LUCIFERAZE

“THE SWISS ARMY KNIFE OF MOLECULAR BIOLOGY”

Da se upoznamo sa glavnim terminima

LUMINESCENCIJA je hladno zračenje svetlosti, ali ne kao posledica pretvaranja toplotne E u svetlosnu nego drugih izvora

energije. U zavisnosti od izvora E razlikujemo različite tipove

luminescencije.

BIOLUMINESCENCIJA je proces u kome živi organizam

emituje svetlost kao posledica enzimske reakcije koju

katalizuje enzim LUCIFERAZA.

LUCIFERIN + O2

PEROKSIDNI INTERMEDIJER

[OXILUCIFERIN]*

OXILUCIFERIN + SVETLOST

Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska u stabilno nepobuđeno stanje.

Fluorescencija ili fosforescencija je suprotan proces u kome je potrebno da dođe do apsorpcije energije koja

će kao rezultat dati emisiju svetlosti.

SUPSTRAT

Luciferini - klasa malih molekula koji pri oksidaciji oslobađaju svetlost

Vibrio, Photobacterium Dinoflagellata Koelenterazin – Ctenophora,

Radiollaria , Cnidaria

Latia Vargulin – Ostracodes, Poricthys Lampyridae

Widder, 2017, Science

KOJI ORGANIZMI IMAJU SPOSOBNOST BIOLUMINESCENCIJE

• Više od 2500 vrsta, a od toga 80% su morski organizmi

• Bakterije – Gammaproteobacteria rodovi Vibrio, Aliivibrio, Photobacterium

• Kopneni zglavkari i insekti: Myriapoda, Geophila, Hexapoda, Collembola, Diptera, Colepotera

• Dva od tri najčešće korišćena reporter sistema koji se zasnivaju na mehanizmu bioluminescencije u molekularnoj biologiji su izolovana iz kopnenih organizama (Photinus pyralis – svitac, Photorhabdus luminescens – crevni patogen, nematoda), a najnovija okarakterisana koja je ušla u primenu je luciferaza izolovana i Gaussia princeps, morska kopepoda

• 2008. godine – Nobelova nagrada za hemiju Osamu Shimomura za otkriće i razvoj GFP sa još dva američka naučnika

Widder, 2017, Science

NEPOŽELJAN PLEN – PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI

BAKTERIJSKE LUCIFERAZE

Heterodimeri, α -subjedinica (35 kDa) i β-subjedinica (40 kDa)

MEHANIZAM DEJSTVA VIBRIO FISCHERI

FMNH2 + O2 + RCHO → FMN + RCOOH + H2O + SVETLOST

LUX SISTEM

Organizacija LUX operona različitih bakterijskih vrsta.

Jezgro operona čine luxCDABE geni, dok se prisustvo ostalih gena

razlikuje od vrste do vrste.

LUX SISTEM

luxA i luxB – heterodimer luciferaze, luxC, luxD i luxE – multienzimski

kompleks reduktaza masnih kiselina, luxF – flavoprotein homolog

subjedinici luciferaze, luxG – flavin reduktaza, luxH – protein

najverovatnije uključen u sintezu FMN.

QUORUM SENSING...

• Komunikacija i koordinisano “ponašanje” populacije zavisno od koncetracije signalnog molekula (primer na slici kod Vibrio fischeri)

INSEKTI I BIOLUMINESCENCIJA

Najbogatija i najraznovrnija grupa organizama

Do sada je opisano 2500 vrsta koje imaju ovu osobinu

Od identifikacije luciferina svica 60 i 70-tih godina prošlog

veka do danas je okarakterisano još šest luciferina iz različitih

grupa organizama

• Razlike u emisiji nastaju kao posledica različitih supstrata i

rekcije koju katalizuje luciferaza

INSEKTI I BIOLUMINESCENCIJA

A.Photinus pyralis, Mg2+ za hirdrolizu ATP

B. Renilla reniformis, Ca2+

PHOTINUS PYRALIS – SVITAC

Najbolje proučena luciferaza, izolovana i okarakterisana 1976. god.

