КЛИНИЧЕСКОЕ, БИОЛОГИЧЕСКОЕ И ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ УЛУЧШЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ «ИНДЕКСА ДРЯБЛОСТИ КОЖИ» И КОСМЕТОЛОГИЧЕСКИ-ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПЕРЕСТРОЙКИ ФИБРОБЛАСТОВ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ MÉCANO-STIMULATION.™

Mécano-Stimulation™ of the skin improves sagging score and induces beneficial functional modification of the fibroblasts: clinical, biological, and histological evaluations

Philippe Humbert,1,2 Ferial Fanian,1,2 Thomas Lihoreau,1,2 Adeline Jeudy,1,2 Ahmed Elkhyat,1,2 Sophie Robin,3 Carol Courderot-Masuyer,3 Hélène Tauzin,3 Christine Lafforgue,1,2,4 Marek Haftek5

1 Research and Studies Center on the Integument (CERT), Department of Dermatology, Clinical Investigation Center (CIC 1431), Besançon University Hospital; 2 INSERM UMR1098, FED4234 IBCT, University of Franche-Comté, Besançon, France; 3 SARL BIOEXIGENCE, Besançon, France; 4 Dermopharmacology and Cosmetology Unit, University of Paris Sud, France; 5 University of Lyon 1, EA4169, Experimental, clinical and therapeutic aspects of the skin barrier function, INSERM US7 – CNRS UMS3453, Lyon, France

Опубликовано: Clinical Interventions in Aging 2015:10

ВведениеПотеря механической упругости возникает, главным образом, из-за снижения выработки

коллагена, сопровождающего старение кожи. Многочисленные исследования in vitro показали влияние механического воздействия, оказываемого на кожу, на фибробласты, благодаря механотрансдукции - преобразованию механических сигналов в биохимические реакции.

Эти реакции выражаются в изменении экспрессии генов, не только кодирующих коллаген, эластин и другие компоненты межклеточного матрикса, но и матричных (внеклеточных) металлопротеиназ (ММП) и их тканевых ингибиторов (ТИМПП).

Новый прибор для проведения механической стимуляции кожи и подкожного слоя был изучен в простом слепом контролируемом и рандомизированном исследовании.

Материалы и методыТридцать пациентов (возраст от 35 до 50 лет) с клиническими признаками дряблости кожи были

случайном образом отобраны для проведения процедур на одной половине лица. После проведения 24 процедур Mécano-Stimulation™, с исследуемой части лица и контрольной были проведены биопсии. Проведено определение уровня гиалуроновой кислоты, эластина, коллагена 1 типа, ММП 9 и эквивалентной ретракции кожи. Кроме того, в 10 случаях проводилось исследование GlaSbox® и электронная микроскопия. Кроме того, до и по окончанию процедур проводились клиническое обследование и самооценка с помощью опросников.

РезультатыИсследование показало повышение уровня гиалуроновой кислоты, эластина, коллагена 1 типа и

МПП 9 наряду с повышением миграционной активности фибробластов в биоптатов с исследуемой половины лица. Электронная микроскопия показала выраженное ремоделирование кожи и повышение активности фибробластов. Значительное уменьшение клинических признаков старения кожи, и высокая удовлетворенность пациентов полученными результатами напрямую связано с уменьшения обвисания кожи области щек.

ЗаключениеMécano-Stimulation - это неинвазивная и безопасная процедура, заключающаяся в создании

микропульсаций различной частоты, которые могут значительно повысить метаболизм кожи.Результаты объективных исследований (электронная микроскопия и лабораторные анализы) подтверждают клинически заметный подтягивающий эффект.

Ключевые слова: омоложение кожи, дряблость кожи, механическая стимуляция, фибробластный синтез.

Вступление

Фибробласты - это основные клетки дермы. Они главные продуценты коллагена и эластичных волокон, гликопротеинов, протеогликанов и межклеточного матрикса. Они также отвечают за ремоделирование внеклеточного матрикса, вызывая его сокращение и обладают способностью к миграции.

Старение кожи характеризуется и функциональными, и структурными изменениями в дерме. С возрастом кожа истончается, становится сухой и менее эластичной. Дисфункция фибробластов - один из основных признаков старения кожи. Изменения в пролиферации, дифференциации и синтетической активности фибробластов приводят к структурным и функциональным изменениям кожи. Исследования фибробластов в морщинах показали, что значительные возрастные изменение механических свойств кожи обусловлены снижением сократительной способности, а также миграционной активности фибробластов1.

Л. Жаке (L. Jacquet) уже 1911 году обнаружил, что регулярное механическое воздействие способно противостоять возрастному снижению упругости кожи лица, шеи и верхней части грудной клетки2.

Относительно недавно было доказано, что фибробласты обладают молекулярными механизмами преобразовывать механическое воздействие в процессы ремоделирования соединительной ткани. Исследования In vitro показали, что фибробласты могут запустить целый каскад биохимических изменений в межклеточном матриксе3-5. Механические стимулы меняют фенотип фибробластов, приводя к активному синтезу соединительной ткани и подавлению разрушения межклеточного матрикса; у таких фибробластов отчетливо наблюдаются стресс-фибриллы и фокальные контакты6.

Механическое воздействие оказываемое на поверхность кожи служит сигналом для кератиноцитов, фибробластов и адипоцитов и вызывает синтез коллагена, эластина и запуск липолиза. Утрата механической упругости при старении кожи главным образом обусловлена снижением синтеза коллагена, кроме того, обнаружено снижение количества фокальных контактов фибробластов с фибриллами внеклеточного матрикса; порочный круг снижения синтеза проколлагена, деградации коллагеновых волокон приводит к дальнейшему снижению чувствительности фибробластов к механической стимуляции. Миофибробласты (активные фибробласты, содержащие гладкомышечный α-актин) активно участвуют в процессах образования рубца, клеточной миграции и подвижности в соединительной ткани7.

В эксперименте, фибробласты и коллагеновые волокна выстраиваются вдоль оси растяжения во время механического воздействия8.

