Listeria monocytogenes EN MOLUSCOS BIVALVOS...
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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS PROGRAMA MAESTRÍA DE MICROBIOLOGÍA Listeria monocytogenes EN MOLUSCOS BIVALVOS DISTRIBUIDOS EN DIFERENTES EXPENDIOS DE LA CIUDAD DE MARACAIBO – VENEZUELA Trabajo de grado para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología Autor: Lcdo. Octoban José Urdaneta Morán Tutor: Dra. Marynes Montiel de Morales Maracaibo, noviembre de 2013
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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS PROGRAMA MAESTRÍA DE MICROBIOLOGÍA
Listeria monocytogenes EN MOLUSCOS BIVALVOS DISTRIBUIDOS EN DIFERENTES EXPENDIOS DE LA CIUDAD DE MARACAIBO – VENEZUELA
Trabajo de grado para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología
Autor: Lcdo. Octoban José Urdaneta Morán
Tutor: Dra. Marynes Montiel de Morales
Maracaibo, noviembre de 2013
4
ÍNDICE DE CONTENIDO
Págs.
FRONTISPICIO ......................................................................................................... 2
VEREDICTO ............................................................................................................. 3
ÍNDICE GENERAL .................................................................................................... 4
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................... 6
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................. 7
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS ...................................................................................... 8
RESUMEN ................................................................................................................ 9
ABSTRACT .............................................................................................................. 10
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 11
CAPÍTULO I.- OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
1. Objetivo General ............................................................................................... 29
2. Objetivo Específicos ......................................................................................... 29
CAPÍTULO II.- METODOLOGÍA
1. Estandarización del Inóculo ............................................................................. 31
2. Población y Muestra ........................................................................................ 31
3. Preparación de los Homogeneizados ............................................................... 33
4. Delimitación del Porcentaje de Recuperación .................................................. 34
5. Identificación de Listeria monocytogenes en moluscos .................................... 36
6. Metodología para detección de Listeria monocytogenes en moluscos bivalvos mediante la técnica de inmunoensayo enzimático (ELISA) ................ 39
7. Determinación de indicadores de calidad en los moluscos bivalvos ................. 42
8. Determinación de Coliformes Totales y Coliformes fecales o termotolerantes . 42
9. Determinación de Escherichia coli .................................................................... 44
5
10. Determinación de Salmonella ........................................................................... 45
CAPÍTULO III.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Resultados y Discusión ..................................................................................... 49
CONCLUSIONES ...................................................................................................... 57
RECOMENDACIONES ............................................................................................ 58
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 59
6
ÍNDICE DE FIGURAS
Págs.
Figura 1: Curva de Crecimiento de Listeria monocytogenes ................................. 49
Figura 2: Evaluación de la recuperación de Listeria monocytogenes mediante la técnica descrita en la Norma COVENIN 3718:2001 .......................... 51
Figura 3: Porcentajes de Coliformes Fecales ........................................................ 53
Figura 4: Porcentajes de Escherichia coli. ............................................................. 54
Figura 5: Porcentaje de muestras positivas y negativas de Salmonella ................ 55
7
ÍNDICE DE TABLAS
Págs.
Tabla 1: Características bioquímicas de Listeria monocytogenes ........................ 38
Tabla 2: Características Bioquímicas para Escherichia coli ................................. 45
Tabla 3: Características de Salmonella según el tipo de medio utilizado ...... 46
Tabla 4: Pruebas bioquímicas confirmatorias para Salmonella ............................ 47
Tabla 5: Porcentaje de Recuperación de L. monocytogenes siguiendo la metodología propuesta en la técnica COVENIN 3718:2001. ................. 50
Tabla 6. Valores promedios, mínimo y máximo de la concentración encontrada de coliformes fecales (CF) y Escherichia coli (EC) según tabla de NMP ....................................................................................................... 55
8
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS
Págs.
Fotografía 1: Muestras de moluscos bivalvos en los refrigeradores comerciales ..... 32
Fotografía 2: Mejillones al alcance del consumidor final ........................................... 32
Fotografía 3: Extracción del contenido intravalvar ..................................................... 33
Fotografía 4: Pesado del contenido intravalvar. ........................................................ 33
Fotografía 5: Proceso de Licuado (homogenización) ................................................ 34
Fotografía 6: Diluciones seriadas de los homogenizados ......................................... 35
Fotografía 7: Crecimiento en Agar Palcam de Listeria monocytogenes. ................... 35
Fotografía 8: Homogeneizado de moluscos bivalvos con caldo de enriquecimiento para Listeria ......................................................................................... 36
Fotografía 9: Colonias presuntivas de Listeria monocytogenes en Agar Palcam. ..... 36
Fotografía 10: Colonias presuntivas de Listeria monocytogenes en STYE ................. 37
Fotografía 11: Homogeneizados en viales. ................................................................. 39
Fotografía 12: Baño de María a 95–100 °C ................................................................. 40
Fotografía 13: Distribución de controles y muestras en los pozos de microtitulación .. 40
Fotografía 14: Distribución del conjugado en los pozos de microtitulación ................. 41
Fotografía 15: Incubación a 37°C ................................................................................ 41
Fotografía 16: Preparación del homogeneizado para Coliformes Totales, Fecales y Escherichia coli ................................................................................. 42
Fotografía 17: Inoculación de los tubos de Caldo Lactosado a partir del homogeneizado .................................................................................... 43
Fotografía 18: Tubos de Caldo Lactosado. ................................................................. 43
Fotografía 19: Caldo Bilis Verde Brillante, a la izquierda un tubo negativo y a la derecha uno positivo ............................................................................ 44
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Urdaneta Morán, Octaban José. Listeria monocytogenes EN MOLUSCOS BIVALVOS DISTRIBUIDOS EN DIFERENTES EXPENDIOS DE LA CIUDAD DE MARACAIBO – VENEZUELA. Trabajo de Grado para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. División de Estudios para Graduados. Maestría en Microbiología. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia. Maracaibo 2013. p. 63.
