Lpo Immunohistochemistry

7/30/2019 Lpo Immunohistochemistry

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J C l i n P a t h o l 1 9 9 7 ; 5 0 : 4 0 1 - 4 0 6

I n s i t u d e t e c t i o n o f l i p i d p e r o x i d a t i o n i n c h r o n i ch e p a t i t i s C : c o r r e l a t i o n w i t h p a t h o l o g i c a l f e a t u r e sV P a r a d i s , P M a t h u r i n , M K o l l i n g e r , F I m b e r t - B i s m u t , F C h a r l o t t e , A P i t o n , P O p o l o n ,A H o l s t e g e , T P o y n a r d , P B e d o s s a

Department o fP a t h o l o g y , H B p i t a l d eB i c e t r e , LeK r e m l i n - B i c e t r e ,FranceV P a r a d i sP B e d o s s aH o p i t a l LaP i t i e - S a l p e t r i e r e ,P a r i s , F r a n c e :Department o fH e p a t o l o g yP M a t h u r i nP O p o l o nT P o y n a r dDepartment o fB i o c h e m i s t r yF I m b e r t - B i s m u tA P i t o nDepartnent o fP a t h o l o g yF C h a r l o t t eDepartment o fI n t e r n a l Medicine I,U n i v e r s i t y o fR e g e n s b u r g , Ger m a nyM K o l l i n g e rA H o l s t e g eC o r r e s p o n d e n c e t o :Dr V a l e r i e P a r a d i s , S e r v i c ed ' A n a t o m i e P a t h o l o g i q u e ,H 6 p i t a l d e B i c e t r e , 7 8 , r uedu G e n e r a l L e c l e r c , 94275Le K r e m l i n - B i c e t r e , F r a n c e .A c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n2 2 J a n u a r y 1 9 9 7

A b s t r a c tAins-To a s s e s s t h e o c c u r r e n c e o f l i p i dp e r o x i d a t i o n i n c h r o n i c h e p a t i t i s C and t oe v a l u a t e i t s r e l a t i o n t o p a t h o l o g i c a l f e a -t u r e s and l i v e r i r o n c o n c e n t r a t i o n s .Methods-Liver b i o p s y s a m p l e s o f 4 3p a t i e n t s w i t h u n t r e a t e d c h r o n i c h e p a t i t i sC were s t u d i e d by i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yu s i n g s p e c i f i c a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s ttwo major a l d e h y d e m e t a b o l i t e s o f l i p i dp e r o x i d a t i o n , m a l o n d i a l d e h y d e (MDA),and 4 - h y d r o x y n o n e n a l ( H N E ) .Results-MDA and HNE a d d u c t s ( a l d e -h y d e s c o v a l e n t l y l i n k e d t o a n o t h e r m o l -e c u l e ) were d e t e c t e d i n t h e l i v e r s a m p l e si n 77 % and 30% o f c a s e s , r e s p e c t i v e l y .MDA a d d u c t s were d e t e c t e d b o t h i n t h ee x t r a c e l l u l a r m a t r i x and s i n u s o i d a l c e l i sl o c a l i s e d i n a r e a s o f p e r i p o r t a l and l o b u l a rn e c r o s i s . HNE a d d u c t s a p p e a r e d i n t h ec y t o p l a s m o f o n l y a f e w h e p a t o c y t e s .Comparison o f t h e s e m i q u a n t i t a t i v e a s -s e s s m e n t o f a d d u c t s ( M D A and HNEi n d e x e s ) w i t h t h e g r a d i n g and t h e s t a g i n go f c h r o n i c h e p a t i t i s showed t h a t t h e MDAi n d e x was c o r r e l a t e d w i t h f i b r o s i s s c o r e( p < 0 . 0 0 1 ) and t h e g r a d e o f a c t i v i t y( p < 0 . 0 1 ) . T h e r e was a l s o a t e n d e n c y t oc o r r e l a t i o n w i t h l i v e r i r o n c o n c e n t r a t i o n( p = 0 . 0 9 ) . No c o r r e l a t i o n was o b s e r v e db e t w e e n t h e HNE i n d e x and p a t h o l o g i c a lf e a t u r e s o r l i v e r i r o n c o n c e n t r a t i o n .C o n c l u s i o n - L i p i d p e r o x i d a t i o n p r o d u c t sa r e d e t e c t a b l e i n t h e l i v e r o f c h r o n i c h e p a -t i t i s C p a t i e n t s . Th e p r e s e n c e o f MDAa d d u c t s i n a r e a s o f a c t i v e f i b r o g e n e s i s andt h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e MDA i n d e xand f i b r o s i s s c o r e s u g g e s t a r o l e f o r l i p i dp e r o x i d a t i o n i n l i v e r f i b r o s i s .( C l i n P a t h o l 1 9 9 7 ; 5 0 : 4 0 1 - 4 0 6 )K e y w o r d s : l i p i d p e r o x i d a t i o n ; c h r o n i c h e p a t i t i s C ;i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y

A m a j o r a n d f r e q u e n t c o m p l i c a t i o n o f c h r o n i ch e p a t i t i s C v i r u s i n f e c t i o n i s t h e d e v e l o p m e n to f l i v e r f i b r o s i s l e a d i n g t o c i r r h o s i s i n a b o u t2 0% o f c a s e s . ' Th e p a t h o g e n e s i s o f h e p a t i t i s Cv i r u s i n d u c e d l i v e r d a m a g e a n d l i v e r f i b r o g e n -e s i s i s u n c l e a r . B a s e d on d a t a o b t a i n e d i nc h r o n i c h e p a t i t i s B v i r u s i n f e c t i o n , i t h a s b e e np r o p o s e d t h a t f i b r o s i s c o u l d b e t h e r e s u l t o fn e c r o i n f l a m m a t o r y l e s i o n s ( a c t i v i t y ) , b u t t h ep r e c i s e m e c h a n i s m s l i n k i n g h e p a t i t i s C v i r u si n f e c t i o n , c h r o n i c i n f l a m m a t i o n , a n d f i b r o s i sh a v e n o t b e e n d e t e r m i n e d . 2 " Among f a c t o r si n v o l v e d i n f i b r o g e n e s i s , c y t o k i n e s , g r o w t h f a c -

