumpes opløsningermed stigende koncentration af proteinet igennem refraktometeret. Der pumpes den samme koncentrationigennem indtil brydningsindexet har stabiliseret sig på en konstant værdi, altså et plateau. Ud for hvertplateau er vist hvilken koncentration det svarer til.

1.3399

1.3400

1.3401

1.3402

1.3403

1.3404

1.3405

1.3406

1.3407

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

C (g/l)

Bry

dn

ing

sin

dex

n

Figur 5.2: Brydningsindex for en opløsning som funktion af det opløste stofs koncentration. Punkterneer fundet ved brug af data fra �gut 5.1. Ved ikke for høje koncentrationer er sammenhængen som det seslineær. Liniens hældningskoe�cient dn

dC er karakteristisk for kombinationen af opløsningsmiddel og detstof, som opløses.


ren form, er dets vægtkoncentration lig med dets massefylde. (Tænk på, at koncentrationene

betyder hvor mange kg stof, der er til stede i 1m3 "opløsning"). Dvs. at vi kan estimere

dn

dC≈ ∆n

∆C=

nrent stof − nbuffer

ρrent stof(5.4)

idet ∆C = Cmax−0 = ρrent stof . Typiske værdier for brydningsindex for såvel kompakt, vandfrit

protein som for sukkerstoffer er n ≈ 1.54 medens brydningsindex for de fleste buffere ligger

tæt på værdien for vand n = 1.33. En typisk værdi for massefylden af kompakt protein er

ρ ≈ 1.2 · 103 kg ·m−3 medens værdien for eksempelvis sucrose er ρ ≈ 1.5 · 103 kg ·m−3. Ved

brug af ligning 5.4 får vi så følgende estimater for det differentielle brydningsindexincrement:(dn

dC

)protein

≈ 1.54− 1.33

1.2 · 103 kg ·m−3= 1.75 · 10−4 m3 · kg−1 (5.5)(

dn

dC

)polysac

≈ 1.54− 1.33

1.5 · 103 kg ·m−3= 1.4 · 10−4m3 · kg−1 (5.6)

Begge estimater ligger i underkanten, men ligger dog mindre end 10% fra typiske målte værdier.

Når man for et givet stof kender værdien af dndC

(og brydningsindex for det rene opløsningsmid-

del, n0), kan man altså ved at måle opløsningens brydningsindex n ud fra ligning 5.3 bestemme

stoffets koncentration.

5.1.2 Inline måling af koncentration i forbindelse med SEC

Når man foretager kromatografisk størrelsesadskillelse af de opløste molekyler, som vist i fi-

gur 5.3, for at bestemme molekylvægten af de molekyler, der er til stede i de enkelte størrel-

sesklasser (fraktioner), injiceres en lille mængde opløsning i den strøm af buffer, der konstant

pumpes igennem gelsøjlen. Lad os for nemheds skyld antage, at den injicerede opløsning kun

indeholder én slags molekyler. Disse ens molekyler vil passere igennem gelsøjlen på nogenlun-

de samme tid, da de har samme størrelse. Da vejen gennem søjlen ikke er den samme for alle

molekylerne, tager det ikke helt samme tid for dem at komme igennem. Når disse molekyler

passerer gennem brydningsindexmåleren (figur 5.3) måles der forbigående et højere brydnings-

index. Hvis alle molekylerne var lige længe om at bevæge sig igennem søjlen, ville signalet

fra brydningsindexmåleren foretage et pludseligt spring op, holde sig konstant et øjeblik, indtil

molekylerne havde passeret, og dernæst ligeså pludseligt falde tilbage på den oprindelige værdi.

I stedet får man et signalforløb som vist i figur 5.4.

5.1. Apparatur 59

Buffer reservoir

HPLC pumpeSampleinjektion Kromatografisk

søjleLysspredningsmålerMåler MCP(q)

BrydningsindexmålerMåler C

Bufferstrøm

Blandedemolekylstørrelser

Adskiltemolekylstørrelser

Figur 5.3: HPLC-pumpen sørger for at der løber væske (bu�er) gennem gelsøjlen med et bestemt antalml pr. minut. Typisk benyttes 0.5 eller 1.0 ml/minut. Prøven (f.eks. 100 µL) føres ind i væskestrømmengennem en særlig ventil. Når prøvens molekyler passerer gennem gelsøjlen sker der en forsinkelse af de såmolekyler; jo mindre molekyler jo større forsinkelse. De forskellige størrelsesklasser, hvis der er �ere, afmolekyler får dernæst målt deres Rayleighforhold (KCM) i en lysspredningsmåler og deres koncentrationC i et refraktometer. Herefter kan molekylvægten i princippet bestemmes ved forholdet mellem de to måltestørrelser.