Gen je u jednoj kopiji, ima 7 egzona i 6 introna; protein 62 kDa

MEHANIZAM KOD PHOTINUS PYRALIS

Luciferin+ ATP → Luciferin adenilat + PPi

Luciferin adenilat + O2 → Oksiluciferin + AMP + SVETLOST + H2O + CO2

EVOLUCIJA LUCIFERAZA

• Na osnovu raznovrsnosti enzima, supstrata i mehaniama uključenih u bioluminescenciju pretpostavka je da je bioluminiscencija evoluirala nezavisno bar 40 puta u različitim organizmima.

• Većina napora da se objasni evolucija se svodi na dva osnovna koji su usemreni na selektivni pritisak na supstrat ili enzim.

• U prvom slučaju selektivni pritisak je mogao da bude zaštiti organizme od rastuće koncentracije toksičnog kiseonika. Dok je moguća i hipoteza da su nastale od oksigenaza sa mešovitom funkcijom koje su uključene u oksidaciju rastuće koncentarcije organiskih jedinjenja.

• Sve ovo može da se odnosi samo na bakterijske luciferaze.

• Trenutno stanovište je da je većina luciferaza nastala de novo.

• Nastale od predačkog kalmodulin vezujućeg proteina, acil-CoA sintetaze, aminoacil-tRNK sintetaze, itd.

EVOLUCIJA LUCIFERAZA INSEKATA

-Polipeptidi 545-550 AK - ~60 kDa - na C-kraju SKL tripeptid (SerLysLeu) - 66-99% identičnosti - od slabo luminescentnih ligaza, formiranje aktivnog mesta luciferaze, koevolucija sa fotocitama do današnjih luciferaza

• Različita zastupljenost i kod bakterija iste vrste.

• Sekvenca Lux operona konzervirana kod svih luminescentnih bakterijskih vrsta.

• Prvo je povezana sa reparacijom DNK, a zatim sa quorum sensing (QS) sistemom. Međutim, QS nije karakterističan samo za bioluminescenciju (BL) – Šta je nastalo prvo BL ili QS?

• Bakterijske luciferaze kod bakterija koje žive u simbiozi su koevoluirale sa domaćinom i/ili njegovim organom za proizvodnju svetlosti.

• Najnoviji okarakterisani luciferazni sistemi kod dinoflagelata govore o mogućem gubitku odnosno redukciji luminescentnog potencijala i konvergentnoj evoluciji.

EVOLUCIJA LUCIFERAZA BAKTERIJA

PRIMENA I ZNAČAJ

Reporter geni u bakterijskim i eukariotskim ćelijskim linijama

identifikacija promotora

detekcija bakterija u uzorku

in vivo praćenje bakterijske i virusne infekcije

in vivo praćenje ekpresije gena u eksperimentalnim životinjama

in vivo praćenje tumora

GFP vs. Luciferazni reporter geni

- drastično kraći poluživot luciferze

- nema posttranslacionih modifikacija

- ne zavise od egzogenih supstrata ili ekscitatora - više puta ponovljeno merenje

- talasna dužina emitovane svetlost je duža, a E veća

- brži, manje zahtevni i jeftiniji

• Autoindukujući reporter sistem – V. harveyi za praćenje interspecijske komunikacije kod bakterija

• Ekspresija bakterijskih gena

• Vizualizacija kontaminacije u uzorcima hrane i okolini

• Detekcija bakterija u ciljnim tumorima, a u sklopu antitumorskog tretmana

• Praćenje ekspresije eukariotskih gena primenom eukariotskih luc i ruc luciferaznih reporter gena

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

PRIMENA I ZNAČAJ

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

PRIMENA I ZNAČAJ

Guo et al., 2013, Anti. Agents Chem.

PRIMENA I ZNAČAJ

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

van Zyl et al., 2015, Gut Microbes

• Kontrolisani koncentracijom arsena u podlozi

...I BIOSENZORI

• "sequencing by synthesis "

• Ronaghi i Nyrén 1996.

PIROSEKVENCIRANJE

• Sve zavise od O2

• Veoma je važno kako se ovi reporter geni ubace u organizam koji se analiziran, ali i jedna hromozomska kopija je bolja od plazmidno lociranih gena

• Nezamenljive u molekularnoj biologiji

• Kombinuju sposobnost da mere aktivnost promotora i u isto vreme određuju lokaciju bakterija i kvantifikaciju bakterija u kulturi, u kulturi eukariotskih ćelija, tkivima ex vivo i in vivo

ZAKLJUČAK