t o r s , a n d i r o n o v e r l o a d h a v e b e e n c o n s i d e r e d . 4 ` 6F u r t h e r m o r e , s e v e r a l r e c e n t s t u d i e s h a v e s u g -g e s t e d t h a t l i p i d p e r o x i d a t i o n m i g h t p l a y a r o l ei n t h e f i b r o g e n e s i s o b s e r v e d i n some c h r o n i cl i v e r d i s e a s e s . 8 I t w a s t h e r e f o r e p r o p o s e d t h a tt h e r e may b e a l i n k b e t w e e n t i s s u e i n j u r y a n dl i v e r f i b r o s i s b y m o d u l a t i n g c o l l a g e n g e n ee x p r e s s i o n . 9 ' - 2L i p i d p e r o x i d a t i o n i s c a u s e d b y f r e e r a d i c a l sl e a d i n g t o o x i d a t i v e d e s t r u c t i o n o f p o l y u n s a t u -r a t e d f a t t y a c i d s c o n s t i t u t i v e o f c e l l u l a rm e m b r a n e s . " T h e i r d e s t r u c t i o n l e a d s t o t h ep r o d u c t i o n o f t o x i c a n d r e a c t i v e a l d e h y d em e t a b o l i t e s s u c h a s m a l o n d i a l d e h y d e (MDA)a n d 4 - h y d r o x y n o n e n a l ( H N E ) . ' 4 T h e s e h i g h l yc y t o t o x i c m e t a b o l i t e s , p r o d u c e d i n r e l a t i v e l yl a r g e a m o u n t s , c a n d i f f u s e f r o m t h e i r s i t e o fo r i g i n t o a t t a c k d i s t a n t t a r g e t s a n d f o r mc o v a l e n t l i n k s w i t h v a r i o u s m o l e c u l e s ( a d -d u c t s ) . T h e r e f o r e , r e c o g n i t i o n o f l i p i d p e r o x i -d a t i o n i s o f i n t e r e s t , a s t h e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o ft h i s p r o c e s s , i n c l u d i n g f i b r o g e n e s i s , m i g h t b ep r e v e n t e d b y a d m i n i s t r a t i o n o f s c a v e n g i n g s y s -t e m s o r a n t i o x i d a n t s . 1 "Most p r e v i o u s s t u d i e s i n v e s t i g a t i n g l i p i dp e r o x i d a t i o n d e a l t w i t h b l o o d a n d t i s s u ee x t r a c t s b y i n d i r e c t q u a n t i t a t i v e m e t h o d s ; t h et h i o b a r b i t u r i c a c i d ( T B A ) t e s t h a s b e e n t h em o s t commonly a p p l i e d . ' 6 U s i n g t h i s p r o c e -d u r e , a n i n c r e a s e i n MDA w a s o b s e r v e d i nserum a n d l i v e r o f p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a -t i t i s C . 8 1 7 R e c e n t l y , s p e c i f i c a n t i b o d i e s a g a i n s tMDA a n d HNE a d d u c t s h a v e b e e n r a i s e d . ' 8 1 9T h e s e a n t i b o d i e s c a n b e u s e d t o d e t e c t i n s i t ut h e p r e s e n c e o f t h e s e l i p i d p e r o x i d a t i o n d e r i v e da d d u c t s a n d t o s p e c i f y t h e i r c e l l u l a r l o c a l i s a -t i o n .Th e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h er o l e o f l i p i d p e r o x i d a t i o n i n c h r o n i c h e p a t i t i s Ca n d i t s r e l a t i o n w i t h l i v e r f i b r o s i s . T o a s s e s s t h e

o c c u r r e n c e o f l i p i d p e r o x i d a t i o n , MDA a n dHNE a d d u c t s w e r e d e t e c t e d on l i v e r b i o p s i e sw i t h a n i m m u n o h i s t o c h e m i c a l p r o c e d u r e . Th ep r e s e n c e o f t h e s e a d d u c t s w a s t h e n c o r r e l a t e dw i t h t h e g r a d e o f a c t i v i t y a n d t h e s t a g e o f f i b r o -s i s a s s e s s e d on t h e same b i o p s y . A s i r o no v e r l o a d h a s b e e n r e p o r t e d i n c h r o n i c h e p a t i t i sC , a n d a s t h i s m o l e c u l e i s a c o f a c t o r i n l i p i dp e r o x i d a t i o n , t h e p r e s e n c e o f t h e s e a l d e h y d ea d d u c t s w a s a l s o c o r r e l a t e d w i t h l i v e r i r o n8 2 0c o n c e n t r a t i o n .P a t i e n t s a n d m e th od sSTUDY GROUPF o r t y t h r e e p a t i e n t s w e r e s t u d i e d . A l l p a t i e n t sw e r e p o s i t i v e f o r a n t i b o d y t o h e p a t i t i s C v i r u sb y s e c o n d g e n e r a t i o n t e s t s . Serum v i r a l l o a d

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P a r a d i s , M a t h u r i n , K o l l i n g e r , I m b e r t - B i s m u t , C h a r l o t t e , P i t o n , e t a l

w a s q u a n t i f i e d b y b r a n c h e d DNA ( s e c o n dg e n e r a t i o n bDNA A m p l e x C h i r o n , C h i r o n ,E m e r y v i l l e , C a l i f o r n i a , USA) i n 3 3 p a t i e n t s .G e n o t y p e d e t e r m i n a t i o n w a s c a r r i e d o u t b y ac o m p e t i t i v e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m i n g -p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n p r o c e d u r e i n 3 2p a t i e n t s . 2 ' A l l p a t i e n t s w e r e h e p a t i t i s B v i r u sn e g a t i v e a n d h a d n o t r e c e i v e d a n y a n t i v i r a lt h e r a p y a t l e a s t s i x m o n t h s b e f o r e b i o p s y . A l c o -h o l c o n s u m p t i o n w a s r e c o r d e d i n 4 1 o f t h e 4 3p a t i e n t s . F i v e h i s t o l o g i c a l l y n o r m a l l i v e r s i np a t i e n t s w i t h o u t h e p a t i t i s C v i r u s i n f e c t i o nw e r e u s e d a s c o n t r o l s . T h e s e w e r e o b t a i n e df r o m s u r g i c a l r e s e c t i o n s p e r f o r m e d f o rt u m o u r s i n a n o t h e r w i s e n o r m a l l i v e r .LIVER B I O P S I E SL i v e r b i o p s y s p e c i m e n s w e r e o b t a i n e d f o r e a c hp a t i e n t u s i n g a p e r c u t a n e o u s p r o c e d u r e . Th el i v e r s a m p l e w a s f i x e d , p a r a f f i n wax e m b e d d e d ,a n d p r o c e s s e d f o r h i s t o l o g i c a l s t u d y a c c o r d i n gt o s t a n d a r d p r o c e d u r e s ( h a e m a t o x y l i n a n de o s i n , P e r l ' s b l u e , M a s s o n ' s t r i c h r o m e ) . S e r i a ls e c t i o n s w e r e p e r f o r m e d f o r t h e i m m u n o h i s t o -c h e m i c a l s t u d y . When e n o u g h t i s s u e w a s a v a i l -a b l e ( n = 2 1 ) , t h e l i v e r i r o n c o n c e n t r a t i o n w a sd e t e r m i n e d .L i v e r b i o p s i e s w e r e e x a m i n e d b y t w o p a -t h o l o g i s t s ( V P , P B ) i n a s i m u l t a n e o u s r e a d i n g .T h e y w e r e b l i n d t o t h e r e s u l t s o f l i p i dp e r o x i d a t i o n i m m u n o s t a i n i n g . F o r e a c h l i v e rb i o p s y , t h e s e m i q u a n t i t a t i v e a s s e s s m e n t o fg r a d e o f a c t i v i t y a n d s t a g e o f f i b r o s i s a c c o r d i n gt o M e t a v i r w a s r e c o r d e d . 2 2 Th e a c t i v i t y o fc h r o n i c h e p a t i t i s w a s g r a d e d a s f o l l o w s : A O , noh i s t o l o g i c a l a c t i v i t y ; A l , m i n i m a l a c t i v i t y ; A 2 ,m o d e r a t e a c t i v i t y ; A 3 , s e v e r e a c t i v i t y . Th ed e g r e e o f d i s e a s e a c t i v i t y w a s d e f i n e d b y t h ei n t e g r a t e d a s s e s s m e n t o f t h e m a j o r n e c r o i n -f l a m m a t o r y l e s i o n s a c c o r d i n g t o a n a l g o r i t h mp r e v i o u s l y d e s c r i b e d . 2 3 T h i s g r a d i n g i s b a s e do n t h e s e m i q u a n t i t a t i v e a s s e s s m e n t o f p i e c e -m e a l n e c r o s i s ( 0 , a b s e n t ; 1 , m i l d ; 2 , m o d e r a t e ;3 , s e v e r e ) a n d l o b u l a r n e c r o s i s ( 0 , a b s e n t o rm i l d ; 1 , m o d e r a t e ; 2 , s e v e r e ) . F i b r o s i s w a sd e f i n e d a s f o l l o w s : F O , no f i b r o s i s ; F l , p o r t a lf i b r o s i s w i t h o u t s e p t a ; F 2 , p o r t a l f i b r o s i s w i t hr a r e s e p t a ; F 3 , n u m e r o u s s e p t a w i t h o u t c i r r h o -s i s ; F 4 , c i r r h o s i s .IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDYA n t i b o d i e sP o l y v a l e n t m o n o s p e c i f i c a n t i s e r a w e r e g e n e r -a t e d b y i m m u n i s i n g W a t a n a b e h e r i t a b l e h y p e r -l i p i d a e m i c r a b b i t s w i t h h o m o l o g o u s l o w d e n -s i t y l i p o p r o t e i n ( L D L ) w h i c h h a d b e e nm o d i f i e d i n v i t r o w i t h e i t h e r HNE o r M D A .LDL ( 1 . 0 2 0 - 1 . 0 5 7 g / m l ) w a s p r e p a r e d f r o m1 0 ml r a b b i t b l o o d p l a s m a b y s e q u e n t i a l u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n b y u s i n g 2 . 7 mMEDTA, 2 mMb e n z a m i d i n e , 1 p s M D - p h e n y l a l a n y l - L - p r o p y l -L - a r g i n i n e c h l o r o m e t h y l k e t o n e , 0 . 0 1 % a p r o -t i n i n , 5 0 , u g / m l c h l o r a m p h e n i c o l , a n d 1 0 0 j g / m lg e n t a m i c i n t o c o u n t e r a c t p r o t e o l y s i s . L D L w a sd i a l y s e d a g a i n s t p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e( P B S ) c o n t a i n i n g 0 . 1 m M E D T A , 1 m M p h e n y l -m e t h y l s u l p h o n y l f l u o r i d e , a n d a n t i b i o t i c s .HNE w a s g e n e r a t e d b y a c i d h y d r o l y s i s o fh y d r o x y n o n e n a l d i e t h y l a c e t a l f o r o n e h o u r a t