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0 5 10 15 20 25 30 35

minutter

UR

I (v

olt

)

URI, Basis

Figur 5.4: Signalet fra brydningsindexdetektoren ligger på en konstant basisværdi så længe der kun løberren bu�er igennem målecellen. Når der opløste molekyler passerer vokser signalet og aftager dernæst igentil basisniveauet, når alle de opløste molekyler er passeret.


0.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

0 5 10 15 20 25 30 35

minutter

UL

S (

vo

lt)

ULS, Basis

Figur 5.5: Signalet fra lysspredningsdetektoren ligger på en konstant basisværdi så længe der kun løberren bu�er igennem målecellen. Når der opløste molekyler passerer vokser signalet og aftager dernæstigen til basisniveauet, når alle de opløste molekyler er passeret. Sammenlign med forløbet af brydnings-indexsignalet i �gur 5.4 ovenfor. Det ses, at brydningsindexsignalet er forsinket ca. 3 minutter i forholdtil lysspredningssignalet. Dette skyldes, at det tager molekylerne 3 minutter at komme fra målecellen ilysspredningsapparatet til målecellen i brydningsindexmåleren. Denne tid (3 minutter er urealistisk langtid) er bestemt af længden og diameteren af den slange, der forbinder de to måleinstrumenter samt afpumpehastigheden.

Brydningsindexmåleren måler egentlig forskellen mellem brydningsindexet af opløsningen, der

pumpes igennem, og en væske, der befinder sig i et referencekammer i instrumentet. Denne

anden væske er som regel blot den rene buffer. I princippet skulle brydningsindexmåleren så

give et nulsignal, når der løber ren buffer igennem målekammeret. I praksis får man normalt

ikke præcis 0 volt under disse omstændigheder. Årsagen kan være små forskelle i det optiske

system, der hører til målekammeret og referencekammeret, små (utilsigtede) forskelle i sam-

mensætningen af bufferen i referencekammeret og i målekammeret, samt nulpunktsfejl i den

elektronik, der forstærker signalerne fra de to kamre.

Det vil sige, at den elektriske spænding, URI, som brydningsindexmåleren giver, kan skrives

som

URI = URI, Basis + kRI · (nopløsning − nbuffer) (5.7)

eller, ved anvendelse af ligning 5.3

URI = URI, Basis + kRI ·dn

dC· C (5.8)

Konstanten kRI afhænger af forstærkningen i brydningsindexmålerens elektronik, men har ofte

5.1. Apparatur 61

en størrelse, så en ændring i brydningsindex på 0.01 giver en ændring i spændingen URI på 1

volt. Den præcise værdi af kRI skal naturligvis være kendt (kan findes i instrumentets manual)

for at man kan bruge brydningsindexmåleren til at bestemme dndC

-værdier for stoffer. Lige nu vil

vi imidlertid ikke bekymre os om denne konstant.

5.1.3 Inline måling af lysspredning i forbindelse med SEC

Vi forestiller os stadig, at der er blevet injiceret en lille mængde opløsning med ens, opløste mo-

lekyler. Når de opløste molekyler passerer målecellen i apparatet, der måler lysspredningen fås

et signal som vist på figur 5.5. Når intensiteten eller Rayleighforholdet (ligning 2.2) af det spred-

te lys måles, opstår det samme "problem"som når der skal måles brydningsindex: Instrumentet,

der måler lysspredningen (Rayleighforholdet) giver ikke et nulsignal, når der ingen lysspred-

ning burde være. Dette skyldes flere forhold: For det første har elektronikken i detektorsystemet

altid en større eller mindre nulpunktsfejl, der betyder at selvom der slukkes for laseren, viser

instrumentet noget andet end 0 volt. For det andet vil der, når laseren er tændt, i et vist omfang

komme lys ind i detektoren, der ikke har noget at gøre med de opløste molekyler, men skyldes

forskellige former for reflekser i indre glasoverflader samt lys der spredes af mikroskopiske rid-

ser, buler og snavs i kuvetteoverfladen. For det tredie vil selv den rene buffer i et vist (men som

regel lille) omfang sprede lyset på grund af spontane fluktuationer i væskens brydningsindex.