Предыдущее исследование аппаратного механического воздействия на кожу и подкожный слой показало, что эта процедура приводит к возобновлению синтеза коллагена и эластина, а осуществляемые прибором микро-пульсации вызывают омоложение клеток подлежащих тканей9. Однако, исследование проводилось на коже верхней конечности и не ясно, можно ли подобных результатов ожидать от процедур на коже лица.

В данной работе, проводилась механическая стимуляция кожу лица (24 сеанса за 8 недель).Основана цель исследования - оценить клинический и визуальных эффект механо-стимуляции

кожи лица. Дополнительная цель - определить механизмы воздействия данный процедуры на клеточном уровне, измеряя сократительную активность фибробластов и анализируя вызванные ими изменения свойств кожи.

Материалы и методы

Это одноцентровое, двойное-слепое, контролируемое и рандомизированное исследование воздействия процедуры, известной как Mécano-Stimulation™.

ПациентыТридцать здоровых добровольцев (20 женщин и 10 мужчин) возраста 35-50 лет были отобраны

для исследования. Критериями включения были 1-4 фототип кожи по Фитцпатрику10 и слабое или средне-выраженное обвисание кожи (1-3 балла по шкале Эзуре и соавт.11).

Рисунок 1. Шкала обвисания кожи по Эзуре.

Примечание. Обвисание кожи лица оценивалось баллами от 1 до 5 в трех частях области щек: В - верхней, С - нижней, D - боковой.

Критериями исключения были солнечное или ультрафиолетовое облучение кожи в предшествующие 15 дней, различные кожные заболевания (например, розацеа), острые или хронические системные заболевания, применение местных или системных препаратов, способных повлиять на результаты исследования, и некоторые противопоказания к Mécano-Stimulation (герпес, витилиго, папуло-пустулезные акне). Все пациенты, в соответствии с Хельсинкской конвенцией, подписали информированное согласие на проведение исследования.

Протокол исследования был одобрен Комитетом по защите лиц (Comités de Protection des Personnes) и Национальным агентствов по безопасности лекарственных средств и продуктов для здоровья Франции (L’Agence nationale de sécurité du Médicament et des produits de santé).

ПроцедураПроцедуры проводились на одной (случайно выбранной) стороне лица (подбородок, носогубный

треугольник, щека, скуловая область, височная область, лобная область) в течение 15 минут, три раза в неделю на протяжении 8 недель (24 сеанса). Все сеансы проводились одним и тем же операционистом (для стандартизации). Процедуры проводились с помощью аппарата для

механической стимуляции (LPG Systems, Франция). Этот аппарат с помощью различных насадок-манипул преобразует массажные движения операциониста в механические стимулы.

В этом исследовании применялась насадка-манипула с двумя движущимися лопастями в камере, предназначенная для процедур на лице или иных небольших областях. Воздействие исключает различные защипывания или перекручивание кожи, но осуществляется одновременно и в горизонтальном и в вертикальном направлениях (рисунок 2).

Рисунок 2. Двойное воздействие.Примечание. Данная насадка-манипула, предназначенная для лица, осуществляет механо-стимуляцию с помощью двух подвижных лопастей, расположенных внутри камеры. В камере происходит подсасывание кожи и ее стимуляция за счет движения лопастей в горизонтальной и вертикальной плоскостях. Программные настройки позволяют выставлять различную интенсивность и скорость всасывания и движения лопастей.

Внутри манипулы расположен специальный двигатель, который заставляет лопасти вибрировать с определенной частотой, соответствующей подсасыванию кожи.

Различные настройки интенсивности и частоты подсасывания и движения лопастей могут быть изменены во время процедуры, в зависимости от индивидуальной чувствительности и особенностей кожи (инфильтрированная, истонченная или сморщенная кожа).

ИзмеренияОценка производилась до процедур (Т0), после 24 сеансов (Т1) и через 1 месяц после заверения

процедур (Т2). Пациенты обследовались в стандартных условиях (последнее умывание лица - вечером накануне обследования, без использования косметических средств или воды перед обследованием. Во время исследования, добровольцы обязались не изменять обычный уход за кожей, гигиенические привычки и косметические продукты, избегать пребывания на солнце и УФ-облучения, инвазивных манипуляций на коже лица и сообщать о приеме системных лекарственных препаратов. Все обследования и измерения проводились в стандартных условиях (температура 20-23 °C и влажность 40-50%) после нахождения в них в течение 20 минут.

Основным критерием исследования была клиническая оценка обвисания кожи по фотографической шкале. Дополнительным критерием - клиническая оценка гладкости кожи, глубины морщин, цвета и блеска кожи, и самооценка пациентом. Биопсии брались исследуемой и контрольной области лица у 19 пациентов, 9 на гистологическое исследование и 10 - на определение сократительной активности фибробластов in vitro.

Основные результатыОценки обвисания кожи производилась в Т0 и Т1, непосвящённым в исследование

дерматологом, по 6-балльной шкале Эзуре11 в трех областях лица - верхней области щеки и

Horizontal stimulationVertical stimulation

носогубной складке (В), нижней области щеки (С) и в боковой области щеки (D), как показано на рисунке 1.

Дополнительные результатыНепосвященный в исследование дерматолог оценил возрастные изменения кожи исследуемой и

контрольной стороны лица.1. Здоровье кожи. Клиническая оценка блеска кожи проводилась посредством визуальной

шкалы CLBT™, включающей 7 параметров. Так, 4 оттенка кожи (красно-розовый, бледно-розовый, оливковый и бежевый) от 10 до 10% лежат в основе финального результата трех параметров (прозрачность кожи, яркость, и степень светоотражения) по шкале от 0 до 1012.

2. Гладкость кожи оценивалась по параметрам, измеренным по аналоговой 9-балльной шкале.Суммировались показатели: неровность поверхности кожи, глубокие и мимические морщины/дефекты кожи, текстура кожи, наличие темных кругов под глазами, наличие папул или микроцист. Наименьшая сумма показывает наибольшую гладкость кожи и лучший внешний вид.

3. Цвет кожи. По 9-бальной шкале оценивались следующие параметры: неравномерность, наличие кругов под глазами, покраснения/розацеа, черных точек, папул/шрамов. Сумма параметров характеризует общую оценку цвета кожи.