RESUMEN Uno de los problemas más importantes de salud pública a nivel mundial son las enfermedades transmitidas por alimentos que afectan negativamente no solo la productividad económica sino también a los consumidores. Entre este grupo de enfermedades se encuentra la listeriosis humana que es causada por la bacteria Gram positiva L. monocytogenes. Uno de los productos con alto riesgo de ser contaminados por L. monocytogenes son los moluscos bivalvos que, por su fisiología, pueden concentrar o ser contaminados al durante el empacado y almacenamiento, ya sea porque la bacteria de producto empacado para su venta o por el contacto de estos con otros productos contaminados y con utensilios y equipos utilizados para empacar los moluscos. Objetivo: Detectar Listeria monocytogenes en molusco bivalvos distribuidos en diferentes expendios de la ciudad de Maracaibo – Venezuela, Evaluar el porcentaje de recuperación de Listeria monocytogenes mediante la inoculación de moluscos bivalvos utilizando la técnica descrita en la Norma COVENIN 3718:2001. Metodología: Norma COVENIN e inmunoensayo para detección de L. monocytogenes. Resultados: No se encontraron resultados positivos para L. monocytogenes. Conclusiones: El valor mínimo detectado por la norma COVENIN 3718:2001 para la detección de Listeria monocytogenes, en los moluscos bivalvos es de 1x104 UFC/g. Palabras clave: Listeria monocytogenes, listeriosis, moluscos bivalvos Correo Electrónico: [email protected]
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Urdaneta Morán, Octaban José. Listeria monocytogenes IN BIVALVE MOLLUSCS IN DIFFERENT SALES DISTRIBUTED IN THE CITY OF MARACAIBO – VENEZUELA. Trabajo de Grado para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. División de Estudios para Graduados. Maestría en Microbiología. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia. Maracaibo 2013. p. 63.
ABSTRACT
One of the most important public health worldwide are foodborne diseases that negatively affect not only economic productivity but also to consumers. Among this group of diseases is human listeriosis which is caused by the Gram-positive bacterium L. monocytogenes. One of the products with a high risk of being contaminated by L. monocytogenes are bivalve molluscs, by their physiology, may be contaminated to concentrate or during packaging and storage, either because the bacteria product packaged for sale or contact of these with other products contaminated with utensils and equipment used to pack molluscs. Objective: To detect Listeria monocytogenes in bivalve molluscs distributed in different outlets of the city of Maracaibo - Venezuela, evaluate the percent recovery of Listeria monocytogenes by inoculation of bivalve molluscs using the technique described in the COVENIN 3718:2001. Methodology: COVENIN and immunoassay for the detection of L. monocytogenes. Results: There were no positive results for L. monocytogenes. Conclusions: The minimum value detected by COVENIN 3718:2001 for the detection of Listeria monocytogenes in bivalve molluscs is 1x104 UFC/g. Keywords: Listeria monocytogenes, listeriosis, bivalves mollusks. E-mail: [email protected]
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INTRODUCCIÓN
1. Genero Listeria
Listeria monocytogenes se ha clasificado en el Dominio: Bacteria, Filo: Firmicutes,
Clase: Bacilli, Orden: Bacillales, Familia: Listeriaceae, Genero: Listeria. Hasta el año
2007, seis especies de Listeria habían sido publicadas en la lista de validación de la
Revista Internacional de la Sistemática y Evolutiva Microbiológica (IJSEM, por sus
siglas en inglés): Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii (subsps.
ivanovii y londoniensis), Listeria seeligeri, Listeria grayi y Listeria welshimeri. En el año
2010 Listeria marthii es validada como especie (Graves y col, 2010) y recientemente se
ha validado Listeria rocourtiae (Leclercq y col, 2010).
Únicamente dos especies de este género son patogénas: L. monocytogenes
asociada con infección en humanos y animales y L. ivanovii asociada únicamente con
infección en animales (Murray y col, 2006).
El género Listeria son bacilos pequeños, Gram positivos, de extremos
redondeados y con un tamaño de 0,4 a 0,5 µm de longitud. A partir de tejidos animales
o cultivos muy recientes pueden presentar morfología cocoide, mientras que a partir de
cultivos envejecidos se pueden apreciar cadenas cortas o formaciones de empalizadas.
No forman capsula ni esporas, son aerobios-anaerobios facultativos y son catalasa
positiva. Pueden desarrollarse entre -0,4 °C y 45 °C, es decir, que pueden crecer a
temperatura de refrigeración (psicrótrofos). Además, entre otras características
microbiológicas se puede comprobar que con el ensayo de Chirstie, Atkins y Munich-
Petersen (Test de CAMP) estimula la producción de hemolisis, tolera concentraciones
elevadas (10%) de cloruro de sodio y son móviles a 25 °C, pero no a 35 °C (Walker,
1999; Collins y col, 1991).
Listeria tolera condiciones de acidez y de alcalinidad, pudiendo crecer a pH entre
5,5 y 9,6, con un crecimiento óptimo a pH neutro o ligeramente alcalino. Es una bacteria
ampliamente distribuida en la naturaleza, se puede aislar del suelo, materia vegetal en
putrefacción, aguas residuales, pescados, pollos frescos y congelados, vegetales
frescos y congelados, leche no procesada, quesos, desechos de mataderos, así como
del tracto digestivo de humanos y animales asintomáticos (Callejo y col, 2008; Trepat,
12
2002). Es altamente resistente a los efectos de congelación, secado y calentamiento,
característica notoria ya que se trata de una bacteria que no forma esporas (Trepat,
2002). Es un microorganismo muy resistente al calor, lo que permite sobrevivir a
temperaturas de congelación y desecación, también es resistente a altos niveles de
nitritos y ácidos, pudiendo hasta crecer en productos empaquetados al vacío (Davies y
col, 2000).
El genoma de L. monocytogenes fue secuenciado recientemente y posee un
cromosoma circular de 2.944.528pb con un promedio de G + C de 39% (Torres y col,
2005).
Se han identificado 2853 genes, sin embargo al 35.3% de estos no se les conoce
función. L. innocua posee un único cromosoma circular de 3.011.209pb con un
contenido promedio de G + C de 37%. Dentro del género Listeria, las especies L.
innocua y L. monocytogenes presentan alto grado de homología en la secuencia del
RNA ribosomal 16S (RNAr 16S) siendo las de mayor cercanía taxonómica (Torres y col,
2005).
Listeria monocytogenes ha sido aislada de muchos productos marinos, incluidos
crustáceos, moluscos y peces, tanto frescos, como congelados o procesados
culinariamente y después refrigerados o congelados. La presencia de L.
monocytogenes en los productos de pescado ahumado se ha detectado en el 25% de
las muestras analizadas, porcentajes similares se han encontrado en mariscos listos
para el consumo (Guyer y col, 1991).
En langostas, bogavantes y camarones listos para comer se han encontrado
cargas bacterianas bajas (desde 0,2 hasta 2 UFC/g) y en los filetes de pescado
empanados y congelados, listos para el consumo también (< 100 UFC/g), pero en el
pescado ahumado han alcanzado cifras mucho más altas, hasta 104 UFC/g (Montville y
col, 2005, Guyer y col, 1991). Durante la elaboración y almacenamiento de salmón
ahumado se comprobó que el recuento de L. monocytogenes no variaba durante el
marinado y el ahumado, pero durante su almacenamiento a 4-10 ºC alcanzaba cargas
microbianas mucho mayores (Guyer y col, 1991).