Alt dette medfører, at signalet, ULS, der kommer fra apparatet, der måler lysspredningen kan

skrives

ULS = ULS, Basis + kLS ·R(q) (5.9)

hvor R(q) er Rayleighforholdet ved den aktuelle spredningsvinkel (eller q-værdi). Værdien af

konstanten kLS afhænger af bl. a. detektorens effektivitet og areal og forstærkningen i apparatets

elektronik. Hvis lysspredningsinstrumentet indeholder flere detektorer har hver af dem sin egen

individuelle værdi af konstanten kLS. Ved brug af ligning 5.1 kan ligning 5.9 skrives

ULS = ULS, Basis + kLS ·KCMapp. (5.10)

hvor K =4π2n2

0(dn/dC)2

NAλ40

er den optiske kontrastkonstant defineret i afsnit 2.5. Hvis vi for sim-

pelheds skyld skriver kontrastkonstanten som K = k1 · (dn/dC)2, kan ligning 5.10 omskrives

endnu en gang til

ULS = ULS, Basis + kLS · k1 · (dn/dC)2 · CMapp. (5.11)


Bemærk, at signalerne fra de to apparater ligner hinanden, men brydningsindexsignalet kom-

mer ca 3 minutter senere end lysspredningssignalet. Denne forsinkelse skyldes, at det i dette

tilfælde tager ca. 3 minutter for molekylerne at komme fra lysspredningsmålecellen til bryd-

ningsindexmålecellen. Denne tidsforskydning er bestemt af hvor hurtigt eluenten pumpes igen-

nem systemet og hvor stor rumfang, der ligger i slangen, der forbinder de to apparater. Når man

sammenligner lysspredningssignalet og brydningsindexsignalet, skal det ikke være signalerne

taget til den samme tid, men når de repræsenterer den samme portion opløsning. Med andre

ord: man skal sammenligne ULS(t) med URI(t + ∆t) , hvor ∆t er den omtalte tidsforsinkelse.

I dette tilfælde er altså ∆t = 3 minutter. Den præcise værdi af tidforsinkelsen bestemmes ved

at se hvor stor tidsforskellen er mellem de to kurvers toppunkter (man kan ikke fastlægge for-

skellen mellem starten på de to toppe med samme præcision). Ved at kombinere ligning 5.8 og

ligning 5.11 kan Mapp. findes

Mapp. =(ULS − ULS, Basis) · kRI

(URI − URI, Basis) · k1 · kLS · dndC

(5.12)

Hvis vi samler alle konstanterne sammen til én og kalder denne for kdet. kan dette skrives

Mapp. =kdet.dndC

· ULS − ULS, Basis

URI − URI, Basis

(5.13)

Man skal her være opmærksom på, at signalerne fra de to instrumenter ikke skal tages til samme

tid, så mere præcist kan vi skrive

Mapp. =kdet.dndC

· ULS(t)− ULS, Basis

URI(t+∆t)− URI, Basis

(5.14)

Det kunne her se ud som om molekylvægten er en funktion af tiden. I princippet er dette også

rigtigt. Men hvis der ikke er koncentrationseffekter, altså at den 2. virialkoefficient er tilpas

lille, eller at koncentrationen er tilpas lav, så vil lysspredningen være proportional med koncen-

trationen. I dette tilfælde vil tæller og nævner i ligning 5.14 være proportionale til alle tider,

hvorfor de til alle tider giver den samme værdi af Mapp.. Dette er imidlertid teori. I praksis må

man sørge for, at URI ikke ligger for tæt på sin basisværdi, da man så i ligning 5.14 kommer

til at dividere med et tal, der ligger tæt på 0, hvad der gør værdien af Mapp. meget "ustabil".

Holder man sig i rimelig afstand fra basisværdierne vil man således få en konstant værdi for

Mapp.. Den er bestemt mest nøjagtigt når tæller og nævner i ligning 5.14 er størst mulige, dvs.

5.1. Apparatur 63

har deres toppunktsværdier. Hvis der derimod er koncentrationseffekter vil det vise sig ved, at

Mapp. ikke har en konstant værdi indenfor toppens bredde. Man vil i stedet se at Mapp. varierer

"parabelagtigt"hen over en top. Om "parablen"vender grenene opad eller nedad kommer an på

fortegnet for den anden virialkoefficient.