СамооценкаДобровольцы заполняли опросники в Т0 (до процедур) и Т1 (после 24 сеансов), оценивая по 9-

бальной шкале следующие параметры: Мимические и глубокие морщины Неровность кожи Носогубные складки Эластичность Жесткость/мягкость Сияние Темные круги под глазами

Также добровольцы сравнивали эластичность, мягкость кожи, морщины и обвисание кожи до и после процедур. Им был предложено ответить на вопросы по удовлетворенности полученными результатами.

ФотографированиеКаждый визит проводилась фотосъемка в фронтальном и боковых ракурсах всего лица и нижней

его части, при естественном освещении, с закрытыми глазами. Использовался фотоаппарат Canon EOS Rebel XS с двумя вспышками расположенными на Faraghan Medical System (90° и 45°). Фотографии были выравнены по освещенности с использованием Gretag MacBeth Colour Checker Chart, и по позиционированию с использованием стереотаксической таблицы Eotech SA)

Исследования in vitroБыли произведены панч-биопсии участков кожи с исследуемой и контрольной сторон лица, у 9

добровольцев (4 мужчин и 5 женщин). Использовались панчеры диаметром 2 мм. Биоптаты были помещены в стерильную марлю, моченную солевым раствором и незамедлительно перенесены в чашки Петри. При Т=37°C в течение 30 минут, происходило прилипание образца к пластиковой поверхности чаши. Затем было добавлено 3 мл питательной среды Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) с добавлением 10% телячьей сыворотки, 40 мг/мл гентамицина и 2 мг/мл фунгизона. Инкубация при 37°C в среде с 5% CO2. Фибробласты была выделены после 3-4 недель инкубации путем обработки трипсин-ЭДТА. Питательная среда менялась два раза в неделю.

Миграционная способностьФибробласты, подвергнутые механо-стимуляции и интактные, переносились в трехмерный

гидратированный коллаген с помощью модифицированной техники Белла и соавт.13 для изучения их функциональной способности, измерением сжимания свободной поверхности.

Коллагеновые пластинки были получены смешиванием 6 частей 1,76 концентрата питательной среды, 3 частей раствора коллагена 1 типа (из крысиных хвостов) и 1 части суспензии фибробластов (8×105 cells/mL). Смесь была помещена в чашки Петри диаметром 6 см. полимеризация в гель происходила в течении 30 минут при 37°C. После чего была добавлена питательная смесь, которая менялась каждые 48 часов. Измерение диаметра пластинки производилось но на 10 день, для чего была использована метрическая шкала на прозрачном фоне. Измерение миграционной активности фибробластов позволяет увидеть возможную реорганизацию внеклеточного матрикса после механо-стимуляции.

Измерение сократительной активности фибробластов с использованием GlaSbox®Прибор состоит из восьми квадратных ячеек, в которых размещены пластинки, по краям

которых крепятся силиконовые ребра с датчиками натяжения. Расстояние между ребрами - 27 мм. Сигнал от датчиков натяжения усиливается, преобразуется и анализируется специальной компьютерной программой в режиме реального времени. Фибробласты и пластинки приготавливались аналогичным описанному выше способом. Полимеризация культуры в приборе происходила в течение 30 минут при 37°C. Было добавлено 2 мл питательной среды. GlaSbox® помещался в увлажнённый термостат при 37°C. Измерение сократительной активности производилось в течении 24 часов после инкубации. Измерение результата проводилось в условных единицах.

Эксперимент позволяет выяснить, влияют ли на фибробласты проведенные сеансы механо-стимуляции (17 минутные процедуры дважды в неделю на протяжении 8 недель).

Общие исследованияФибробласты после механо-стимуляции и контрольные были культивированы в 12-луночном

планшете в концентрации 0.04×106 клеток и инкубированы при 37°C. НА следующий день было добавлено по 500 мкл DMEM, еще через 48 часов, супернатант (верхняя часть) была перенесена в 10% ингибирующий протеазы раствор (Merck Millipore, Франция). До проведения исследования образцы хранились при 80°C.

Исследование коллагена 1 типа, гиалуроновой кислоты, ММП-1, МПП-9 и тканевого ингибитора ММП1 (ТИМП-1)

Количественная оценка производилась методом ферментного иммуносорбентного анализа (USCN, Life Science and RayBiotech®) Образцы были помещены в лунки с иммобилизованными на биотине специфическими антителами. После промывки образцов, коньюгированные с пероксидазой хрена авидин (для коллагена 1 типа и гиалуроновой кислоты) или стрептавидин (для МПП-1, МП-9 и ТКМП-1) были добавлены в лунки и инкубированы. После добавления раствора тетраметилбензидина, в лунках содержащих исследуемое вещество происходило изменение цвета раствора. Биохимическая реакция останавливалась добавлением раствора серной кислоты, а интенсивность цвета измерялась спектрофотометром при длине волны 450 нм. Концентрация определялась по оптической плотности образцов на стандартной кривой.

Исследование эластинаОбщий растворимы й эластин измерялся колориметрическим способом (Fastin™ Elastin Assay;

Biocolor). Образцы были осаждены раствором трихлоруксусной кислоты и аргинином, после чего был добавлен связывающий эластин 5,10,15,20-тетрафенил-21,23-дипорфин тетра-сульфонат. Образованный комплекс был диссоциирован раствором гуанидин-гидрохлорида и пропан-1-олом.

Колориметрия производилась при длине волны 550 нм на спектрофотометре Multiscan EX (Thermo).

Морфологическое исследованиеПод местным обезболиванием 1% р-ром ксилокаина были произведены панч-биопсии кожи

яремной области у 5 мужчин и 5 женщин в Т1 (после 24 сеансов). Биопсии были взяты с обоих сторон лица, промаркированы, и в дальнейшем сравнивались попарно, слепым образом.Каждый биоптат был разделен на фрагменты, одни были фиксированы 3% параформальдегидом и фосфатном буфера, а другие - 2% р-ром глютаральдегида в щелочном какодиловом буфере и инкубировались при 4°C в течение 3 дней. Для морфологического исследования, фрагменты фиксированные глутаральдегидом, были отмыты и залиты 1% р-ром тетрохлорида осмия на 2 часа. После дегидрирования последовательными спиртовыми разведениями, фрагменты были импрегнированы и залиты эпоксидной смолой на трое суток при 60°C. Ультратонкие срезы были окрашены ацетатом уранила и цитратом свинца.