La habilidad de Listeria sp., para colonizar y crecer en un amplio rango de
ecosistemas se correlaciona con la presencia de 331 genes que codifican para
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diferentes proteínas de transporte. El número de componentes reguladores del genoma
de Listeria monocytogenes es similar a otras bacterias, tales como Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Clostridium spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,
Lactobacillus spp., Bronchothrix spp., y superior a M. tuberculosis y Neisseria
meningitidis. El análisis de la secuencia de los genomas de L. monocytogenes y L.
innocua revelan una relación filogenética con B. subtilis, lo que sugiere un origen común
para las tres especies (Torres y col, 2005).
El género Listeria está compuesto por bacterias Gram positivas con bajo contenido
G+C, estrechamente relacionado con los géneros Bacillus, Clostridium, Enterococcus,
Streptococcus y Staphylococcus.
2. Serotipificación:
La heterogeneidad en la virulencia de L. monocytogenes ha sido observada en
estudios in vivo (ratón) y en estudios in vitro (cultivos celulares); pero la correlación
entre el nivel de virulencia y el origen o tipo de cepa no ha sido establecida. Sin
embargo, se han encontrado diferencias significativas entre la virulencia de cepas de
origen clínico y de alimento, siendo las primeras las que presentan dosis letales más
bajas. Basados en los antígenos somático (O) y flagelar (H), existen hasta el momento,
13 serovariedades de L. monocytogenes. Sin embargo, tres de ellas (½a, ½b y 4b) han
sido aisladas en más del 90% de los casos de listeriosis humana y animal. Otras
serovariedades, como el ½c, han sido encontrada como contaminantes de alimentos.
Algunas de estas serovariedades son compartidas por L. innocua y por L. seeligeri. L.
innocua está representada sólo por tres serovariedades y es considerada una variante
no patógena de L. monocytogenes.
Entre las serovariedades asociadas a listeriosis, las cepas 4b causan más
del 50% de los casos en todo el mundo, pero las cepas de grupo antigénico ½ (½a, ½b
y ½c) predominan en los aislamientos a partir de alimentos; esto sugiere que las
cepas serotipo 4b están más adaptadas a tejidos de hospedero mamífero que las
cepas del serogrupo ½. Un grupo de cepas relacionadas fenotípica y genómicamente
de la serovariedad 4b fue encontrado como responsables de los brotes más
importantes de listeriosis humana transmitidos por alimentos en California en 1985,
14
Suiza entre 1983 y 1987, Dinamarca entre 1985 y 1987 y Francia en 1992, soportando
la idea de que la patogenia está asociada a ciertos clones de L. monocytogenes (Torres
y col, 2005).
Hoffman en el 2003, encontró una correlación entre las tres serovariedades
relacionadas evolutivamente, que permitió agrupar los aislamientos de L.
monocytogenes y determinar el potencial patogénico para humanos y animales.
Así, un grupo de cepas (serovariedades ½b y 4b) fue aislado de epidemias de
origen alimentario en humanos y de casos esporádicos en humanos y animales. Otro
grupo de cepas (serovariedades ½a, ½c y 3a) fueron aisladas únicamente de casos
esporádicos en humanos y animales y un tercer grupo (serovariedad 4b) aislado de
casos esporádicos en animales (Torres y col, 2005).
Existen diferencias en el tropismo patogénico entre cepas de L. monocytogenes.
En humanos, por ejemplo, las cepas serovariedad 4b han sido aisladas de fetos más
que de casos no asociados con el embarazo. En ovejas, las dos formas clínicas de
infección por L. monocytogenes, meningoencefalitis y aborto, no ocurren
simultáneamente en el mismo rebaño. En un estudio realizado entre Enero y Agosto del
2002 por el Laboratorio de Salud Pública del Distrito Capital (Bogotá, Colombia) en
muestras de derivados cárnicos tipo jamón, procedentes de diferentes hospitales del
Distrito, se aislaron las serovariedades 4b y ½b, siendo la serovariedad 4b la
predominante (Torres y col, 2005).
3. Población en riesgo
L. monocytogenes posee predilección por personas con inmunidad celular
disminuida, las poblaciones de riesgo son: mujeres en estado de gravidez, ancianos,
neonatos y personas inmunocomprometidas (cáncer, transplantes renales, SIDA,
diabetes, terapias inmunosupresoras, alcoholismo). La listeriosis en adultos excepto
mujeres embarazadas, es asociada en muchos casos (>75%) con: neoplasias
(leucemia, linfoma o sarcoma) y quimioterapia antineoplásica, terapia inmunosupresora
(transplante de órganos o uso de corticoides), enfermedad hepática crónica (cirrosis o
alcoholismo), endocarditis, enfermedad del riñón, diabetes y enfermedad del colágeno
(lupus) (Torres y col, 2005).
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La infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es también un factor
de riesgo para listeriosis. El SIDA es una condición de predisposición que oscila entre el
5 y el 20% de los casos de listeriosis en adultos, excepto mujeres embarazadas. El
riesgo de contraer listeriosis es de 300 a 1000 veces mayor para pacientes con VIH que
para la población general. Aunque muchos de los casos son asociados con factores de
riesgo, hay algunos pacientes adultos donde los factores de predisposición no han sido
determinados (Torres y col., 2005).
La gastroenteritis febril es la manifestación propia del inmunocompetente; ocurre
durante los brotes y requiere de un gran inóculo bacteriano; la tasa de ataque puede
variar entre 50 y 100%; el período de incubación oscila entre 6 y 240 horas, con un
promedio de 24 horas; los síntomas duran dos a tres días y la recuperación es
completa. En un inmunocompetente no es necesario tratar el cuadro, que muchas
veces es asintomático (Olivares, 2009).
4. Características clínicas de la listeriosis humana
Dos formas básicas de presentación de listeriosis pueden distinguirse: listeriosis
perinatal y listeriosis en el paciente adulto. En ambas instancias, las formas clínicas
predominantes corresponden a infección diseminada o infección local en el sistema
nervioso central (SNC). Los alimentos contaminados son la mayor fuente de infección
tanto en casos esporádicos como epidémicos.