5.1.4 Bestemmelse af molekylvægt

Vi vil nu gå ud fra, at der ikke forekommer koncentrationseffekter. Dette kan som nævnt konsta-

teres ved at brøken i ligning 5.14 giver den samme værdi når man benytter toppunktsværdierne

i tæller og nævner som når man benytter værdier, der ligger et stykke fra toppunkterne (hvor

koncentrationen er lavere).

I princippet kan konstanten kdet. i ligning 5.14 bestemmes ved at injicere en opløsning af et stof

med en kendt molekylvægt og en kendt værdi af dndC

i bufferstrømmen. Det skal være et stof,

hvor molekylerne er så små, at formfaktoren har den konstante værdi 1. Herved sikres, at Mapp.

er den sande molekylvægt. Hertil kan f.eks. benyttes BSA. Hvis vi benytter BSA som eksempel

finder vi så

kdet. = MBSA ·(dn

dC

)BSA

· URI, top − URI, Basis

ULS, top − ULS, Basis

(5.15)

Bemærk, at værdien af detektorkonstanten ikke afhænger af om der er benyttet BSA eller an-

det til bestemmelsen. Man kan benytte det protein (eller et andet stof, hvis molekylvægt ogdndC

-værdi, man kender), der er mest bekvemt. Når man på denne måde har bestemt sin detek-

torkalibreringsfaktor for hver detektor i instrumentet (kalibreringskonstanterne kan være meget

forskellige fra detektor til detektor), kan man benytte dem i ligning 5.14 til at bestemme den

tilsyneladende molekylvægt for det protein, man undersøger. Den tilsyneladende molekylvægt

for stoffet beregnes for hver detektor, og et Guinier-plot anvendes (om nødvendigt) til at be-

stemme den sande molekylvægt ved at estimere Mapp. for q = 0. Hvis linien i Guinier-plottet

har tilstrækkelig stor hældning, kan man også bestemme molekylernes gyrationsradius.

AKomplekse tal

Komplekse tal er et meget "handy"hjælpemiddel til visse typer af matematiske beregninger, der

har at gøre med sinus og cosinus-funktionerne, idet disse ved indførelsen af komplexe tal viser

sig at være beslægtede med eksponentialfunktionen. Dette er nyttigt, da det i mange tilfælde er

lettere at regne med eksponentialfunktioner end med de trigonometriske funktioner.

Komplekse tal er en udvidelse af de reelle tal med det (matematiske) formål at kunne finde

løsninger til ligninger af enhver grad. Det viser sig at den eneste kamel man skal sluge (eller

bare vænne sig til) er, at regne med tallet

i =√−1

Dette tal kaldes "den imaginære enhed"og man definerer generelt et komplekst tal z som

z = x+ i · y

hvor x og y er reelle tal. Hvis y = 0 er der tale om et sædvanligt reelt tal. Hvis x = 0 siges

tallet z at være et rent imaginært tal. Alle sædvanlige regneregler gælder for disse ”udvidede”

tal, og der er ikke brug for yderligere ”udvidelser” eller ”tilføjelser” til disse tal for at kunne

løse nogensomhelst ligninger. De komplekse tal er tilstrækkelige til at at man (i princippet) kan

løse ligninger af enhver grad, også selvom ligningernes koefficienter selv er komplekse tal. Og

65

66 Appendix A. Komplekse tal

det er muligt at beregne kvadratrødder og andre rødder af ikke bare negative tal men også af de

komplekse tal selv. Resultatet af en sådan beregning er bare et (andet) komplekst tal.

Tallet z kan ikke repræsenteres på en tallinie, men må repræsenteres i "den komplexe plan", et

2-dimensionalt koordinatsystem.

Man definerer (som for vektorer) den numeriske værdi |z| af z ved udtrykket

|z| =√x2 + y2

Kompleks-konjugering af et komplekst tal z går ud på at skifte fortegn på tallets imaginære del,

og det komplekskonjugerede tal hørende til det komplekse tal z betegnes z∗:

z = x+ i · y ⇒ z∗ = x− i · y

Man ser, ved at benytte at i2 = −1, at

zz∗ = |z|2

Nu kommer det nyttige: Eksponentialfunktionen af det imaginære tal i · ϕ er defineret ved

ei·ϕ = cosϕ+ i · sinϕ

og eksponentialfunktionen af et generelt komplekst tal x + iy beregnes blot ved anvendelse

af potensregnereglerne. I fysikken beskriver man ofte bølgefænomener, f.eks udbredelse af en

elektromagnetisk bølge ved sinus eller cosinus:

E(x, t) = E0 cos(ωt− kx)

Dette kan ligeså godt skrives:

E(x, t) = E0ei (ωt−kx)

hvor man så kun tillægger den reelle del af E(x, t) fysisk betydning. Man ser, ved at benytte

definitionen på den komplekse eksponentialfunktion, at komplekskonjugering af E(x, t) giver

E∗(x, t) = E0e−i (ωt−kx)

hvorved

E(x, t)E∗(x, t) = E20e

i (ωt−kx)e−i (ωt−kx)

= E20e

i (ωt−kx)−i (ωt−kx)

= E20

67

Hvis E(x, t) er en sum af forskellige cosinusled (eller eksponentialfunktioner), er det på denne

måde meget let, at beregne værdien af |E(x, t)|2 ved at beregne E(x, t)E∗(x, t). Det er dette, der

er baggrunden for den udbredte anvendelse af den komplexe eksponentialfunktion i fysikken.

68 Appendix A. Komplekse tal

BData fitning

Man har i fysikken ofte det problem, at der til et sæt af data y1, y2, . . . , yn målt som funktion

af en variabel t til værdierne af denne t1, t2, . . . , tn skal bestemmes en funktion y(t) = f(t),

der passer bedst muligt til de målte dataværdier. "Bedst muligt"betyder, løst sagt, at summen

af kvadratiske afvigelser mellem beregnede og målte dataværdier skal være så lille som muligt,

altså, at størrelsenn∑

j=1

(yj − f(tj))2

σ2j

skal være mindst mulig. Denne størrelse benævnes χ2 og kaldes "ki-kvadratet". Altså:

χ2 =n∑

j=1

(yj − f(tj))2

σ2j

Man siger, at man har foretaget et "mindstekvadraters fit". Der indgår i nævneren i hvert led

den statistiske varians (der er et statistisk præcist mål for måleusikkerheden i anden potens)

på de enkelte datapunkter (f.eks. bestemt ved mange gentagelsesmålinger). Dette er rimeligt,

da datapunkter, der er bestemt med stor statistisk usikkerhed, herved får mindre indflydelse

på hvordan χ2 gøres mindst mulig. Den søgte funktion, y(t) = f(t), søges altid i en klasse

af bestemte funktioner, som man mener kan beskrive de målte data og de enkelte funktioner

i denne klasse er fastlagt ved nogle parametre, a1, a2, . . . , am. Det, som det så gælder om

69

70 Appendix B. Data fitning

er, at finde de parameterværdier, der gør χ2 mindst mulig. Eksempelvis kan man forsøge at

beskrive en målt autokorrelationsfunktion, g2(tj), hvor j = 0, . . . , 256 ved hjælp af en tænkt

autokorrelationsfunktion af formen y(t) = (A1e−D1q2t + A2e

−D2q2t)2 + 1. De parametre, der

her skal tilpasses, er A1, A2, D1, D2. Dvs. at man nu skal minimalisere

χ2 =256∑j=1

(g2(tj)− (A1e−D1q2t + A2e

−D2q2t)2 + 1)2

σ2j

Dette foregår i praksis på computer, hvor man har udviklet forskellige metoder til at søge efter

de optimale parametre. Man går altid ud fra et sæt gættede værdier for parametrene, og compu-

teren forbedrer så dette gæt indtil χ2 når et lokalt minimum. Der findes ingen metode hvorved

man kan sikre, at det fundne minimum er globalt og der findes heller ingen måde hvorpå man

kan være sikker på, at eftersøgningen overhovedet finder et lokalt minimum. Dette kan komme

stærkt an på, hvor heldig man er med sit første gæt. Metoderne benytter næsten altid en be-

regning af gradienten af χ2, der er en vektor i parameterrummet, der peger i den retning, hvor

χ2 vokser hurtigst. Et givet parametersæt forbedres så ved at bevæge sig i retningen −∇χ2 et

passende stykke og så vælge sine forbedrede parametre her. Dernæst beregnes gradienten i dette

parameterpunkt, og proceduren gentages indtil gradienten er nær 0⃗, hvorved man er i (nær) et

minimum.