Фрагменты, фиксированные параформальдегидом, после отмывки, дегидратации и переноса на LR White resin, полимеризованной ультрафиолетом А при 4°C (EMS, USA). Ультратонкие срезы были никелевой решетке с формварным покрытием (EMS, USA) были связаны с антителами к α-актину (разведение 1/50), отмыты фосфатным буфером, и инкубированы в течение часа на анти-мышиных антителах козы, меченых коллоидным золотом (разведение 1/10, Amersham, UK). После финальной отмывки фосфатным буфером и дистиллированной водой, срезы были окрашены ацетатом уранила.

Цифровое изображение срезов было получено просвечивающим электронным микроскопом. Полуколичественным методом оценены плотность и другие характеристики кожного матрикса - пучков коллагена и эластичных волокон. Также оценивались морфологические признаки метаболической и секреторной активности фибробластов и экспрессия α-актина.

Статистический анализДанные предоставлены как средние с указанием стандартного отклонения. Для проверки

нормальности распределения данных использовался тест Шапиро-Уилка. Различия между группами данных, полученных в начале и после завершения процедур, были

оценены двухвыборочным t-критерием Стьюдента ( в случае ненормального распределения данных - тестом Вилкоксона). Для дисперсионного анализа применялся критерий Стьюдента-Ньюмана-Кейлса при нормальном распределении данных, или критерием Фридмана с критерием Данна при ненормальном распределении.

Анализ вариации одного признака, дополненный точным тестом Фишера (при необходимости) производилась для in vitro анализов. Анализ по двум признакам (группа и день), дополненный точным тестом Фишера (при необходимости) проводился для оценки миграционной активности и сократительной способности.

РезультатыВсем тридцати добровольцам (20 женщин и 10 мужчин, средний возраст 44,5±4.6 лет)

проведены 24 сеанса механо-стимуляции. 13 женщин получали противозачаточные препараты.В анамнезе у добровольцев отменены депрессия (n=4), сезонная аллергия (n=2), грыжа

пищеводного отверстия диафрагмы (n=1), экзема рук (n=1), семейная гиперхолестеринемия (n=1), эпилепсия (n=1), аллергия на никель (n=1), аллергия на трамадол (n=1), эмфизема (n=1) и хронический бронхит (n=1).

Основные результатыКлиническое уменьшение обвисания кожи, по меньше мере, по одному параметру шкалы

Эзуре наблюдалось в 73% (n=22) случаев на исследуемой стороне лица, и в 53% случаев (n=16) -

на контрольной (P=0.108). Этот же показатель для зон С и D - 70% (n=15) на стороне проведенных процедур, и 50% (n=15) - на контрольной (P=0.114).

Таблица 1. Динамика оценок обвисания кожи Области Количество добровольцев с уменьшением обвисания кожи (всего 30) Р

Исследуемая сторона лица Контрольная сторона лицаB 10 (33%) 8 (27%) 0,573C 7 (57%) 11 (37%) 0,120D 13 (43%) 8 (27%) 0,176Как минимум один критерий в B, C или D

22 (73%) 16 (53%) 0,108

Как минимум один критерий в C или D

21 (70%) 15 (50%) 0,114

ПримечаниеB зона - верхняя часть области щек и носогубной складкиС зона - нижняя часть области щекD зона - боковая часть области щек

Дополнительные результаты

Шкала цвета кожи CLBT™Клиническая оценка цвета лица по шкале CLBT™ была близкой для правой и левой сторон

до проведения процедур (Т0). На стороне лица, перенесшей 24 сеанса, все показатели шалы были выше начальных значений. По сравнению с контрольной стороной, показатели прозрачности кожи, яркости и светоотражения исследуемой стороны достоверно отличались в большую сторону (таблица 2, рисунки 3 и 4)

Таблица 2. Результаты оценки по шкале CLBT™ до (Т0) и после (Т1) 24 сеанса процедур

Score (Musnier et al12)

Сторона после процедур Контрольная сторона

T0 (среднее ± СО) T1 (среднее ± СО) T0 (среднее ± СО) T1 (среднее ± СО)

Общая оценка (Чем ниже число, тем однороднее кожа)

12.60±3.10 10.90±2.98* 12.03±2.89 11.83±2.89§

Розово-красный 40.33±19.56 33.00±18.03* 40.00±17.42 38.33±16.42§

Оливковый 36.67±10.93 24.67±9.00* 36.00±10.37 32.67±9.07§

Бежевый 54.00±12.76 45.00±13.06* 53.33±13.73 50.67±13.67§

Светло-розовый 69.67±12.17 59.00±17.09* 69.67±12.99 66.33±13.2§

Прозрачность 3.56±1.93 4.57±1.50* 3.55±1.84 3.59±1.45§

Яркость 2.43±1.88 3.04±1.64* 2.44±1.80 2.57±1.53§

Светоотражение 2.08±1.12 4.11±1.69* 2.01±1.06 2.94±1.38*,§

ПримечаниеЦветовый параметры оцениваются по шкале от 10 до 100%, параметры прозрачности, яркости и светоотражения - по шкале от 0 до 10. * Достоверное различие между Т0 и Т1§ Достоверное различие между исследуемой и контрольной сторонами лица в Т1

Исследуемая сторона

Контрольная сторона

Рисунок 3. Оценка цветовой однородности в Т0 и Т1

Исследуемая сторона

Контрольная сторона

**

20

25

30

35

40

20

25

30

35

40

45

50

(olive

Clinical scoring

pink red

Clinical scoring

**

80

75

70

65

60

55

50

60

55

50

45

40

light pink

Clinical scoring

beige

Clinical scoring

6

5

4

3

2

1

4**

3

2

1

brightnessClinical scoring

B

transparencyClinical scoring

6

5

4

3

2

luminosityClinical scoring

*

Рисунок 4. Результаты по критериям прозрачности, яркости и светоотражения

Итого, семь оцениваемых параметра показали достоверное улучшение на стороне проводимых процедур. Для наглядности перечислим эти улучшения Т1 к Т0 по сравнению с контрольной стороной:

Красно-розовый: 18,2 % на исследуемой стороне против 4,2% на контрольной; Оливковый: 32,7% против 9,2%; Бежевый: 16,7% против 5%; Светло-розовый: 15,3% против 4,8% Прозрачность: 28,4% против 1,1% Яркость: 25,1% против 5,3% Светоотражение: 97,6% против 46,3%

Гладкость

До процедур, между правыми и левыми сторонами лица не было значимых различий по таким показателям как: неравномерность поверхности, мимические морщины, глубокие морщины, дефекты кожи, текстура кожи, темные кругам под глазами, наличие папул или микроцист.После проведения 24 сеансов, все показатели снизились на стороне, на которой проводились процедуры (P=0,05), кроме наличия папул и микроцист. На контрольной стороне не было различий между оценками в периоды Т0 и Т1.