La dosis mínima requerida de Listeria monocytogenes para causar infección
clínica en humanos no ha sido determinada, sin embargo el gran número de L.
monocytogenes detectado en los alimentos responsabilizados de casos esporádicos y
epidémicos de listeriosis (106) sugiere que es alta. Niveles de 102 a 104 células de L.
monocytogenes por gramo de alimento han sido asociados con listeriosis en humanos,
especialmente en pacientes inmunosuprimidos, ancianos y mujeres embarazadas. Sin
embargo, la dosis infectiva puede variar dependiendo de la patogenicidad y virulencia
de la cepa involucrada y los factores de riesgo y susceptibilidad del hospedero. La dosis
infectiva de L. monocytogenes depende de factores como el estado inmunológico del
paciente, la concentración de patógeno en el alimento, la virulencia de la cepa, y la
cantidad de alimento consumido.
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El curso clínico de la infección usualmente comienza alrededor de 20 horas
después de la ingestión del alimento contaminado. El período de incubación para la
enfermedad invasiva es generalmente entre 20 y 30 días. Períodos de incubación
similares han sido reportados en animales tanto para la enfermedad gastroentérica
como para la invasiva. Los síntomas gastrointestinales como naúseas, vómito y diarrea
pueden preceder a formas más serias de listeriosis o pueden aparecer de 9 a 48 horas
luego de la infección. El período de incubación en personas adultas es de 3 a 70 días,
en bebés infectados al momento de nacer el período de incubación es de 1 a 4
semanas después del nacimiento.
La listeriosis fetomaternal y listeriosis neonatal resultan de la transmisión de la
infección madre-feto por vía transplacentaria y desarrollo de corioamnionitis. La mayoría
de los casos de listeriosis en el feto ocurren después del quinto mes de embarazo,
aunque se han presentado casos de infecciones tempranas que ocasionan daños en el
embrión (Silver, 1998). La listeriosis materna puede precipitar el trabajo de parto y
provocar un óbito fetal o un parto pretérmino de un feto infectado. La mujer puede
portar el microorganismo en el tracto genital por algún tiempo, ocasionando
complicaciones en embarazos posteriores (Schuchat, 1991).
La infección neonatal por Listeria monocytogenes se puede manifestar en dos
formas:
a) Listeriosis de inicio temprano: El período de incubación es de 1.5 días y la
infección ocurre en útero; se asocia con aborto espontáneo, nacimiento prematuro, bajo
peso al nacer, bronconeumonía o septicemia al nacimiento, o muerte del recién nacido
por una infección diseminada conocida como granulomatosis infantiséptica,
caracterizada por la presencia de microabscesos piogranulomatosos diseminados
particularmente en hígado, bazo y vellosidades coriónicas; con mortalidad del 35 al
10%. Los síntomas generalmente incluyen dolor pulmonar, debilitamiento del corazón,
deficiencias respiratorias, cianosis, vómito, convulsiones y descarga temprana del
meconio. Las madres de estos productos con frecuencia tienen antecedente de
infección tipo influenza con fiebre o infección de vías urinarias en las semanas que
preceden el parto. Durante esta etapa los cultivos de sangre materna son positivos para
L. monocytogenes.
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b) En menor frecuencia se observa la listeriosis neonatal tardía (10 al 15% de
casos perinatales), generalmente ocurre de 1 a 8 semanas post-parto e involucra
síndrome febril acompañado por meningitis y en algunos casos gastroenteritis y
neumonía, presumiblemente como resultado de la aspiración de exudados
maternales contaminados durante el parto, aunque se han reportado casos en
donde la enfermedad es adquirida mediante transmisión horizontal por fomites o por
personal médico en unidades neonatales, con mortalidad del 13 al 43% en pacientes
tratados y de 100% en pacientes no tratados. La mortalidad en casos de listeriosis
neonatal es baja (10-20%), pero puede dejar secuelas como hidrocefalia o retardo
psicomotor.
L. monocytogenes es una de las tres causas principales de meningitis bacterial en
neonatos; en adultos, afecta el sistema nervioso central en un 55 a 70% de los casos,
normalmente se desarrolla como una meningoencefalitis acompañada por trastornos
severos de la conciencia, desórdenes en el movimiento y en algunos casos parálisis en
los nervios craneales. Cuando L. monocytogenes es diseminada vía sanguínea al
sistema nervioso central, puede ocasionar meningitis supurativa aguda, cerebritis focal
o multifocal, meningoencefalitis, absceso cerebral o espinal y listeriosis bulbar o
romboencefalitis.
La listeriosis es comúnmente caracterizada por formación de listeromas y necrosis
focal. El tamaño, número y sitio de las lesiones varía de persona a persona y está
relacionado con el modo de infección, la dosis del microorganismo, la edad y la
resistencia del paciente. La forma encefalítica en la cual el microorganismo es aislado
con dificultad del fluido crebroespinal, es común en animales pero rara en humanos. El
curso de la enfermedad es usualmente bifásico, con una fase subfebril inicial de 3 a 10
días en las cuales se presentan dolores de cabeza, desórdenes visuales, malestar
general; seguida por una segunda fase de síntomas severos de romboencefalitis
(Vázquez y col, 2001).
El porcentaje de mortalidad por infecciones en el sistema nervioso
central es alrededor del 20% pero pueden llegar a elevarse hasta un 40-60% si está
asociado con enfermedades recurrentes que debilitan el sistema inmune.
Se ha estimado que el 10% de la población que adquiere meningitis bacteriana es
causada por L. monocytogenes. Debido a la efectiva vacunación contra Haemophylus
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influenzae; L. monocytogenes es ahora la causa más común de infección meningeal en
adultos después de Streptoccocus pneumoniae, Neisseria meningitidis y el
Streptococcus del grupo B.
Sin embargo, en ciertos grupos de alto riesgo, como pacientes con cáncer, L.
monocytogenes es la principal causa de meningitis bacteriana. Otra forma clínica
frecuente de listeriosis en algunos pacientes, es la bacteriemia o septicemia (15 del
50% de los casos), con un alto porcentaje de mortalidad hasta de 70%, si está asociado
con enfermedades recurrentes que debilitan el sistema inmune. Existen otras formas
clínicas atípicas en el 5 al 10% de los casos, como la endocarditis (tercera forma más
frecuente), miocarditis, arteritis, neumonía, pleuritis, hepatitis, colecistitis, peritonitis,
abscesos localizados, artritis, osteomielitis, sinusitis, otitis y conjuntivitis.
Se ha identificado una forma primaria de infección cutánea por L. monocytogenes
la cual es caracterizada por una erupción piogranulamotosa; esta forma ocurre
esporádicamente entre granjeros y veterinarios y se adquiere por contacto directo con
el tracto genital o la placenta de vacas que han abortado debido a infección por Listeria
(Torres y col, 2005).