3 7 0 C . T e n m i l l i g r a m s o f p u r i f i e d LDL w e r ei n c u b a t e d w i t h 2 0 mM ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n )NaCNBH3, 2 0 mM EDTA, a n d 4 mMHNEi n P B S , p H 8 . 5 f o r 2 4 h o u r s a t room t e m p e r a -t u r e . A f t e r f o r m a t i o n o f HNE-LDL a d d u c t s ,e x c e s s r e a g e n t s w e r e r e m o v e d b y e x t e n s i v ed i a l y s i s a g a i n s t P B S . Th e e x t e n t o f c o n j ug a t i o no f l y s i n e r e s i d u e s w a s 3 4 % , a s e s t i m a t e d b y t h et r i n i t r o b e n z e n e s u l p h o n i c a c i d a s s a y . 2 4MDA w a s g e n e r a t e d b y a c i d h y d r o l y s i s o fM D A - b i s - d i m e t h y l a c e t a l ( S e r v a , H e i d e l b e r g ,G e r m a n y ) . M D A - b i s - d i m e t h y l a c e t a l ( 8 8 0 [ t l )w a s i n c u b a t e d w i t h 1 2 0 g l o f 4 N HCI a n d 4 m ld i s t i l l e d w a t e r f o r 3 0 m i n u t e s a t 3 7 0 C a n dt i t r a t e d t o p H 7 . 6 . T e n m i l l i g r a m s o f p u r i f i e dLDL i n PBS w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 0 0 g l o f0 . 5 MMDA p H 8 . 5 f o r t h r e e h o u r s a t roomt e m p e r a t u r e . A f t e r f o r m a t i o n o f MDA-LDLa d d u c t s e x c e s s r e a g e n t s w e r e r e m o v e d b ye x t e n s i v e d i a l y s i s a g a i n s t PBS b u f f e r . Th ee x t e n t o f c o n j u g a t i o n o f l y s i n e r e s i d u e s w a s7 8 % , a s e s t i m a t e d b y t h e t r i n i t r o b e n z e n es u l p h o n i c a c i d a s s a y . 2 4P r i m a r y i m m u n i s a t i o n o f W a t a n a b e h e r i t -a b l e h y p e r l i p i d a e m i c r a b b i t s c o n s i s t e d o f i n t r a -d e r m a l i n j e c t i o n s o f 2 0 0 , u g o f a n t i g e n i n 5 0 0 , u lPBS s u s p e n d e d w i t h 5 0 0 g l F r e u n d ' s c o m p l e t ea d j u v a n t . F o r b o o s t e r i n j e c t i o n s , 1 5 0 g g o fa n t i g e n w e r e a d m i n i s t e r e d i n F r e u n d ' s i n c o m -p l e t e a d j u v a n t s u b c u t a n e o u s l y a f t e r t w o a n df o u r w e e k s . S i x w e e k s a f t e r t h e f i r s t i m m u n i s a -t i o n , b l o o d s e r u m w a s c o l l e c t e d . Th e s p e c i f i c i t yo f a n t i b o d y w a s t e s t e d b y W e s t e r n b l o t t i n gu s i n g HNE o r MDA m o d i f i e d a n d u n m o d i f i e dp r o t e i n s . Th e a n t i b o d i e s w e r e s p e c i f i c f o r HNEo r MDA m o d i f i e d e p i t o p e s ( a d d u c t s ) .I m m u n o h i s t o c h e m i c a l p r o c e d u r eTh e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l p r o c e d u r e w a s p e r -f o r m e d o n s e r i a l p a r a f f i n wax e m b e d d e ds e c t i o n s u s i n g a n a u t o m a t e d i m m u n o s t a i n e r( T e c h m a t e 5 0 0 , D a k o , C a r p i n t e r i a , C a l i f o r n i a ,USA) w i t h t h e a v i d i n e - b i o t i n - p e r o x i d a s em e t h o d . F o r i m m u n o h i s t o c h e m i c a l d e t e c t i o no f MDA m o d i f i e d e p i t o p e s , s l i d e s w e r e p r o n a s et r e a t e d ( 0 . 0 1 % i n T r i s N a C l , 2 5 m i n u t e s )b e f o r e i m m u n o s t a i n i n g . A l l p r i m a r y a n t i b o d i e sw e r e u s e d a t a 1 : 1 0 0 d i l u t i o n .L o c a l i s a t i o n a n d i n t e n s i t y o f s t a i n i n g w e r ea s s e s s e d b y t h e t w o p a t h o l o g i s t s i n a s i m u l t a n e -o u s r e a d i n g , b l i n d t o t h e r e s u l t s o f g r a d i n g a n ds t a g i n g . Th e i n t e n s i t y o f t h e s t a i n i n g ( M D A o rHNE i n d e x ) w a s g r a d e d f r o m 0 t o 3 : 0 , n os t a i n i n g ; 1 , m i l d ( p u n c t u a t e d l a b e l l i n g ) ; 2 ,m o d e r a t e ( d e n s e l a b e l l i n g i n f e w c e l l s o r i n f e we x t r a c e l l u l a r f o c i ) ; 3 , s t r o n g ( d e n s e a n d homo-g e n e o u s l a b e l l i n g i n many c e l l s o r d i f f u s ee x t r a c e l l u l a r s t a i n i n g ) . T h i s e v a l u a t i o n c o n -c e r n e d t h e mean i n t e n s i t y o f t h e s i g n a l on t h ew h o l e s l i d e . A g l o b a l l i p i d p e r o x i d a t i o n i n d e xw a s d e f i n e d b y a d d i n g t h e v a l u e s o f MDA a n dHNE i n d e x e s .N e g a t i v e c o n t r o l s w e r e n o r m a l s h e e p serumo r PBS i n s t e a d o f p r i m a r y a n t i b o d i e s . P o s i t i v ec o n t r o l s f o r l i p i d p e r o x i d a t i o n d e t e c t i o n w e r ef i x e d , p a r a f f i n wax e m b e d d e d r a t l i v e r s a m p l e sf r o m a c u t e h e p a t i t i s i n d u c e d b y C C l 4 . T h e s el i v e r s a m p l e s w e r e r e m o v e d 4 8 h o u r s a f t e r a ni n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f 1 0 0 g l / 1 0 0 g b o d yw e i g h t o f C C l 4 i n m a l e W i s t a r r a t s . I n t h i s