Достоверные различия наблюдались по всем параметрам (таблица 3 и рисунок 5).Улучшение Т1 к Т0 составило по показателям:

Неравномерность поверхности: 20,7% против 2,5%; Мимически морщины, глубокие морщины и дефекты кожи: 21,1% против 0,6%; Текстура кожи: 15% против 6,37%; Темные круги под глазами: 14,2% против 4,2%; Оценка гладкости: 19,2% против 5,4%

Таблица 3

ЗначениеИсследуемая сторона лица Контрольная сторона лица

T0 (среднее ± СО) T1 (среднее ± СО) T0 (среднее ± СО) T1 (среднее ± СО)Неравномерность поверхности 5.13±1.20 4.07±1.05* 5.13±1.20 5.00±1.05§

Мимические и глубокие морщины 4.73±1.26 3.73±1.05* 4.80±1.24 4.77±1.04§

Текстура кожи 3.73±1.84 3.17±1.88 * 3.77±1.87 3.53±2.03§

Темные круги под глазами 4.63±1.71 3.97±1.85* 4.77±1.72 4.57±1.74§

Папулы/микроцисты 1.23±1.07 0.80±0.85* 1.17±1.02 0.70±0.79§

Оценка гладкости 19.47±3.85 15.73±4.02* 19.63±3.74 18.57±3.41§

ПримечаниеДля описания различий по параметрам гладкости кожи использовалась аналоговая шкала от 0 до 9. Итоговое значение представлено как сумма показателей. Чем ниже оценка, тем показатель гладкости выше.* Достоверное различие между Т0 и Т1§ Достоверное различие между исследуемой и контрольной сторонами лица в Т1

Исследуемая сторона

Контрольная сторона

5.5

5.0

4.5

4.0 *

3.5

surface irregularityClinical scoring

Рисунок 5

Цвет.

В Т0 не было различий между сторонами лица, за исключением показателя папулы/точки, Р=0,086).В Т1 по параметрам неравномерности цвета, темных кругов под глазами, папул/точек и общей оценки цвета кожи было выявлено достоверно улучшение на исследуемой стороне, улучшений на контрольной стороне отмечено не было. Улучшение на стороне, на которой проводились процедуры, по сравнению с контрольной, составило по показателям:

• Общая разнородность кожи: -13,2% против +1,2%;• Круги под глазами: 15,1 % против 1,7%• Покраснение/розацеа: -9,4% против +2,5%• Общая оценка цвета: 13,5% против 1,7%

Таблица 4

ЗначенияИсследуемая сторона лица Контрольная сторона лица

T0 (среднее ± СО) T1 (среднее ± СО) T0 (среднее ± СО) T1 (среднее ± СО)Общая неравномерность кожи 3.40±0.86 2.93±0.98* 3.23±0.73 3.27±0.87§

Темные круги под глазами 3.57±1.52 3.03±1.50* 3.53±1.66 3.47±1.59§

Покраснение/розацеа 2.87±1.59 2.60±1.45 2.80±1.52 2.87±1.36

Гиперпигментация 2.03±1.19 1.97±1.22 1.97±1.35 1.93±1.34

Папулы/шрамы 0.73±0.87 0.37±0.49* 0.50±0.73 0.30±0.53

Общая оценка цвета кожи 12.60±3.10 10.90±2.98* 12.03±2.89 11.83±2.89ПримечаниеДля описания различий по параметрам гладкости кожи использовалась аналоговая шкала от 0 до 9. Итоговое значение представлено как сумма показателей. Чем ниже оценка, тем показатель цвета кожи лучше.* Достоверное различие между Т0 и Т1§ Достоверное различие между исследуемой и контрольной сторонами лица в Т1

Самооценка

Субъективная оценка результативности процедур показала улучшение по 9 из 10 параметров на стороне лица, на которой проводились сеансы механо-стимуляции, тогда как на противоположной стороне было отмечено как небольшое улучшение, так и ухудшение оценок. Статистически достоверными были улучшения по 7 из 9 показателей: неровность, упругость, сияние, мягкость на исследуемой стороне лица. По сравнению с периодом Т0, улучшение было по всем параметрам, включая общую однородность, темные круги под глазами, покраснения и цвет кожи (таблица 5).

Таблица 5.Улучшение на исследуемой стороне в Т1 по сравнению с Т0 (контрольная сторона)

Статистически достоверная разница между сторонами лица после процедур (Т1)

Статистически достоверное улучшение на исследуемой

стороне лица в Т1

Глубокие морщины 13.6% (4.8%) Да (P=0.004)

Неровность 3.8% (−5.1%) Да (P=0.028) Да (P=0.016)Мимические морщины −3.1% (−10.5%)

Носогубная складка 21.3% (11.6%) Да (P=0.089)

Эластичность 11.2% (0.5%) Да (P=0.003)

Упругость 23.1% (2.5%) Да (P=0.003) Да (P=0.001)

Сияние 26.3% (14%) Да (P=0.011) Да (P=0.026)Мягкость 2.1% (−7.4%) Да (P=0.018) Да (P=0.016)Темные круги под глазами 18.8% (0%) Да (P=0.001)

В таблице 6 показаны результаты опросника, заполненного в период Т2 (через месяц после процедур):

Сторона на которой проводились процедуры

Противоположная сторона

Плотность кожи T1 70 23T2 75 37

Эластичность кожи T1 73 20T2 75 24

Мягкость кожи T1 67 23T2 87 12

Уменьшение морщин

T1 87 10T2 75 12

Уменьшения обвисания

T1 77 20T2 75 25

Яркость кожи T1 20 53T2 62 24

ПримечаниеУказана доля ответов, оценивающих показатель как улучшенный по сравнению с Т0

Результаты показывают значительное улучшение по всем параметрам, кроме яркости кожи.

