8/19/2019 LP Master_aspecte Generale

1/6

1

CULTURA DE CELULE ŞI ŢESUTURI ANIMALE: Aspecte generale 

Cultura de celule este o metoda de biologie celulara pe larg utilizată pentru cercetarile

 biomedicale fundamentale (biochimie, biologie celulară şi moleculară, genetică) şi aplicative

(biotehnologie, inginerie tisulară, inginerie genetică etc). 

LABORATORUL DE CULTURI CELULARE

Laboratorul de culturi celulare se compune din mai multe spatii de lucru si anexe,

legate intre ele intr-un circuit functional, care sa asigure pe de o parte protectia personalului,

iar pe de alta parte conditiile sterile de lucru, de care depinde reusita procedurilor de lucru.

Camera pentru preparare a mediilor si sterilizare, vestiarul, camera-filtru si boxele sterile sunt

 principalele incaperi, care alcatuiesc circuitul unui laborator de culturi celulare. In afara de

acestea, un spatiu separat este prevazut pentru stocarea probelor biologice la rece, sau camerade criostocare.

In camera de preparare a mediilor  si sterilizare sunt amplasate aparatle necesare

 pentru obtinerea unui mediu de cultura (aparatul pentru obtinerea de apa distilata sau

ultrapura, balanta analitica, plita magnetica, pH-metru, etuva, autoclav, frigider etc)

Vestiarul  este dotat cu dulapuri si spatii de depozitare a hainelor de exterior si

materiale pentru igiena personala (chiuveta cu apa curenta, sapun, prosoape de hartie).

In camera-filtru se gasesc echipamentele vestimentare pentru operatorii culturilor de

celule (halate, manusi, capeline, masti, papuci de laborator), dezinfectante pentru maini si alte

materiale de lucru, care necesita depozitarea intr-un spatiu curat, cu decontaminare periodica.

Camera sterilă  este dotată cu sisteme eficiente de sterilizare (aparat pentru filtraeasterila a aerului, lampa cu radiaţie UV, echipamente sterile pen tru personal). In camera sterila

se lucreaza cu materialul biologic (celule si tesuturi), utilizand aparatura specifica pentru

obtinerea suspensiilor celulare, pentru incubarea celulelor si monitorizarea acestora. Astfel, in

camera sterila (boxa sterila de lucru) sunt amplasate urmatoarele aparate:Hota cu flux de aer laminar  vertical -  o incinta

de lucru cu deschidere frontală. Are montate in

 plafon filtre HEPA cu o dimensiune a porilor de

0,22 µm, care nu permit trecerea

microorganismelor. Astfel, filtrele HEPA au

rolul de a steriliza aerul, care intra in contact cu

celulele, lichidele si celelalte materialele sterile.

8/19/2019 LP Master_aspecte Generale

2/6

2

Incubatorul in care celuele sunt menţinute la o

temperatură de 37 OC, o concentratie a

 bioxidului de carbon (CO2) din aer de 5-6 % si

96-97% umiditate. Atmosfera hipoxica

(imbogatita cu CO2) este un factor stimulator alcresterii celulare pe de o parte si un factor de

mentinere a echilibrului acido-bazic in mediile

de cultura formulate pe baza de NaHCO3, pe de

alta parte. Umiditatea este importanta pentru

evitarea cresterii osmolaritatii mediilor de

cultura prin evaporarea apei..

Microscopul optic inversat in contrast

de faza , cu ajutorul caruia sunt analizate celulele

vii din cultura.Centrifugă de laborator cu sistem de termoreglare, necesara pentru procesul de

izolare si spalarea a celulelor.

In camera de criostocare sunt pastrate, la diferite intervale valorice ale

temperaturilor

8/19/2019 LP Master_aspecte Generale

3/6

3

MATERIALE DE LUCRU

Materialel specifice tehnicii culturilor de celulare sunt:

- recipientele pentru creşterea celulelor (cutii Petri, flacoane tip Corrner cu suprafatade crestere diferita, plăci multicelulare simple şi supraetajate)

- tuburi pentru criostocare,

- tuburi pentru centrifugare,

- pipete gradate si pipete automate cu varfuri detasabile,

- sisteme de filtrare a solutiilor cu pori de 0,22 µm,

- camere de numarat celule,

- alte materiale, comune laboratoarelor cu specific de biochimie si biologie moleculara

Este bine sa fie folosite recipiente de cultura de unica folosinta, presterilizate (din

 policarbonat, polistiren sau polipropilen) in locul sticlăriei clasice, care necesita spalare sisterilizare.