4 0 2



3/7

L i p i d p e r o x i d a t i o n i n c h r o n i c h e p a t i t i s C

m o d e l , s u b s t a n t i a l n e c r o s i s o f c e n t r i l o b u l a ra r e a s w a s p r e s e n t 4 8 h o u r s a f t e r C C I 4 i n j e c t i o n ,a n d i t h a s b e e n s h o w n p r e v i o u s l y t h a t l i p i dp e r o x i d a t i o n i s t h e m a j o r f a c t o r r e s p o n s i b l e f o rl i v e r n e c r o s i s . 2 5LIVER IRON CONCENTRATIONL i v e r i r o n c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d i nd e p a r a f f i n i s e d l i v e r b i o p s i e s f r o m 2 1 p a t i e n t su s i n g t h e c o l o r i m e t r i c a s s a y o f B a r r y a n dS h e r l o c k . 2 6 R e s u l t s w e r e e x p r e s s e d i n g m o l / g o fd r y w e i g h t ( d r y w e i g h t > 0 . 6 0 m g f o r c o r r e c tc h e m i c a l i r o n d e t e r m i n a t i o n ) . Th e n o r m a lr a n g e ( 1 . 2 - 1 9 . 5 ) w a s d e t e r m i n e d i n 1 4 7p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s C w i t h o u t i r o no v e r l o a d u s i n g P e r l ' s s t a i n i n g m e t h o d .STATISTICAL ANALYSISQ u a n t i t a t i v e d a t a a r e p r e s e n t e d a s mean ( S D ) .C o r r e l a t i o n s b e t w e e n d a t a w e r e p e r f o r m e du s i n g S p e a r m a n a n d P e a r s o n ' s t e s t s .R e s u l t sS T U D Y GROUPTh e s t u d y g r o u p c o n s i s t e d o f 1 7 women a n d2 6 m e n , mean a g e 4 8 y e a r s ( r a n g e 2 8 - 7 4 ) ; 2 9p a t i e n t s d e n i e d a n y a l c o h o l c o n s u m p t i o n .E l e v e n p a t i e n t s w e r e g e n o t y p e l b , f i v e w e r eg e n o t y p e l a , t h r e e w e r e g e n o t y p e 2 a , s e v e nw e r e g e n o t y p e 3 a , f o u r w e r e g e n o t y p e 4 , t w ow e r e g e n o t y p e l a + l b , a n d o n e c o u l d n o t b ed e t e r m i n e d . T w e n t y n i n e o f t h e 3 3 p a t i e n t sw e r e h e p a t i t i s C v i r u s RNA p o s i t i v e .M e t a v i r f i b r o s i s g r a d i n g w a s a s f o l l o w s : F O ,o n e p a t i e n t ; F l , 1 8 p a t i e n t s ; F 2 , 1 4 p a t i e n t s ;F 3 , e i g h t p a t i e n t s ; F 4 , t w o p a t i e n t s . S i x p a t i e n t sh a d n o a c t i v i t y ( A G ) , 1 5 h a d m i l d a c t i v i t y ( A l ) ,1 1 h a d m o d e r a t e a c t i v i t y ( A 2 ) , a n d 1 1 h a ds e v e r e a c t i v i t y ( A 3 ) .Th e mean l i v e r i r o n c o n c e n t r a t i o n d e t e r -m i n e d i n 2 1 p a t i e n t s w a s 1 5 . 1 ( 1 4 . 5 ) g m o l / g( r a n g e 4 - 7 1 ) .IMMUNOHISTOCHEMICAL S T U D YI n r a t l i v e r s a m p l e s w i t h C C 1 4 i n d u c e d d a m a g e ,i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d y d e t e c t e d s t r o n gs t a i n i n g i n a r e a s o f c e n t r i l o b u l a r n e c r o s i s b o t hw i t h a n t i - H N E a n d a n t i - M D A a n t i b o d i e s ( d a t an o t s h o w n ) . No s t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n p o r t a lt r a c t s a n d p e r i p o r t a l a r e a s . I n c o n t r o l e x p e r i -m e n t s , w h e r e non-immune s e r u m w a s u s e di n s t e a d o f a n t i - a d d u c t a n t i b o d y , n o s t a i n i n gw a s o b s e r v e d .MDA o r HNE a d d u c t s o r b o t h w e r ed e t e c t e d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l y i n 3 5 o f 4 3p a t i e n t s ( 8 1 % ) . MDA a d d u c t s w e r e d e t e c t e d i n3 3 o f t h e 4 3 p a t i e n t s ( 7 7 % ) . S t a i n i n g w a sg r a d e d m i l d i n 2 3 c a s e s , m o d e r a t e i n n i n ec a s e s , a n d s t r o n g i n o n e c a s e . I m m u n o s t a i n i n gw a s o b s e r v e d b o t h i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i xa n d s i n u s o i d a l c e l l s . When s t a i n i n g w a s m i l d , i tw a s r e s t r i c t e d t o t h e p e r i p o r t a l a r e a s ( f i g 1 A ) .I n c a s e s o f m o d e r a t e o r s t r o n g s t a i n i n g , a mored i f f u s e p o r t a l l a b e l l i n g w a s o b s e r v e d , d i s p l a y -i n g a t h i n e x t r a c e l l u l a r n e t w o r k ( f i g 1 B ) . I nt h e s e c a s e s , p a t c h e s o f l o b u l a r s t a i n i n g w e r ea l s o p r e s e n t , l o c a l i s e d i n t h e s i n u s o i d a l c e l l s i nc o n t a c t w i t h l o b u l a r n e c r o s i s f o c i ( f i g 1 C ) . Nos t a i n i n g w a s o b s e r v e d i n h e p a t o c y t e s .