Анкета удовлетворенности

В Т1 90% добровольцев были удовлетворены резуотамами механо-стимуляции, в период Т2 число удовлетворенных достигло 100%. В периоды Т1 и Т2 продолжить процедуры хотели 70% и 75% добровольцев, соответственно. 77% поставили процедурам оценку «очень хорошо» или «хорошо» в периоде Т1. Через месяц, в периоде Т2, 87% отмечали положительный эффект сеансов.

Фотографическое исследование

Фотографии иллюстрируют улучшение формы овала лица у 60% добровольцев на стороне проводимых процедур (рисунок 7).

Рисунок 7.Примечание Показано уменьшение обвисания кожи после 24 сеансов на примере двух добровольцев.

Исследования in vitro

Миграционая активность

Этот показатель был оценен по способности фибробластов сокращать свободно-плавающую коллагеновую пленку. Ретракция коллагеновых пленок фибробластами, взятых с участков кожи после механо-стимуляции была достоверно выше, чем у фибробластов с контрольной стороны лица (Р=0,001, рисунок 8).

Рисунок 8.

Измерения силы сокращения матрикса c помощью Glasbox®

Различие между двумя группами фибробластов по количественной оценке силы сокращения коллагеновых пластинок в приборе Glasbox® не наблюдалось.

Рисунок 9.

Исследование синтеза коллагена 1 типа, эластина и гиалуроновой кислоты

Результаты анализа отражены в процентном выражении к периоду Т0. Увеличение синтеза коллагена 1 типа на стороне проводимых процедур по сравнению с противоположной носит недостоверный характер и составило 7.8%±69.8% против 0.0%±0.0%/ соответственно (рисунок 10).

Увеличение синтеза эластина составило на исследуемой стороне составило, в среднем, 45.6%±32.1%, тогда как на контрольной не наблюдалось, а синтез гиалуроновой кислоты увеличился на 80.2%±69.8%, тогда как на контрольной стороне на наблюдалось, P=0.175 and P=0.268, соответственно (рисунок 10).

D10D9D8D7D6D5D4D3D2D1D020

40

60

80 Mécano-Stimulation™

Control

100

Time (days)

lattices (%/D0)

Diameter of retracted collage

Mécano-Stimulation™Control

25201510500.02.0e+4

4.0e+46.0e+48.0e+4

1.0e+51.2e+51.4e+5

of cels)

Forces (arbitrary unit/millions

Time (hours)

Control Mécano-Stimulation™ Control Mécano-Stimulation™

Control Mécano-Stimulation™

Рисунок 10.

Синтез матричных металлопротеиназ (ММП) и тканевых ингибиторов МП

Результаты приведены в процентном выражении к периоду Т0.Достоверно увеличился синтез МПП-9, прирост составил 115,4%, P<0.05 на стороне процедур.Достоверных изменений синтеза МПП-1 и ТКМП не обнаружено (рисунок 11).

Control Mécano-Stimulation™ Control Mécano-Stimulation™

Elastin (%/control)Collagen I (%/control) 180

160

140

120

100

80

60

40

20

00

20

40

60

80

100

120

140

Hyaluronic acid (%/control)

250

200

150

100

50

0

*300

250

200

150

100

50

0

MMP-9 (%/control)

0

20

40

60

80

100

120MMP-1 (%/control)

Control Mécano-Stimulation™

Рисунок 11.

Электронная микроскопия

У 4 из 10 довровольцев наблюдались морфологические признаки улучшения на стороне механо-стимуляции:- расширение сети гранулярного (шероховатого) эндоплазматического ретикулума;- увеличение свечения митохондрий с отчетливо выраженными кристами;- увеличение числе мелких вакуолей (предположительно, секреторных);- структурная перестройка фрагментированных эластичный волокон (как доказательство активации фибробластов)- Повышение экспрессии α-актина более чем в 50% случаях (рисунок 12).

0

20

40

60

80

100

120

140

TIMP-1 (%/control)

Рисунок 12.

ПримечаниеА - Контрольная сторона (аморфное вещество между фрагментами эластичных волокон)B - Исследуемая сторона (перестройка эластичных волокон вблизи фибробластов с выраженными митохондриями)С - Исследуемая сторона (расширение сети гранулярного эндоплазматического ретикулума)D - Исследуемая сторона (секреторные вакуоли, прикрепленные к цитоплазматической мембране, прилегающей к эластичным волокнам)Е - Исследуемая сторона (меченные золотом нити α-актина в фибробластах сосочков дермы)

На образцах кожи контрольной стороны определяются признаки хронического старения, такие как фрагментация эластичных волокон, снижение плотности и структурированности волокон внеклеточного матрикса и нефункционирующие фибробласты. Эти признаки в большей степени были выражены у 7 из 10 добровольцев.

Обсуждение

Старение кожи - это сложный процесс, зависящий и от внутренних факторов (возраст, генетическая предрасположенность), и от негативного влияния окружающей среды (главным образом, УФ-излучения)14. Клиническими проявлениями, в конечном итоге, являются дряблость, обвислость кожи и глубокие морщины15.

Фибробласты - самые распространенные клетки кожи, играющие ключевую роль в синтезе компонентов межклеточного матрикса, его ремоделирования, а также обладающими сократительной способностью. Исследования in vitro показали, что механическое воздействие на

фибробласты способно изменить их функционирование и запустить комплекс биохимических реакций3,4,6, и гипотеза, что механическое воздействие на кожу способно вызвать благоприятные косметические эффекты подтвердилась.