5. Sensibilidad a antibióticos
El patrón de sensibilidad a los antibióticos de L. monocytogenes ha permanecido
relativamente estable con el paso de los años. Generalmente, este microorganismo es
sensible “in vitro” a una amplia gama de antibióticos como penicilina, ampicilina,
gentamicina, eritromicina, tetraciclinas, rifampicina, cotrimoxazol y vancomicina. Las
fluorquinolonas y las cefalosporinas actuales presentan una pobre actividad,
especialmente las de tercera y cuarta generación como cefotaxima y cefepima; todas
las cepas de Listeria monocytogenes son resistentes a fosfomicina. Se ha descrito
resistencia a macrólidos y tetraciclinas en algunos aislamientos; que suelen estar
codificadas por plásmidos, aunque también hay casos de resistencia a tetraciclinas
codificada cromosómicamente.
La rifampicina posee buena actividad “in vitro” pero selecciona cepas resistentes
durante el tratamiento con mucha facilidad. Aunque se han descrito fracasos clínicos en
tratamientos con penicilina o ampicilina, no se ha encontrado ninguna cepa resistente a
estos antibióticos. La mayor parte de los antibióticos se comportan como
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bacteriostáticos frente a L. monocytogenes. En particular los ß-lactámicos tienen un
gran intervalo entre la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima
bactericida (CMB). Sólo se ha observado actividad bactericida en los aminoglucósidos,
glucopéptidos y cotrimoxazol (Torres y col., 2005).
6. Listeria en alimentos
Los alimentos que presentan mayor riesgo de contaminación con Listeria
monocytogenes son los productos listos para consumir, por ser alimentos con un tiempo
de conservación prolongado a temperaturas de refrigeración y que se consumen sin ser
sometidos a un adecuado calentamiento que permita la eliminación del microorganismo
(Miettinen y col., 2001). La presencia de Listeria se ha podido detectar en una gran
variedad de productos cárnicos, pescados y mariscos, leche y productos lácteos,
ensaladas y vegetales (Harvery y col., 1989; Pignato y col., 1995; Walker, 1999),
alimentos que tienen en común un alto grado de procesamiento y periodos de
maduración que permiten el crecimiento de L. monocytogenes. Las infecciones o
intoxicaciones alimentarias provocadas por L. monocytogenes poseen una gran
importancia en países desarrollados, donde la industrialización se ha observado como
factor que favorece la diseminación de este patógeno (Molero y col., 2006).
Los productos extraídos del mar constituyen una proporción muy importante de los
recursos alimenticios a escala mundial. La actividad económica relacionada con la
explotación de los criaderos naturales de moluscos bivalvos y el cultivo artificial tiene
una gran importancia en la Comunidad Europea (Pina, 2001).
El aumento de los aportes de aguas residuales al mar, debido al fuerte incremento
de la población y a la actividad industrial han comprometido la calidad sanitaria de las
zonas costeras. Esta situación no solo conlleva cambios importantes en las
características físico-químicas y biológicas del ecosistema marino, sino que constituye
un riesgo potencial para la salud pública derivado del consumo directo de organismos
marinos y de las actividades recreativas que se realizan en las aguas costeras
contaminadas por aguas residuales. Independientemente del comercio, la recolección
no controlada se desarrolla a lo largo de todo el litoral, y es precisamente esta actividad,
con el consiguiente consumo directo, sin los debidos controles sanitarios y sin ser
sometidos a depuración, lo que puede representar una vía de transmisión de ciertas
enfermedades (Pina, 2001).
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Los moluscos bivalvos son animales de carácter sedentario y de régimen
alimentario exclusivamente filtrador. Las branquias cubiertas de mucus y cilios
vibrátiles, además de cumplir con la función respiratoria, retienen las partículas en
suspensión, entre ellas, bacterias, virus y protistas planctónicos (Di Girolamo y col.,
1977). Asimismo las materias en solución contenidas en el agua también son
absorbidas e incorporadas a su organismo. Los productos ingeridos siguen los
siguientes caminos:
a) la materia orgánica, ciertos protistas planctónicos, sales minerales, factores de
crecimiento, constituyen su propio alimento que es asimilado por el animal,
distribuyéndose por toda sus anatomía (Pina, 2001).
b) otros microorganismos son retenidos en el tracto digestivo o en el aparato
filtrador, y generalmente no suelen ser nocivos para el animal, si bien en algunas
ocasiones pueden representar un riesgo para la salud del hombre en el caso de que
hayan acumulado bacterias patógenas, virus animales o biotoxinas producidas por
dinoflagelados (Pina, 2001).
Los bivalvos poseen un elevado ritmo de bombeo, que se ha estimado entre 0,5 y
4 litros por hora, dependiendo de su tamaño y de las condiciones ambientales, por lo
que constituyen verdaderos concentradores biológicos. Los animales fisiológicamente
activos son capaces de acumular virus muy rápidamente (Pina, 2001).
Varios patógenos bacterianos están involucrados en toxi-infecciones alimentarias
asociadas con el consumo de mariscos (Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia,
Clostridium, Vibrio, Plesiomonas, Aeromonas, Escherichia coli), aunque son los virus la
causa más frecuente (Lipp y Rose, 1997). Se han descrito en todo el mundo numerosos
brotes de hepatitis A asociados al consumo de bivalvos (Lipp y Rose, 1997; Lees,
2000), entre ellos el ocurrido en Shanghai (China) en 1988 donde se documentaron
300.000 casos relacionados con la ingestión de almejas recogidas en una zona que
recibía aportes de agua residual (Halliday y col., 1991). El consumo de bivalvos se ha
relacionado con el 70% de las hepatitis de tipo A diagnosticadas en Italia, 19% en
Alemania, 25% en el Reino Unido y el 11% en Japón (Lees, 2000).
Las gastroenteritis a menudo son también una consecuencia directa del consumo
de moluscos bivalvos contaminados con virus de Norwalk. En el Reino Unido, entre
21
1965 y 1983, el 37% de los brotes infecciosos declarados relacionados con el consumo
de bivalvos fueron causados por virus pequeños redondos, el 17% por el virus de la
hepatitis A y en el 43% no se identificó el agente (Lees, 2000).
Datos epidemiológicos recogidos han demostrado estacionalidad en la aparición
de infecciones producidas por el consumo de moluscos bivalvos, siendo más
predominantes en los meses fríos (Lees, 2000).
Las especies del género Listeria no parecen ser causa de infecciones en los
alimentos de origen marino y, no tienen en éstos a un reservorio natural. Sin embargo,
se ha señalado que se encuentran en sedimentos de ríos y en las aguas tanto dulces
como marinas, por lo que pueden hallarse en estos alimentos como un contaminante
proveniente del medio acuático (Méndez, 2011).