HNE a d d u c t s w e r e d e t e c t e d i n 1 3 o f t h e 4 3c a s e s ( 3 0 % ) . T e n o f t h e 1 3 c a s e s ( 7 7 % ) t h a td i s p l a y e d HNE a d d u c t s a l s o s h o w e d MDAa d d u c t s . The s t a i n i n g w a s m i l d i n 1 2 c a s e s a n dm o d e r a t e i n o n e c a s e . I t w a s m a i n l y i n t r a c e l l u -l a r a n d a p p e a r e d i n t h e f o r m o f s m a l l g r a n u l e so r v e s i c l e s i n t h e c y t o p l a s m o f h e p a t o c y t e s ( f i g1 D ) . No s p e c i f i c t o p o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o n o fl a b e l l i n g w a s o b s e r v e d a n d i m m u n o s t a i n i n gw a s n o t c o - l o c a l i s e d w i t h l o b u l a r o r p e r i p o r t a ln e c r o s i s .Th e f i v e h i s t o l o g i c a l l y n o r m a l l i v e r s o fc o n t r o l p a t i e n t s s h o w e d no l a b e l l i n g w i t h a n t i -HNE a n t i b o d y . M i l d e x t r a c e l l u l a r s t a i n i n g w a so b s e r v e d i n p o r t a l t r a c t s w i t h a n t i - M D Aa n t i b o d y .CORRELATION BETWEEN LIPID PEROXIDATION ANDBIOLOGICAL AND HISTOLOGICAL DATAT h e r e w a s a s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h ep r e s e n c e a n d t h e i n t e n s i t y o f MDA a d d u c t s i nt h e l i v e r a n d b o t h t h e g r a d e o f a c t i v i t y( p < 0 . 0 1 ) a n d t h e s t a g e o f f i b r o s i s( p < 0 . 0 0 1 ) . No c o r r e l a t i o n w a s o b s e r v e db e t w e e n t h e HNE i n d e x a n d t h e g r a d e o fa c t i v i t y o r t h e s t a g e o f f i b r o s i s . Th e l i p i dp e r o x i d a t i o n i n d e x w a s s i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e do n l y w i t h t h e s t a g e o f f i b r o s i s ( p < 0 . 0 1 ) . Th ev a l u e s o f M DA, HNE, a n d l i p i d p e r o x i d a t i o ni n d e x e s a c c o r d i n g t o t h e g r a d e o f a c t i v i t y o r t h es t a g e o f f i b r o s i s a r e r e p o r t e d i n t a b l e 1 .MDA a n d HNE i n d e x e s w e r e n o t s i g n i f i -c a n t l y d i f f e r e n t i n t h e g r o u p o f p a t i e n t s w i t hg e n o t y p e l b v e r s u s p a t i e n t s w i t h o t h e r g e n o -t y p e s ( M D A 0 . 9 2 ( 0 . 9 ) v 1 . 1 5 ( 0 . 5 6 ) ; HNE0 . 2 3 ( 0 . 5 7 ) v 0 . 3 7 ( 0 . 4 9 ) ) . T h e r e was noc o r r e l a t i o n b e t w e e n MDA, HNE, o r l i p i d p e r -o x i d a t i o n i n d e x e s a n d a g e o r s e x o f t h e p a t i e n t s .A l t h o u g h l i p i d p e r o x i d a t i o n , MDA, a n d HNEi n d e x e s w e r e h i g h e r i n a l c o h o l c o n s u m e r s t h a ni n a b s t i n e n t p a t i e n t s , t h e s e d i f f e r e n c e s w e r e n o ts t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t ( l i p i d p e r o x i d a t i o n 1 . 7 5( 1 . 2 9 ) v 1 . 1 4 ( 0 . 8 8 ) ; MDA 1 . 2 5 ( 0 . 8 7 ) v 0 . 9 0( 0 . 6 7 ) ; HNE 0 . 5 0 ( 0 . 6 7 ) v 0 . 2 8 ( 0 . 4 5 ) ) .A l t h o u g h n o t s i g n i f i c a n t , t h e r e w a s a t e n -d e n c y t o c o r r e l a t i o n b e t w e e n MDA i n d e x a n dl i v e r i r o n c o n c e n t r a t i o n ( p = 0 . 0 9 ) . Th e l i v e ri r o n c o n c e n t r a t i o n w a s 1 0 . 6 ( 3 . 2 ) g m o l / g i n t h e1 4 p a t i e n t s w i t h a n MDA i n d e x o f 0 o r 1 , a n d1 7 . 4 ( 1 7 . 5 ) g m o l / g i n t h e s e v e n p a t i e n t s w i t ha n MDA i n d e x o f 2 . T h e r e w a s no c o r r e l a t i o nb e t w e e n HNE i n d e x a n d l i v e r i r o n c o n c e n t r a -t i o n ( 1 4 . 6 ( 7 . 6 ) , m o l / g i n p a t i e n t s w i t h a nHNE i n d e x o f 0 c o m p a r e d w i t h 1 5 . 9( 2 2 . 4 ) j i m o l / g i n p a t i e n t s w i t h a n HNE i n d e x> 0 ) . No c o r r e l a t i o n w a s o b s e r v e d b e t w e e nl i p i d p e r o x i d a t i o n i n d e x a n d l i v e r i r o n c o n c e n -t r a t i o n ( 1 4 . 2 ( 8 . 9 ) p m o l / g i n p a t i e n t s w i t h al i p i d p e r o x i d a t i o n i n d e x o f 0 o r 1 c o m p a r e dw i t h 1 6 . 1 ( 1 9 . 5 ) F t m o l / g i n p a t i e n t s w i t h a l i p i dp e r o x i d a t i o n i n d e x > 1 ) . F u r t h e r m o r e , l i v e ri r o n c o n c e n t r a t i o n w a s c o r r e l a t e d n e i t h e r w i t ht h e g r a d e o f a c t i v i t y n o r t h e s t a g e o f f i b r o s i s .D i s c u s s i o nL i p i d p e r o x i d a t i o n , a f r e e r a d i c a l i n d u c e dm e c h a n i s m , i s i m p l i c a t e d i n t h e p a t h o g e n e s i so f s e v e r a l a c u t e a n d c h r o n i c human d i s o r d e r s ,i n c l u d i n g l i v e r p a t h o l o g y . 6 . 8 2 7 Th e d e l e t e r i o u sc o n s e q u e n c e s o f t h i s m e c h a n i s m a r e r e l a t e d i n

4 0 3



4/7

P a r a d i s , M a t h u r i n , K o l l i n g e r , I m b e r t - B i s m u t , C h a r l o t t e , P i t o n , e t a l

V ** : 4

A ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~* W *-~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~.

F i g u r e 1 I m m u n o h i s t o c h e m i c a l d e t e c t i o n o f m a l o n d i a l d e h y d e (MDA) a n d 4 - h y d r o x y n o n e n a l ( H N E ) i n c h r o n i c h e p a t i t i sC . ( A ) I m m u n o s t a i n i n g o f MDA a d d u c t s i n c h r o n i c h e p a t i t i s C w i t h m i l d a c t i v i t y ( A l ) a n d p o r t a l f i b r o s i s ( E l ) . Am o d e r a t e MDA a d d u c t i m m u n o s t a i n i n g ( g r a d e 2 ) i s o b s e r v e d i n t h e p e r i p o r t a l e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( a r r o w ) . T h e c e n t r e o ft h e p o r t a l t r a c t i s n o t l a b e l l e d ( m a g n i f i c a t i o n x 2 5 ) . ( B ) I m m u n o s t a i n i n g o f MDA a d d u c t s i n c h r o n i c h e p a t i t i s C w i t hs e v e r e a c t i v i t y ( A 3 ) . A s t r o n g MDA a d d u c t i m m u n o s t a i n i n g ( g r a d e 3 ) i s d e t e c t e d i n p e r i p o r t a l a r - e a s b o t h i n t h ee x t r a c e l l u l a r m a t r i x a n d i n s i n u s o i d a l c e l l s ( a r r o w ) ( m a g n i f i c a t i o n x l O O 0 ) . ( C ) I m m u n o s t a i n i n g o f MDA a d d u c t s i nc h r o n i c h e p a t i t i s C w i t h l o b u l a r n e c r o s i s . MDA a d d u c t s a r e o b s e r v e d i n s i n u s o i d a l c e l l s l o c a t e d i n an a r e a o f l o b u l a r n e c r o s i s( m i l d s t a i n i n g , g r a d e 1 ) ( m a g n i f i c a t i o n x 2 0 0 ) . ( D ) I m m u n o s t a i n i n g o f HNE a d d u c t s i n c h r o n i c h e p a t i t i s C . A m i l di n t r a c e l l u l a r HNE a d d u c t i m m u n o s t a i n i n g ( g r a d e 1 ) i s d e t e c t e d i n t h e c y t o p l a s m o f a f e w h e p a t o c y t e s i n t h e f o r m o f e i t h e rs m a l l g r a n u l e s c l o s e t o s t e a t o s i s v a c u o l e s o r i n t r a c y t o p l a s m i c v e s i c l e s ( m a g n i f i c a t i o n x 4 0 0 ) .p a r t t o t h e f o r m a t i o n o f a l d e h y d e p r o d u c t ss u c h a s MDA a n d HNE t h a t b i n d t o v a r i o u sm o l e c u l e s , i m p a i r i n g t h e i r f u n c t i o n s . ' 4We i n v e s t i g a t e d t h e p r e s e n c e o f MDA a n d

HNE a d d u c t s i n l i v e r s a m p l e s f r o m p a t i e n t sw i t h c h r o n i c h e p a t i t i s C v i r u s i n f e c t i o n b y a ni m m u n o h i s t o c h e m i c a l p r o c e d u r e . U s i n g t h i st e c h n i q u e , we d e t e c t e d a t l e a s t o n e m a r k e r o f

4 0 4

A

. A I A . . , 0 .. ' A .4.'., 1 . I1* 1 .41 .