Plasi de cultura simple Tuburi de centrifuga

Placi de cultura multi-well

(multicelulare), sau cu godeuri

Pipete serologice si dispozitiv de

umplere a acestora 

8/19/2019 LP Master_aspecte Generale

4/6

4

Flacoane de cultura Camera de numarat celule

(hemocitometru)

Filtre cu pori de 0,2 µm, atasabile la

seringa

Pipete automate si varfuri pentru pipete

automate

MEDII DE CULTURĂ 

Mediile de cultură folosite intr -un laborator de culturi celulare sunt de mai multe tipuri

si sunt alese in functie de necarul nutritiv al celulelor si protocol. In functie de tipul celulelor

din cultura si a obiectivelor se pot utiliza:

-  medii de spalare (solutii saline tamponate)

- 

medii de cultura pe baza de ser fetal bovin (SFB)- 

medii de cultura sintetice, cu o compozitie definita, fara suplimente nutritive

naturale (medii fara SFB)

Mediile de cultura sunt solutii saline fiziologice tamponate,

imbogatite cu suplimente organice cu rol nutritiv, energetic, de

reglare a metabolismului celular si a diviziunii celulare.

(aminoacizi, vitamine, glucoza si altele). Mediile de cultura de

cele mai multe ori sunt suplimentate cu 1% amestec de

antibiotice (penicilina, streptomicina, neomicina) si cu rosu-

fenol, in calitate de indicator pH.

8/19/2019 LP Master_aspecte Generale

5/6

5

PROCEDEE DE STERILIZARE

Toate materialele si lichidele care intra in contact cu celulele in cultura trebuie sa fie

sterile. Alegerea metodei de sterilizare a acestora este dictata de stabilitatea lor la temperaturi

inalte. Sterilizarea cu aer uscat si fierbinte, sterilizarea in abur fierbinte, iradierea, sterilizareachimica si filtrarea sunt cele 5 posibilitati aplicate in functie de materiialul sterilizat.

METODA CONDITII MATERIALE LIMITARI

Aer

fierbinte

160oC, 1

ora

Metal, sticla, PTFE (teflon) Pot avea loc schimbari

de culoare a

materialelor sterilizate

Abur

fierbinte

121oC, 15-

20 min

Lichide stabile: apa, solutiile saline,

materiale plastice stabile latemperaturi inalte: siliconii,

 policarbonatul (PC), nylonul,

 polipropilena (PP)

Ambalaje permiabile la

abur;Un timp mai mare de

incalzire din cauza unui

volum mare de apa

necesar pentru sursa de

abur

Iradiere:

Radiatii γ  25KGy Materiale plastice de tipul

 polistirenului (PS), suporturi

organice, reactivi si substante

sensibile la incalzire

Alterari chimice si

degradari

macromoleculare

Plasma

(fascicol

de

electroni)

25KGy Materiale plastice de tipul PS,

suporturi organice, reactivi si

substante sensibile la incalzire

 Necesita o sursa de

generare a electronilor,

fiind mai putin

accesibila pentru

laboratoarele miciMicrounde 5 min,

intensitate

superioara

Apa, gelurile de tipul agarului Este posibil pentru

volume mici

Radiatiile

UV din

spectrul

lungimilor

scurte

254 nm, 50-

100 W, 30

min

Solutii contaminate, material plastic,

aerul din incinta, suprafete extinse de

lucru.

 Nu este accesibil pentru

zonele umbrite;

Rezistenta pentru spori

8/19/2019 LP Master_aspecte Generale

6/6

6

Sterilizare chimica:

Etilen oxid 1h Materiale plastice

term-instabile

Din cauza compusilor toxici

reziduali, necesita o ventilare

de cateva zile

70% solutie apoasa

de alcool etilic

1 ora de

imersie

Instrumentar metalic Nu distruge sporii;

Exista un risc crescut de

imflamare daca se asociaza cu

flambarea la flacara

Filtrare:

Filtre atasabile la

seringa sau unitati

de filtrare pentru

volum mare de

lichid

Pori de 0,2

µm

Toate solutiile apoase,

in special cele termo-

sensibile, ce contin

 proteine

 Nu poate fi folosit pentru

solutiile vascoase sau DMSO

(di-metilsulfoxid)

NORME DE SECURITATE SI PROTECTIA MUNCII IN LABORATORUL

DE CULTURI CELULARE:

1)  In laborator nu se intra in hainele si incaltamintea de strada.

2)   Nu se consuma alimente sau lichide

3)  Inainte de a intra si la parasirea spatiilor laboratorului de culturi celulare mainile se spala cu

sapun lichid cu proprietati dezinfectante

4) 

Se evita expunerea la radiatiile UV. Lampile UV sunt pornite dupa terminarea lucrarilor sisunt oprite cu cel putin 20-30 min inainte de a intra in laborator

5)  Pentru colectarea materialelor cu potential risc biologic se utilizeaza sacii si galetile din

material plastic de culoare galbena, cu in scriptia BIOHAZARD –  risc biologic