Estudios realizados sobre la incidencia de L. monocytogenes en organismos
marinos en Venezuela son pocos y sólo se han enfocado hacia el estudio del
crecimiento e identificación del microorganismo a nivel de pescados frescos y salados,
quesos, embutidos, y en vegetales mínimamente procesados (De Curtis y col., 2002;
Martínez y col., 2004; Villalobos y col., 2007; García y col., 2009).
7. Métodos de Aislamiento de Listeria monocytogenes
En la actualidad existen varios métodos convencionales y rápidos disponibles para
la detección e identificación de L. monocytogenes en muestras de alimentos.
A pesar de los avances conseguidos en el aislamiento de L. monocytogenes a
partir de alimentos, todavía existe la posibilidad de mejorar en diversas áreas. Ningún
procedimiento se puede considerar lo suficientemente sensible para detectar L.
monocytogenes a partir de todos los tipos de alimentos. Además, pueden encontrarse
células de L. monocytogenes en estado subletal en alimentos procesados debido a la
refrigeración, calentamiento, acidificación y otros tipos de tratamientos físicos o
químicos. Estas bacterias en estado subletal necesitan condiciones especiales de
cultivo para reparar el daño, antes de poderse detectar en el cultivo (Organización
Mundial de la Sanidad Animal, 2004).
Los métodos bacteriológicos convencionales son importantes por varias
razones: su empleo permite obtener el microorganismo en cultivo puro, lo que
22
será útil con propósitos reglamentarios; siguen siendo el “patrón de oro” frente a los
cuales se comparan y validan otros métodos. Normalmente estos métodos son muy
sensibles y no requieren equipamiento sofisticado o caro. Algunas desventajas de este
grupo de métodos incluyen el periodo de tiempo relativamente largo que se necesita
para finalizar los protocolos, la experiencia práctica que se precisa en varias
manipulaciones, la necesidad de productos químicos, reactivos y medios muy
diferentes, la posibilidad de que algunos microorganismos contaminantes enmascaren
la presencia de las bacterias diana, incluyendo una posible falta de detección de
variantes típicas del organismo diana y la subjetividad relativa que supone la
interpretación del crecimiento bacteriano en placas de agar con un medio selectivo y
diferencial (Andrews, 2002).
El aislamiento e identificación de L. monocytogenes a partir de alimentos,
muestras medioambientales y muestras clínicas procedentes de animales, requiere el
uso de agentes selectivos y procedimientos de enriquecimiento que mantengan los
niveles de microorganismos contaminantes en valores razonables y permitan la
multiplicación de L. monocytogenes hasta niveles que sean suficientes para poder
detectarla.
Con este fin, en los primeros tiempos de la bacteriología clínica listeriana, se
utilizaba regularmente el enriquecimiento en frío, explotando la capacidad del
microorganismo de multiplicarse a temperaturas de refrigeración, mientras que las
bacterias contaminantes no se desarrollarían bajo estas condiciones. Sin embargo,
dicho procedimiento necesita tiempos de incubación muy largos, a menudo meses, por
lo que resulta inadecuado para las investigaciones actuales de brotes de transmisión
alimentaria y de casos esporádicos, tanto como para la puesta en práctica de
programas efectivos de análisis de riesgos y control de puntos críticos en las plantas de
procesamiento y producción de alimentos.
Se han incorporado compuestos selectivos en los medios de cultivo que permiten
el crecimiento de L. monocytogenes a temperaturas de incubación normales; de este
modo se acorta el tiempo requerido para el desarrollo selectivo del microorganismo.
Ejemplos de estos compuestos selectivos son la cicloheximida, colistina, cefotetan,
fosfomicina, cloruro de litio, ácido nalidíxico, acriflavina, feniletanol, ceftazidima,
polimixina B y moxalactam (Organización Mundial de la Sanidad Animal, 2004).
23
Los métodos convencionales para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de
alimentos que han ganado aceptación con propósitos reglamentarios internacionales
son el método de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA
por sus siglas en ingles), el método oficial de la Asociación Oficial de Químicos
Analistas (AOAC por sus siglas en ingles), los Estándares ISO 11290, el método del
Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria (FSIS por sus siglas en ingles) del
Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA por sus siglas en ingles) y
los Estándares franceses.
Dependiendo de la naturaleza de la muestra, un método particular puede ser más
adecuado que otro. El Comité Técnico de la Organización Internacional para la
Estandarización ISO/TC 34, Subcomité SC 9, Microbiología, de Productos
Agroalimentarios, afirma que el Estándar ISO 11290, partes 1 y 2 puede utilizarse para
la detección de L. monocytogenes en una gran variedad de alimentos y productos
alimenticios. Aunque reconocen que este estándar puede no ser el más apropiado en
ciertos casos, recomiendan que se lleve a cabo el máximo esfuerzo para aplicar este
método, en lo posible.
Los métodos de la FDA y de la AOAC pueden utilizarse para el análisis de la leche
y los productos lácteos. El método del USDA-FSIS se recomienda para la carne roja y
carne de ave (cruda o lista para comer), huevos y derivados y muestras
medioambientales (Organización Mundial de la Sanidad Animal, 2004).
Estos métodos de cultivo convencional conllevan un procedimiento de
enriquecimiento basado en la utilización de medios de cultivo líquidos que contengan
agentes selectivos. La naturaleza de los medios y los agentes selectivos varían con el
método. Los métodos de la FDA, ISO y la norma COVENIN incluyen una etapa de
preenriquecimiento para tratar de recuperar las células de L. monocytogenes en estado
subletal, mientras que en los métodos del USDA-FSIS y de la AOAC las muestras se
procesan directamente en caldo de enriquecimiento. En el caso del método de la FDA,
el pre-enriquecimiento se lleva a cabo a 30°C durante 4 horas en caldo tripticasa-soya
con extracto de levadura (TSB-YE) sin agentes selectivos. El protocolo ISO emplea un
“enriquecimiento primario” durante 24 horas a 30°C en presencia de agentes selectivos,
pero a la mitad de concentración (“caldo Fraser a la mitad”) (Organización Mundial de la
Sanidad Animal, 2004; Comisión Venezolana de Normas Industriales, 2001).
24
Las muestras se enriquecen durante 24–72 horas a 30°C, 35°C ó 37°C,
dependiendo del método. El método de la FDA emplea TSB YE con acriflavina, ácido
nalidíxico y cicloheximida. El método del USDAFSIS utiliza dos etapas de
enriquecimiento: el enriquecimiento “primario” se realiza en medio de la Universidad de
Vermont (UVM) y contiene ácido nalidíxico y acriflavina; el enriquecimiento “secundario”
se lleva a cabo en caldo Fraser con ácido nalidíxico, cloruro de litio y acriflavina. El
estándar ISO indica el caldo Fraser para el enriquecimiento “secundario” con agentes
selectivos a la concentración normal, mientras que el enriquecimiento “primario” se lleva
a cabo en “caldo Fraser a la mitad”, como se indicó anteriormente. El método EOAC y la
Norma COVENIN consideran el enriquecimiento selectivo en caldo triptona de soja que
contenga acriflavina, ácido nalidíxico y cicloheximida (“medio de enriquecimiento
selectivo”).