5/7

L i p i d p e r o x i d a t i o n i n c h r o n i c h e p a t i t i s C

T a b l e 1 M a l o n d i a l d e h y d e (MDA), 4 - h y d r o x y n o n e n a l( H N E ) , a n d l i p i d p e r o x i d a t i o n i n d e x e s i n p a t i e n t s w i t hc h r o n i c h e p a t i t i s C a c c o r d i n g t o t h e g r a d e o f a c t i v i t y ( A )a n d t h e s t a g e o f f i b r o s i s ( F ) 2 2L i p i dp e r o x i d a t i o nMDA i n d e x HNE i n d e x i n d e x

A c t i v i t yAO orAl ( n = 2 1 ) 0 . 7 6 ( 0 . 6 2 ) 0 . 1 9 ( 0 . 4 ) 0 . 9 5 ( 0 . 4 )A2 ( n = 1 1 ) 1 . 0 0 ( 0 . 8 8 ) 0 . 5 5 ( 0 . 5 ) 1 . 0 3 ( 1 )A3 ( n = 1 1 ) 1 . 5 5 ( 0 . 5 2 ) 0 . 3 6 ( 0 . 6 7 ) 1 . 0 4 ( 1 )p * < 0 . 0 1 NS NSF i b r o s i sFO o r F l ( n = 1 9 ) 0 . 6 5 ( 0 . 6 7 ) 0 . 3 1 ( 0 . 4 8 ) 1 . 0 ( 1 . 0 3 )F 2 ( n = 1 4 ) 1 . 0 7 ( 0 . 5 3 ) 0 . 3 6 ( 0 . 6 3 ) 1 . 5 ( 0 . 9 4 )F 3 o r F4 ( n = 1 0 ) 1 . 6 7 ( 0 . 4 5 ) 0 . 3 0 ( 0 . 4 8 ) 1 . 8 ( 0 . 9 4 )p * < 0 . 0 0 1 NS < 0 . 0 1V a l u e s a r e mean ( S D ) . * S p e a r m a n a n d P e a r s o n ' s t e s t s .

l i p i d p e r o x i d a t i o n i n 81% o f p a t i e n t s i n f e c t e db y h e p a t i t i s C v i r u s . These r e s u l t s are c o n c o r d -ant w i t h p r e v i o u s s t u d i e s p e r f o r m e d on b l o o dor t i s s u e e x t r a c t s , a n d s u g g e s t t h a t l i p i d p e r o x i -d a t i o n occurs i n c h r o n i c h e p a t i t i s C . 8 1 7 U s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , we were a l s o a b l e t oe l u c i d a t e t h e t i s s u l a r a n d c e l l u l a r l o c a l i s a t i o n o ft h e s e a l d e h y d e p r o d u c t s i n r e l a t i o n t o p a t h o -l o g i c a l f e a t u r e s .

T h i s p r o c e d u r e r e v e a l e d t h a t MDA a d d u c t sar e t h e m a j o r d e t e c t a b l e a l d e h y d e a d d u c t s i nt h e l i v e r , and t h e i n t e n s i t y o f s t a i n i n g i s corre-l a t e d w i t h t h e s e v e r i t y o f c h r o n i c h e p a t i t i s .A l t h o u g h MDA and HNE are b o t h p r o d u c t s o fl i p i d p e r o x i d a t i o n , we o b s e r v e d t h a t , f o r a g i v e nc a s e , t h e i n t e n s i t y and l o c a l i s a t i o n o f MDA andHNE a d d u c t s were d i f f e r e n t . I t i s o f note t h a tp r o d u c t i o n o f l i p i d p e r o x i d a t i o n b y p r o d u c t sd o e s not i m p l y t h e i r i n s i t u i m m u n o h i s t o -c h e m i c a l d e t e c t i o n . I n f a c t , we u s e d a n t i b o d i e st h a t d e t e c t o n l y MDA or HNE a d d u c t s b u t notf r e e HNE and MDA. I n o r d e r t o b e d e t e c t e d ,t h e s e p r o d u c t s h a v e t o b e i m m o b i l i s e d onto t h et i s s u e b y b i n d i n g t o i n t r a c e l l u l a r or e x t r a c e l l u -l a r m o l e c u l e s , a mechanism w h i c h d i f f e r sa c c o r d i n g t o t h e nature o f t h e l i p i d p e r o x i d a -t i o n b y p r o d u c t s . MDA i s a d i a l d e h y d e o f s h o r th a l f l i f e t h a t r e a c t s p r e f e r e n t i a l l y w i t h aminogroups o f p r o t e i n s , i n d u c i n g t h e f o r m a t i o n o fi n t e r m o l e c u l a r a n d i n t r a m o l e c u l a r b r i d g i n g . I nc o n t r a s t , HNE r e a c t s w i t h t h i o l g r o u p s " 4 andh a s a r e l a t i v e l y l o n g h a l f l i f e . Th e d i f f e r e n ti m m u n o s t a i n i n g p a t t e r n s o b s e r v e d b e t w e e nMDA and HNE r e f l e c t b o t h t h e i r d i f f e r e n tb i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s and t h e i r d i f f e r e n t h a l fl i v e s .The c o r r e l a t i o n b e t w e e n MDA i n d e x andt h e g r a d e o f a c t i v i t y o f c h r o n i c h e p a t i t i ss u g g e s t s t h a t l i p i d p e r o x i d a t i o n i s i n v o l v e d i nt h e p a t h o g e n e s i s o f t h e n e c r o i n f l a m m a t o r yr e a c t i o n . H o w e v e r , w h e t h e r l i p i d p e r o x i d a t i o ni s t h e cause or t h e consequence o f t h e l i v e rdamage r e m a i n s t o b e e l u c i d a t e d . The pres-e n c e o f MDA a d d u c t s i n o c c a s i o n a l cases w i t hno or m i l d a c t i v i t y may s u g g e s t a c a u s a t i v emechanism.