Index

absorption, 3–4

adskillelse, 55, 58

approximation

Debye, 32, 34, 37

Guinier, 31, 32, 37

autokorrelationsfunktionen, 44–53

fitning, 53, 70

autokorrelator, 43, 45

Brown’ske bevægelser, 43, 45, 46

brydningsindex, 10, 12, 16, 17, 20, 24, 25, 56,

58

increment, 25

måling af, 36, 56

som koncentrationsmål, 36, 58–62

vand, 29

brydningsindexmåler, 56, 58–60

bølgetal, 12, 16, 20

bølgevektoren, 16, 20

CONTIN, 52, 53

Cumulant analyse, 49, 50, 53

dataanalyse, 70

dataanlyse, 31, 33, 35, 48

dynamisk lysspredning, 48–53

Debye, 7

approximationen, 32, 34, 37

differential-refraktometer, 36

differentialrefraktometer, 56

diffusionskoefficient, 41

for kugle, 41

koncentrationsfhængighed, 42

middel-, 50

Stokes-Einstein relationen, 41

diffusionskoefficienten

termodynamisk bestemmelse, 42

dipol, 10–11

moment, 12, 14, 15

DLS, 5

dn/dC, 24, 25, 61

dynamisk lysspredning, 4–6, 41–48

faseforskel, 17–22, 24, 43

fitning, 35, 49, 50, 52, 53, 69

flowcelle, 56

formfaktor, 29–32, 34, 37

i forb. med DLS, 47

fotodiode, 4

fotomultiplikatorrør, 4

fotontælletal, 44, 45

gel-søjle, 35, 36

gelsøjle, 55, 58, 59

71

72 Index

gennemsnitsbestemmelse, 33–34

af gyrationsradier, 33, 34

af molekylvægte, 33, 34

Guinier

approximationen, 31–33, 37

plot, 31–33

Guinier-plot, 63

gyrationsradius, 31–33, 63

cylinder, 38

ellipsoide, 38

gennemsnits-, 34

kasse, 38

kugle, 38

kugleskal, 38

og molekylvægt, 35

z-middelværdi, 51

øvre grænse, 36

ILT, 52

intensitetsfluktuationer, 43

inversionsproblemet, 51

isotrop spredning, 14, 29

kalibreringskonstant, 63

komplekse eksponentialfunktion, 66

komplekse tal, 65

komplekskonjugering, 66

koncentrationseffekter, 62, 63

ved DLS, 42

ved statisk lysspredning, 27

kontrastkonstant, 25, 36, 56, 61

korrelationstid, 45, 46, 50, 53

kugle, 38

ladningsfordeling, 10

lysspredning

dynamisk, 5, 6, 41–48

dataanlyse, 48–53

statisk, 4–25

i praksis, 55–63

middelmolekylvægt, 34, 45

mindstekvadraters fit, 35

mindstekvadraters fit, 69

molekylvægt, 5, 7, 14

bestemmelse af, 27, 31, 33, 34

vægtmidlet, 34

monodisperse opløsninger, 48, 50

monokromatisk lyskilde, 4

opløsninger

monodisperse, 48, 50

polydisperse, 49

osmotisk tryk, 28

og diffusionskoefficienten, 42

parametre, 35, 49, 50, 53, 69

optimale, 70

PMT, 4

polarisabilitet, 11, 13–15

polydisperse opløsninger, 49

polysakkarider, 56, 58

proteiner, 25, 56–58, 63

q-værdi, 9, 16, 20, 29, 31, 32, 36, 46

Rayleighforhold, 59, 61

Index 73

Rayleighforholdet, 9, 25, 28, 35

og osmotisk tryk, 28

refraktometer, 35, 36, 56, 57, 59

regularisering, 52

SLS, 5

snavs, 61

spredningsevnen, 20, 22

spredningsfunktionen, 29

spredningsintensitet, 23, 24, 29

spredningsvektoren, 9, 16, 17, 20, 25

længde, 17, 21, 25

spredningsvinkel, 5, 9, 31, 61

spredningsvolumen, 9, 10

statisk lysspredning, 4–25

Stokes-Einstein relationen, 41, 42

strukturfaktor, 28

størrelse

bestemmelse af, 27

størrelsesadskillelse, 58

størrelsesbestemmelse, 27, 31

indirekte, 41

sukkerstoffer, 58

turbiditet, 4

virialkoefficient, 28, 56, 62, 63

viskositet, 41

vægtkoncentration, 24, 25, 27

z-middelværdien, 34, 51

Lysspredningogendal/personal/lho/lysspredning.pdf · 2012. 2. 21. · store molekyler, f. eks. BSA,...

Documents

Transcript of Lysspredningogendal/personal/lho/lysspredning.pdf · 2012. 2. 21. · store molekyler, f. eks. BSA,...