С возрастом кожа истончается, теряет эластичность и становится сухой. Морфологические исследования фибробластов в области морщин показало, уменьшение их сократительной способности и миграционной активности1. Характерные признак старения кожи - это фрагментация волокон межклеточного матрикса16 (в результате ферментативной активности ММП, коллагеназ и эластаз), что разрушает «скелет» дермы. Фибробласты, секретирующие и организующие коллагеновый матрикс не могу прикрепляться к фрагментированному коллагену. Снижение связи с матриксом нарушает передачу механического напряжения на фибробласты и они «коллапсируют». Данная связь необходима для равновесия между выработкой коллагена и коллаген-разрушающих ферментов17. «Коллапсированные» фибробласты отличаются низким синтезом коллагена, но высокой секрецией коллаген-разрушающих ферментов7.

Также при старении кожи снижается выработка протеогликанов (в том числе, гиалуроновой кислоты, обладающей высокой гигроскопичностью - способностью удерживать воду). Фибробласты теряют сократительную способность, и возможность дифференцироваться в миофибробласты, и меньше экспрессируют α-актин. Это уменьшает механическое напряжение в волокнах межклеточного матрикса, и приводит к снижению эластичности и тонуса кожи. Предыдущие исследования эффективности механо-стимуляции показали ее способность запускать естественную выработку коллагена и эластина9.

В настоящем исследовании, 30 добровольцам проведено 24 сеанса механо-стимуляции лица для изучения эффекта методами клинического обследования, а также биохимическими и гистологическими методами. Была выявлена тенденция к улучшения клинического состояния кожи (статистически недостоверная), так по крайней мере по 1 параметру шкалы обвисания кожи11 у 73% добровольцев наблюдалось улучшение. Наименьший эффект от механо-стимуляции наблюдался в верхней части области щеки и носогубной складки, а в нижней и боковой частях области щеки клиническое улучшение наблюдалось у 70%.

Эти результаты соответствуют представлениям об изменениях в дерме (ткани с достаточно низкой обновляемостью) как о первопричине таких возрастных изменений кожи, как обвисание и появление морщин. Считается, что клинические проявления не отчетливы в течении 6 месяцев18, тогда как в данном исследовании процедуры продолжались всего 8 недель (24 сеанса). Образование морщин и обвисание кожи - длительно развивающиеся процессы, которые не могут быть обращены вспять за 8 недель процедур. Рекомендовано проведение долгосрочных наблюдений, подобных уже выполненым в других исследованиях 19,20. Большее количество сеансов и продолжительность курса процедур также может улучшить клинически видимый результат.

По шкале CLBT12, наблюдалось достоверное улучшение всех клинических параметров цвета кожи. Так, прозрачность, яркость и светоотражение на стороне проводимых процедур были достоверно выше, чем на противоположной стороне. Подобное улучшение было отмечено после 6 месяцев процедур на коже лица21, что позволяет предполагать высокую эффективность механо-стимуляции.

Кроме того, по параметрам, характеризующим неравномерность поверхности кожи, мимические морщины, глубокие морщины, текстуру кожи, темные круги под глазами, наличие папул или микроцист и гладкость отмечено достоверное улучшение к периоду до начала исследования на стороне проводимых процедур. На контрольной стороне лица достоверных изменений не выявлено.

Отмечено улучшение цвета кожи (по параметрам неравномерности, темным кругам под глазами и общей оценки цвета) на стороне проводимых процедур по сравнению с контрольной стороной.

Анкеты самооценки показывают высокую эффективность процедур, проявляющуюся в уменьшении глубоких морщин, обвисания кожи, выраженности носогубных складок и кругов под глазами, повышению эластичности, мягкости, упругости, светоотражения. После 24 сеансов, добровольцы описывают свою кожу как более гладкую, упругую, менее морщинистую и обвисающую, и эти улучшения наблюдаются спустя 1 месяц после окончания процедур.

Тот факт, что от 90 до 100% (Т1 и Т2, соответственно) добровольцев были удовлетворены процедурами и от 70 до 75 % (Т1 и Т2, соответственно) выразили желание продолжить курс

процедур, подтверждает как объективную, так и субъективную результативность механо-стимуляции.

Доказано, что механо-стимуляция повышает синтез некоторых ферментов, главным образом, ММП-9. Матричные металлопротеиназы обеспечивают ремоделирование и восстановление соединительных волокон матрикса. МПП-9 обнаружен в эпителиальных клетках при острой фазе раневого процесса23. МПП-9 запускает очищение от денатурированного коллагена всех типов, присутствующего в стареющей коже24.

Анализ сократительной способности фибробластов не показал различия между группами, что свидетельствует, что 24 сеансов механо-стимуляции недостаточно для наблюдения эффекта «лифтинга» с помощью применяемой методики измерения. Однако, миграционная активность была выше на исследуемой стороне, поэтому можно предполагать положительное влияние механо-стимуляции на способность к миграции и запуск процессов ремоделирования матрикса in vivo.

Достоверное повышение синтеза ММП-9 и повышение миграционной активности предполагает положительное влияние механо-стимуляции на синтез компонентов внеклеточного матрикса.

Механо-стимуляция повышает сниженную в стареющей коже активность фибробластов. Полученные результаты позволяют ожидать пролонгированный эффект от процедур и значительное повышение синтеза коллагена 1 типа, эластина и гиалуроновой кислоты. К ожидаемый результатам относится и улучшение сократительной силы и структуры волокон соединительной ткани.

Позитивные изменения, обнаруженные на гистологическом уровне у 4 из 10 добровольцев, коррелируют с положительными изменениями клинических параметров и биохимических анализов.

Самая существенная находка при электронной микроскопии - заметное начало перестройки фрагментированных волокон эластина. Несмотря на то, что достаточно трудно дифференцировать их от заново синтезированного эластина или от продуктов распада волокон, есть доказательства, подтверждающие что после механо-стимуляции кожа способна переработать эти компоненты внеклеточного матрикса. Однако, наблюдаемый эффект был менее выражен, чем после длительного применения крема с витамином С25,26.

Образование стресс-фибрилл и их присоединение к фокальным контактам через винкулин - признак организации фибробластов на коллагеновых пластинках, подверженных натяжению6. Общее повышение экспрессии α-актина на исследуемой стороне в половине наблюдаемых случаев могут объяснить клинические и биохимические результаты морфологическими изменениями.