I n v i t r o s t u d i e s h a v e shown t h a t l i p i d p e r o x i -d a t i o n p r o d u c t s s t i m u l a t e c o l l a g e n p r o d u c t i o nb y r e g u l a t i n g c o l l a g e n gene t r a n s c r i p t i o n i nf i b r o b l a s t s and h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s . 9 I n c h r o n i ch e p a t i t i s C v i r u s i n f e c t i o n , we o b s e r v e d as t r o n g a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e MDA i n d e x ort h e l i p i d p e r o x i d a t i o n i n d e x and t h e s t a g e o f

f i b r o s i s . F u r t h e r m o r e , MDA a d d u c t s w e r ep r e f e r e n t i a l l y d e t e c t e d i n s i n u s o i d a l c e l l s i nc l o s e c o n t a c t w i t h a r e a s o f a c t i v e f i b r o g e n e s i s .T h e s e d a t a s u g g e s t a c a u s a t i v e r e l a t i o n b e t w e e nl i p i d p e r o x i d a t i o n a n d l i v e r f i b r o s i s i n p a t i e n t sw i t h c h r o n i c h e p a t i t i s C v i r u s i n f e c t i o n .I n c h r o n i c h e p a t i t i s C , i r o n o v e r l o a d h a sb e e n n o t e d i n some s t u d i e s . 8 A l t h o u g h s l i g h t ,t h i s o v e r l o a d h a s b e e n e v o k e d a s a f a c t o r o fr e s i s t a n c e t o i n t e r f e r o n t h e r a p y . 2 8 2 9 T h i s i s o fi n t e r e s t a s i r o n e x e r t s i t s c y t o t o x i c e f f e c t st h r o u g h e n h a n c e d f o r m a t i o n o f f r e e r a d i c a l sa n d l i p i d p e r o x i d a t i o n s t i m u l a t i o n . A l t h o u g hwe o b s e r v e d a s l i g h t i n c r e a s e i n l i v e r i r o n c o n -c e n t r a t i o n i n o u r p a t i e n t s , a t e n d e n c y t o c o r r e -l a t i o n w a s n o t e d b e t w e e n l i v e r i r o n c o n c e n t r a -t i o n a n d t h e MDA i n d e x . I f t h e s e r e s u l t s a r ec o n f i r m e d i n a l a r g e r s a m p l e s o f p a t i e n t s , i tc o u l d b e p o s t u l a t e d t h a t e n h a n c e d l i p i dp e r o x i d a t i o n o b s e r v e d i n c h r o n i c h e p a t i t i s C i sl i n k e d i n p a r t t o i r o n o v e r l o a d .

I n c o n c l u s i o n , t h i s s t u d y s h o w s t h a t l i p i dp e r o x i d a t i o n p r o d u c t s c a n b e d e t e c t e d i n l i v e rb i o p s i e s o f p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s Cv i r u s i n f e c t i o n . T h e r e i s e x p e r i m e n t a l e v i d e n c es h o w i n g t h a t l i p i d p e r o x i d a t i o n c a n b e p r e -v e n t e d b y a d mi n i s t r a t i o n o f s c a v e n g e r s o f f r e er a d i c a l s o r a n t i o x i d a n t s . ' 5 I t h a s b e e n s h o w nt h a t l i p i d p e r o x i d a t i o n p r o d u c t s c a n s t i m u l a t ef i b r o g e n e s i s b y i n d u c i n g c o l l a g e n g e n e e x p r e s -s i o n t h i u s , d e t e c t i o n a n d p r e v e n t i o n o f l i p i dp e r o x i d a t i o n c o u l d b e o f m a j o r i n t e r e s t i n p r e -v e n t i n g f i b r o s i s a n d c i r r h o s i s i n t h i s d i s e a s e .T h i s s t u d y w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e A s s o c i a t i o n p o u rl a R e c h e r c h e c o n t r e l e C a n c e r a n d f r o m t h e D e u t s c h eF o r s c h u n g s G e m e i n s h a f t . H y d r o x y n e n a l d i e t h y l a c e t a l w a sk i n d l y p r o v i d e d b y H E s t e r b a u e r a n d G W a e g , U n i v e r s i t y o fG r a z , A u s t r i a .1 S o n i P , D u s h e i k o GM , H a r r i s o n T J , D h i l l o n A P . G e n e t i cd i v e r s i t y o f h e p a t i t i s C v i r u s : i m p l i c a t i o n s f o r p a t h o g e n e s i s ,t r e a t m e n t , a n d p r e v e n t i o n . L a n c e t 1 9 9 5 ; 3 4 5 : 5 6 2 - 6 .2 L a w Y - F , T a i D - I , Chu C - M , C h e n T - J . Th e d e v e l o p m e n t o fc i r r h o s i s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c t y p e B h e p a t i t i s : ap r o s p e c t i v e s t u d y . H e p a t o l o g y 1 9 8 8 ; 8 : 4 9 3 - 6 .3 C o o k s l e y WG, B r a d b e a r R A , R o b i n s o n W , H a r r i s o n M,H a l l i d a y J W , P o w e l l L W , e t a l . Th e p r o g n o s i s o f c h r o n i ca c t i v e h e p a t i t i s w i t h o u t c i r r h o s i s i n r e l a t i o n t o b r i d g i n gn e c r o s i s . H e p a t o l o g y 1 9 8 6 ; 6 : 3 4 5 - 8 .4 Z e r n MA, C z a j a M J , W e i n e r F R. Th e u s e o f m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n t e c h n i q u e s a s t o o l s t o e v a l u a t e h e p a t i c f i b r o -g e n e s i s . I n : R o j k i n d M, e d . C o n n e c t i v e t i s s u e i n h e a l t h a n dd i s e a s e . B o c a R a t o n : CR C P r e s s , 1 9 9 0 : 9 9 - 1 2 2 .5 Bachem M, M e y e r D , M e l c h i o r R , S e l l KM , G r e s s n e r AM .A c t i v a t i o n o f r a t l i v e r p e r i s i n u s o i d a l l i p o c y t e s b y t r a n s f o r m -

i n g g r o w t h f a c t o r s d e r i v e d f r o m m y o f i b r o b l a s t - l i k e c e l l s . Ap o t e n t i a l m e c h a n i s m o f s e l f p e r p e t u a t i o n i n l i v e r f i b r o g e n -e s i s . Y C l i n I n v e s t 1 9 9 2 ; 8 9 : 1 9 - 2 7 .6 F a r i n a t i F , C a r d i n R , De M a r i a N , L e c i s P E , D e l l a L i b e r aG , B u r r a P , e t a l . Z i n c , i r o n a n d p e r o x i d a t i o n i n l i v e r t i s s u e .B i o l T r a c e E l e m R e s 1 9 9 5 ; 4 7 : 1 9 3 - 9 .7 B r i t t o n R S , B a c o n B R . R o l e o f f r e e r a d i c a l s i n l i v e r d i s e a s e sa n d h e p a t i c f i b r o s i s . H e p a t o g a s t r o e n t e r o l o g y 1 9 9 4 ; 4 1 : 3 4 3 - 8 .8 F a r i n a t i F , C a r d i n R , De M a r i a N , D el l a L i b e r a G , M a r a f i nC , L e c i s E , e t a l . I r o n s t o r a g e , l i p i d p e r o x i d a t i o n a n dg l u t a t h i o n e t u r n o v e r i n c h r o n i c a n t i - H C V p o s i t i v e h e p a t i -t i s . Y H e p a t o l 1 9 9 5 ; 2 2 : 4 4 9 - 5 6 .9 P ar o l a M, P i n z a n i M, C a s i n i A , A l b a n o E , P o l i G ,G e n t i l i n i A , e t a l . S t i m u l a t i o n o f l i p i d p e r o x i d a t i o n o r4 - h y d r o x y n o n e n a l t r e a t m e n t i n c r e a s e s p r o c o l l a g e n a l ( I )g e n e e x p r e s s i o n i n human f a t - s t o r i n g c e l l s . B i o c h e m B i o p h y sR e s Comm 1 9 9 3 ; 1 9 4 : 1 0 4 4 - 5 0 .1 0 Kamimura S , G a a l K , B r i t t o n R S , B a c o n B R , T r i a d a f i l o -p o u l o s G , T s u k a m o t o H . I n c r e a s e d 4 - h y d r o x y n o n e n a l l e v -e l s i n e x p e r i m e n t a l a l c o h o l i c l i v e r d i s e a s e : a s s o c i a t i o n o fl i p i d p e r o x i d a t i o n w i t h l i v e r f i b r o g e n e s i s . H e p a t o l o g y 1 9 9 2 ;1 6 : 4 4 8 - 5 3 .1 1 C h o j k i e r M, H o u g l u m K , H e r r u z o J S , B r e n n e r DA. S t i m u -l a t i o n o f c o l l a g e n e x p r e s s i o n b y a s c o r b i c a c i d i n c u l t u r e dhuman f i b r o b l a s t s . J B i o l Chem 1 9 8 9 ; 2 6 4 : 1 6 9 5 7 - 6 2 .1 2 B e d o s s a P , H o u g l u m K , T r a u t w e i n C , H o l s t e g e A , A l c o r n J ,C h o j k i e r M. S t i m ul a t i o n o f c o l l a g e n a l ( I ) g e n e e x p r e s s i o n i sa s s o c i a t e d w i t h l i p i d p e r o x i d a t i o n i n h e p a t o c e l l u l a r i n j u r y : al i n k t o t i s s u e f i b r o s i s ? H e p a t o l o g y 1 9 9 4 ; 1 9 : 1 2 6 2 - 7 1 .1 3 C h e e s e m a n KH. M e c h a n i s m s a n d e f f e c t s o f l i p i d p e r o x i d a -t i o n . M o l e c A s p e c t s M e d 1 9 9 3 ; 1 4 : 1 9 1 - 7 .