Después del enriquecimiento selectivo, los cultivos se siembran en placas
de agar con un medio selectivo/diferencial para el aislamiento de las colonias
presuntivas de L. monocytogenes. Todos los métodos utilizan el agar de
Oxford, a excepción del método del USDA-FSIS, que emplea una fórmula
modificada del agar de Oxford (MOX). El agar de Oxford contiene cloruro de litio,
cicloheximida, colistina, acriflavina, cefotetan y fosfomicina como agentes selectivos, y
las colonias de Listeria spp. son pequeñas, negras y rodeadas de un halo negro.
Además del agar de Oxford, el método de la FDA incluye cloruro de
litio/feniletanol/moxalactam (LPM) o agar PALCAM y el estándar ISO y la Norma
COVENIN incluyen este último, que contiene cloruro de litio, polimixina B, acriflavina y
ceftazidima. El agar MOX, empleado en el método del USDA-FSIS, contiene cloruro de
litio, colistina y moxalactam (Organización Mundial de la Sanidad Animal, 2004;
Comisión Venezolana de Normas Industriales, 2001).
Las colonias típicas de Listeria spp., una vez crecidas en el medio
selectivo/diferencial, se seleccionan para su identificación a nivel de especie, utilizando
una batería de pruebas. Estas pruebas comprenden la reacción a la tinción de Gram, la
catalasa, los ensayos de movilidad (en una muestra en fresco observada por
microscopía de contraste de fases y después de su inoculación en un medio de prueba
de movilidad), de hemólisis y de utilización de carbohidratos. (Organización Mundial de
la Sanidad Animal, 2004).
25
7.1. Métodos de identificación rápida
Existe una serie de métodos para la determinación de Listeria monocytogenes en
diversos tipos de muestras:
MICRO-ID Listeria: Es un sistema disponible comercialmente que ha sido
validado por la AOAC (método 992.18) para la identificación presuntiva de las especies
de Listeria aisladas a partir de muestras ambientales y de alimentos. Supone una
alternativa a las pruebas bioquímicas convencionales de los aislados de Listeria spp.
mediante los métodos de la FDA y del USDA-FSIS. Se basa en el principio de que el
inóculo de la prueba contiene enzimas preformados que pueden detectarse después de
24 horas de incubación a 37°C. La diferenciación de las especies de Listeria se basa en
un derivado del código octal después de introducir los valores numéricos de cada grupo
de tres pruebas y en las reacciones obtenidas a partir de la prueba CAMP y las
características de hemólisis, que se ensayan por separado.
Sistema de identificación microbiana automatizada Vitek (Vitek Automicrobic
System): El Vitek Automicrobic System, es un sistema automatizado de identificación
microbiana que puede emplearse para la identificación presuntiva de las especies de
Listeria de transmisión alimentaria y para la detección de aislados diferentes a Listeria.
La AOAC lo ha validado como método 992.19. El sistema utiliza una cámara incubadora
con un lector óptico, una unidad de llenado/sellado para la inoculación del kit de la
prueba y un ordenador. Cada tarjeta de identificación de las bacterias Gram-positivas
(GPI) y de las Gram-negativas (GNI+) contiene 30 pruebas bioquímicas. Los cambios
se analizan mediante el ordenador, que asigna al microorganismo problema un género
y/o una especie. La identificación de las especies de Listeria requiere la utilización de
una tarjeta GPI y dos reacciones con la tarjeta GNI+. Sin embargo, para la identificación
de algunas listerias el análisis debe llevarse a cabo mediante la prueba CAMP, el
ensayo de hemólisis y/o la prueba de reducción de nitratos, como se describe en el
método de la FDA.
Otros métodos disponibles comercialmente para la identificación de
especies de Listeria incluyen el API LISTERIA, el MICROBACT 12L, el Sistema
MicroLog, el Sistema de Identificación Microbiana Sherlock (Microbial ID; basado en
patrones de ácidos grasos) y el Sistema Walk/Away (Organización Mundial de la
Sanidad Animal, 2004).
26
7.2. Métodos inmunológicos de detección rápida
Se han desarrollado varios métodos inmunológicos para identificar L.
monocytogenes en alimentos (Organización Mundial de la Sanidad Animal, 2004). Los
siguientes métodos disponibles comercialmente están validados por uno o más
sistemas oficiales de validación, entre estos se encuentran:
Inmunoensayo Enzimático con anticuerpos altamente específicos (Validado por
la Asociación Francesa de Normalización y la Norma ISO 16140): es un ensayo
enzimático, altamente específico para Listeria monocytogenes ya que detecta antígenos
producidos únicamente por Listeria monocytogenes.
Enzimoinmunoensayo colorimétrico monoclonal (validado por la AOAC): se ha
diseñado para la detección de Listeria spp. en productos lácteos, carnes y mariscos.
Como en la prueba se utilizan anticuerpos monoclonales (MAbs) pueden producirse
reacciones cruzadas con otras Listeria spp., por tanto, la prueba no es confirmatoria
para Listeria monocytogenes.
Método colorimétrico de detección mediante un enzimoinmunoensayo policlonal
(validado por la AOAC): se ha diseñado para la detección de Listeria spp. en productos
lácteos, mariscos, carne de ave y carnes (excepto carne cruda picada) y verduras de
hoja. No es confirmatoria para Listeria monocytogenes.
Ensayo visual de inmunoprecipitación (validado por la AOAC): puede utilizarse
para la detección de L. monocytogenes y otras Listeria spp. en productos lácteos,
carnes rojas, cerdos, aves y productos derivados, mariscos, frutas, verduras, frutos
secos, pastas, chocolate, huevos y harina de huevos.
Método de detección mediante ensayo VIDAS LIS (validado por la AOAC,
Asociación Francesa de Normalización y por el Plan de Evaluación de los Métodos
Microbiológicos Europeos): se emplea para la detección de productos lácteos, verduras,
mariscos, carnes crudas y de aves, así como para la detección de Listeria spp. en
carnes procesadas y de ave.