Предположительно, экспрессия α-актина фибробластами не является надежным методом оценки тканевого ответа на механо-стимуляцию. Связывание α-актина антителами было обнаружено во всех биоптатах, как на исследуемой, так и на контрольной сторонах лица, а уровень экспрессии на фибробластах широко варьировался как в пределах одного образца, так и между различными образцами.

Наше исследование подтверждает возможности механо-стимуляции активизировать процессы перестройки соединительной ткани.

Заключение

Данное исследование не только показывает клинически заметные результаты чрезкожной, неинвазивной и безболезненной стимуляции, но также их внутренние причины. Исследование представляет доказательства того, что механо-стимуляция, заключающаяся в воздействии на поверхность кожи, способна привести к очевидным улучшениям кожи лица. Эти улучшения связаны с повышением синтеза компонентов внеклеточного матрикса.

БлагодарностьИсследование стало возможным благодаря работе и помощи добровольцев, техников, и

исследователей нашего центра, мы сердечно благодарим Аурели Дурай (Aurélie Durai), Ванессу Екарно (Vanessa Ecarnot) и Селин Тиебо (Celine Thiebaud) за их энтузиазм в исследовании, а также Клелию Монте (Clélia Monteux) и Кристиана Ганиере (Christian Gagnière) за предоставление устройства.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов и какого-либо финансового вознаграждения за проведенное исследование. Исследование было проведено под покровительством университета.

Литература

1. Courderot-Masuyer C, Robin S, Tauzin H, Humbert P. Evaluation of the behaviour of wrinkles fibroblasts and normal aged fibroblasts in the presence of poly-l-lactic acid. J Cosmet Dermatol Sci Appl. 2012;2:20–27.

2. Jacquet L. Le massage plastique à double action dans le traitement des dermatoses [The double action plastic massage in the treatment of dermatosis]. Paris Médical: la semaine du clinicien. 1911;01: 355–358. French.

3. Eastwood M, MacGrouther DA, Brown RA. Fibroblasts responses to mechanical forces. Proc Inst Mech Eng. 1998;212:85–92.

4. Chiquet M. Regulation of extracellular matrix gene expression by mechanical stress. Matrix Biol. 1999;18:417–426.

5. Harris AK, Stopak D, Wild P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 1981;290:249–251.

6. Kessler D, Dethlefsen S, Haase I, et al. Fibroblasts in mechanically stressed collagen lattices assume a “synthetic” phenotype. J Biol Chem. 2001;276:36575–36585.

7. Varani J, Dame MK, Rittie L, et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Am J Pathol. 2006;168(6):1861–1868.

8. Hu JJ, Humphrey JD, Yeh AT. Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy. Tissue Eng Part A. 2009;15(7):1553–1564.

9. Revuz J, Adhoute H, Cesarini JP, Poli F, Lacarriere C, Emiliozzi C. Clinical and histological effects of the Lift6® device used on facial skin ageing. Nouv. Dermatol. 2002;21:335–342.

10.Fitzpatrick TB. The validity and practicality of sun-reactive skin type I through VI (Editorial). Arch Dermatol. 1988;124:869–871.

11.Ezure T, Hoshoi J, Amano S, Tsuchiya T. Sagging of the cheek is related to skin elasticity, fat mass and mimetic muscle function. Skin Res Technol. 2009;15(3):299–305.

12.Musnier C, Piquemal P, Beau P, Pitter J. Visual evaluation in vivo of “complexion radiance” using the C.L.B.T. sensory methodology. Skin Res Technol. 2004;10(1):50–56.

13.Bell E, Ivarsson G, Merrill C. Production of tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:1274–1278.

14.Mac Mary S, Sainthillier JM, Jeudy A, et al. Assessment of cumulative exposure to UVA through the study of asymmetrical facial skin aging. Clin Interv Aging. 2010;5:277–284.

15.Gilchrest BA. Skin aging 2003: recent advances and current concepts. Cutis. 2003;72:5–10.16.Fisher GJ, Varani J, Voorhees JJ. Fibroblast collapse and therapeutic implication. Arch Dermatol.

2008;144(5):666–672.17.Fisher GJ, Quan T, Purohit T, et al. Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates

matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin. Am J Pathol. 2009;174:101–114.18.Qiu H, Long X, Ye JC, et al. Influence of season on some skin properties: winter vs summer, as

experienced by 354 Shanghainese women of various ages. Int J Cosmet Sci. 2011;33(4):377–383.19.Fanian F, Mac-Mary S, Jeudy A, et al. Efficacy of micronutrient supplementation on skin aging and

seasonal variation: a randomized, placebocontrolled, double-blind study. Clin Interv Aging. 2013;8:1527–1537.

20.Watson RE, Bowden JJ, Bastrilles JY, Long SP, Griffiths CE. A cosmetic “anti-ageing” product improves photoaged skin: a double-blind, randomized controlled trial. Br J Dermatol. 2009;161:419–426.

21.Haftek M, Mac-Mary S, Le Bitoux MA, et al. Clinical, biometric and structural evaluation of the long-term effects of a topical treatment with ascorbic acid and madecassoside in photoaged human skin. Exp Dermatol. 2008;17:946–952.

22.Chen W, Fu X, Ge S, Sun T, Sheng Z. Differential expression of matrix metalloproteinases and tissue-derived inhibitors of metalloproteinase in fetal and adult skins. Int J Biochem Cell Biol. 2007;39(5):997–1005.

23.Dasu MR, Spies M, Barrow RE, Herndon DN. Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in severely burned children. Wound Repair Regen. 2003;11(3):177–180.

24.Mohan R, Chintala SK, Jung JC, et al. Matrix metalloproteinase gelatinase B (MMP-9) coordinates and effects epithelial regeneration. J Biol Chem. 2002;277(3):2065–2072.

25.Nusgens BV, Humbert P, Rougier A, et al. Topically applied vitamin C enhances the mRNA level of collagens I and III, their processing enzymes and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase in the human dermis. J Invest Dermatol. 2001;116(6):853–859.

26.Humbert P, Haftek M, Creidi P, et al. Topical ascorbic acid on photoaged skin. Clinical, topographical and ultrastructural evaluation: double-blind study vs. placebo. Exp Dermatol. 2003;12(3):237–244