4 0 5



6/7

P a r a d i s , M a t h u r i n , K o l l i n g e r , I m b e r t - B i s m u t , C h a r l o t t e , P i t o n , e t a l1 4 E s t e r b a u e r H , S c h a u r R J , Z o l l n e r H . C h e m i s t r y a n db i o c h e m i s t r y o f 4 - h y d r o x y n o n e n a l , m a l o n a l d e h y d e a n dr e l a t e d a l d e h y d e s . F r e e Ra d B i o l M ed 1 9 9 2 ; 1 1 : 8 1 - 1 2 8 .1 5 P o l i G , P a r o l a M , L e o n a r d u z z i G , P i n z a n i M. M o d u l a t i o n o fh e p a t i c f i b r o g e n e s i s b y a n t i o x i d a n t s . M o l e c A s p e c t s M e d1 9 9 3 ; 1 4 : 2 5 9 - 6 4 .1 6 J a n e r o DR. M a l o n d i a l d e h y d e a n d t h i o b a r b i t u r i c a c i d -r e a c t i v i t y as d i a g n o s t i c i n d i c e s o f l i p i d p e r o x i d a t i o n a n dp e r o x i d a t i v e t i s s u e i n j u r y . F r e e Ra d B i o l M e d 1 9 9 0 ; 9 : 5 1 5 -4 0 .1 7 F a r i n a t i F , C a r d i n R , D ' E r r i c o A , D e M a r i a N , N a c c a r a t o

R , C e c c h e t t o A , e t a l . H e p a t o c y t e p r o l i f e r a t i v e a c t i v i t y i nc h r o n i c l i v e r damage as a s s e s s e d b y t h e m o n o c l o n a la n t i b o d y MIBI Ki67 i n a r c h i v a l m a t e r i a l : t h e r o l e o f e t i o l -ogy, d i s e a s e a c t i v i t y , i r o n , a n d l i p i d p e r o x i d a t i o n . H e p a t o l -og y 1 9 9 6 ; 2 3 : 1 4 6 8 - 7 5 .1 8 U c h i d a K , S z w e d a L I , C h a e H - Z , S t a d t m a n E R . Immuno-c h e m i c a l d e t e c t i o n o f 4 - h y d r o x y n o n e n a l p r o t e i n a d d u c t s ino x i d i z e d h e p a t o c y te s . Pro c N a t l A c a d S c i US A 1 9 9 3 ; 9 0 :8 7 4 2 - 6 .1 9 P a l i n s k i W, Y l a - H e r t t u a l a a S , R o s e n f e l d M E, B u t l e r SW,S o c h e r S A , P a r t h a s a n t h y S , e t a l . A n t i s e r a an d m o n o c l o n a la n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r e p i t o p e s g e n e r a t e d d u r i n g o x i d a t i v em o d i f i c a t i o n o f l o w d e n s i t y p r o t e i n . A r t e r i o s c l e r o s i s 1 9 9 0 ;1 0 : 3 2 5 - 3 5 .2 0 O l y n y k J K , O ' N e i l l R , B r i t t o n R S , Bacon B R . D e t e r m i n a -t i o n o f h e p a t i c i r o n concentration i n f r e s h an d p a r a f f i n -embeddded t i s s u e : d i a g n o s t i c i m p l i c a t i o n s . G a s t r o e n t e r o l o g y1 9 9 4 ; 1 0 6 : 6 7 4 - 7 .

2 1 S a j u s M, O l i v i M, V i d a u d D , M a t h u r i n P , Opolon P ,P o y n a r d T , e t a l . A n a l y s i s o f HCV genotypes b y af l u o r e s c e n t c o m p e t i t i v e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m i n g PCR(COP-PCR) [ a b s t r a c t ] . H e p a t o l o g y 1 9 9 4 ; 2 0 : 2 4 4 a .2 2 Th e METAVIR c o o p e r a t i v e group. I n t e r - a n d i n t r a -o b s e r v e r v a r i a t i o n i n t h e assessment o f l i v e r b i o p s y o fc h r o n i c h e p a t i t i s C . H e p a t o l o g y 1 9 9 4 ; 2 0 : 1 5 - 2 0 .2 3 B e d o s s a P , P o y n a r d T f o r t h e METAVIR c o o p e r a t i v e s t u d ygroup. An a l g o r i t h m f o r t h e g r a d i ng o f a c t i v i t y in c h r o n i ch e p a t i t i s C . H e p a t o l o g y 1 9 9 6 ; 24 : 2 8 9 - 9 3 .2 4 Habeeb AFSA. D e t e r m i n a t i o n o f f r e e a m i n o groups i n pro-t e i n s b y t r i n i t r o b e n z e n e s u l f o n i c a c i d . A n a l B i o c h e n n 1 9 6 6 ;1 4 : 3 2 8 - 3 6 .2 5 R e c k n a g e l RO, G l e n d e E A , D o l a k J A . Mechanisms o fc a r b o n t e t r a c h l o r i d e t o x i c i t y . P h a r m a c o l T h e r a p y 1 9 8 7 ; 4 3 :1 3 9 - 5 4 .2 6 B a r r y M, S h e r l o c k S . M e a s u r e m e n t o f l i v e r iron concentra-t i o n i n n e e d l e - bi o p s y s p e c i m e n s . L a n c e t 1 9 7 1 ; i : 1 0 0 - 3 .2 7 P o l i G . L i v e r damage d u e t o f r e e r a d i c a l s . Br M e d B u l l 1 9 9 3 ;4 9 : 6 0 4 - 2 0 .2 8 H i g u e r a s V , R a y a A , R o d r i g o JM , S e r r a M A, Roma J ,Romero F J . I n t e r f e r o n d e c r e a s e s serum l i p i d p e r o x i d a t i o np r o d u c t s o f h e p a t i t i s C p a t i e n t s . F r e e Ra d B i o l M e d1 9 9 4 ; 1 6 : 1 3 1 - 3 .2 9 O l y n y k J K , D i B i s c e g l i e AM , J e f f e r s L J , P a r k e r T I , R a d i c kJ L , S c h i f f E R , e t a l . H e p a t i c i r o n c o n c e n t r a t i o n as a p r e d i c -t o r o f response t o i n t e r f e r o n a l f a t h e r a p y i n c h r o n i c h e p a t i -t i s C . G a s t r o e n t e r o l o g y , 1 9 9 5 ; 1 0 8 : 1 1 0 4 - 9 .

4 0 6



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doi: 10.1136/jcp.50.5.4011997 50: 401-406J Clin Pathol

V Paradis, P Mathurin, M Kollinger, et al.pathological features.chronic hepatitis C: correlation withIn situ detection of lipid peroxidation in

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