8. Normas que rigen la calidad microbiológica en los alimentos
El control microbiológico de los alimentos se basa en la determinación de grupos
de microorganismos denominados indicadores (recuento de: mesófilos aerobios,
27
anaerobios, hongos, levaduras, coliformes totales y fecales), que como su nombre lo
señala, son indicadores de la forma higiénico-sanitaria en que se lleva a cabo el
proceso de transformación de la materia prima hasta el producto final (Arenas, 1995)
Para el transporte, procesamiento, comercialización y consumo de los bivalvos es
un requisito indispensable la realización de pruebas microbiológicas y toxicológicas, que
garanticen la inocuidad del producto (González y col, 2009). Los análisis
microbiológicos que se llevan a cabo para detectar microorganismos patógenos,
constituyen un medio importante para proteger al consumidor y de asegurar que se está
adquiriendo un producto libre de microorganismos patógenos (Quiñones y col, 2000). El
estudio de la calidad microbiana en los moluscos bivalvos requiere atención especial a
fin de reducir los riesgos de los consumidores (Muñoz y col., 2008).
Las normas que rigen y establecen los parámetros que permiten determinar la
calidad de productos alimenticios derivados de moluscos bivalvos, son diferentes
dependiendo del país.
En Venezuela, la Comisión Venezolana de Normas Industriales (COVENIN),
establece los requisitos que deben presentar los alimentos en cuanto a la presencia de
L. monocytogenes (COVENIN 3718:2001: Aislamiento e Identificación de Listeria
monocytogenes en alimentos). En los Estados Unidos de Norteamérica, el ente
encargado de establecer los requisitos en cuanto a la presencia de este patógeno es la
FDA. Por su parte, la Comunidad Económica Europea, es la organización encargada de
establecer los parámetros microbiológicos de los alimentos expendidos en esta
comunidad, cuya resolución dictada para este fin es la C (2010) 7516.
La Gaceta Oficial de la República Bolivariana de Venezuela N° 303.927, es la
normativa vigentes para medir establecer la calidad microbiológica de los moluscos
bivalvos, conteniendo solo como indicadores de contaminación al grupo de los
coliformes fecales, E. coli y Salmonella
28
CAPÍTULO I
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
29
CAPÍTULO I
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
1. Objetivo General
Detectar Listeria monocytogenes en molusco bivalvos distribuidos en diferentes
expendios de la ciudad de Maracaibo – Venezuela.
2. Objetivo Específico
1. Estandarizar el inoculo de Listeria monocytogenes mediante curvas de
crecimiento.
2. Evaluar el porcentaje de recuperación de Listeria monocytogenes mediante la
inoculación de moluscos bivalvos utilizando la técnica descrita en la Norma COVENIN
3718:2001.
3. Identificar cepas de Listeria monocytogenes en molusco bivalvos distribuidos en
diferentes expendios de la ciudad de Maracaibo – Venezuela mediante la norma
COVENIN 3718:2001.
4. Detectar cepas de Listeria monocytogenes en molusco bivalvos distribuidos en
diferentes expendios de la ciudad de Maracaibo – Venezuela mediante la técnica de
inmunoensayo enzimático (ELISA).
5. Establecer la frecuencia de Listeria monocytogenes en los moluscos bivalvos
expendidos en la Ciudad de Maracaibo.
6. Relacionar la frecuencia de Listeria monocytogenes con microorganismos
indicadores de contaminación fecal y Salmonella.
30
CAPÍTULO II
METODOLOGÍA
31
CAPÍTULO II
METODOLOGÍA
1. Estandarización del Inóculo
Una cepa ATCC 19115 de Listeria monocytogenes, se sembró en un Caldo Soya
Tripticasa con Extracto de Levadura (STYE) y se incubó en aerobiosis por 18 a 24 h a
35 - 37 °C. De este crecimiento se tomó 1 mL y se agregó en una fiola con 50 mL de
STYE debidamente esterilizado y se incubó en agitación constante (1000 rpm) por 12 h
a 35 °C.
En el tiempo “0 horas” (momento en que se agrega el inóculo a la fiola) y en el
tiempo “1,5 h”, se sembraron placas de agar STYE con 1 mL y 0,1 mL del crecimiento
bacteriano para hacer el contaje de las UFC/mL.
En el tiempo “3 h” y “4,5 h” se inocularon placas con 0,1 mL, y con diluciones de
10-2 y 10-4 del concentrado bacteriano. Por su parte, en los tiempos “6 h” y “7,5 h” se
sembraron las placas con diluciones de 10-2, 10-4 y 10-6 a partir del crecimiento
bacteriano. Para los tiempos “9 h” y “10,5 h” se hicieron diluciones de 10-4, 10-6 y 10-8
y el resultado de estas se sembraron en placas con agar STYE. Al cabo de las “12 h” se
hicieron diluciones de 10-4, 10-6 y 10-8 para sembrar en agar STYE para el contaje en
placa.
En todos los tiempos se midió Densidad Óptica (DO) a una longitud de onda de
600 nm utilizando como blanco caldo STYE.
Los datos obtenidos a partir de la DO y de las UFC/mL se graficaron para conocer
la curva de crecimiento de Listeria monocytogenes.
2. Población y Muestra
La población estuvo conformada por la totalidad de establecimientos en los que se
expenden moluscos bivalvos (almejas y mejillones) en la Ciudad de Maracaibo – Estado
Zulia. Previamente se realizó un estudio de distribución de estos organismos y se
encontró la presencia en cuatro establecimientos que se denotaron como A, B, C y D.
32
Las muestras fueron recolectadas tal cual como las adquiere el consumidor final
(Fotografía 1 y 2) entre julio 2010 y septiembre 2011 con una totalidad de 100
muestras, las cuales se transportaron al laboratorio en una cava con hielo a fin de evitar
su descongelación para luego ser procesadas de manera inmediata.
Fotografía 1. Muestras de moluscos bivalvos en los refrigeradores comerciales. Fuente: Propia (2013)
Fotografía 2. Mejillones al alcance del consumidor final. Fuente: Propia (2013)
33
3. Preparación de los Homogeneizados
Los homogeneizados fueron procesados como lo indica la norma COVENIN
3718:2001: Se pesaron 25 gramos del molusco bivalvo agregando todo el contenido
intervalvar (Fotografía 3 y 4) en un envase estéril, y luego se añadieron 225 mL del
medio de enriquecimiento para Listeria (Himedia, India) con los agentes selectivos
incorporados y se homogeneizó por 30 segundos con ayuda de una licuadora, a alta
velocidad (Fotografía 5).
Fotografía 3. Extracción del contenido intravalvar. Fuente: Propia (2013
Fotografía 4. Pesado del contenido intravalvar. Fuente: Propia (2013)
34
4. Determinación del Porcentaje de Recuperación
A fin de conocer el porcentaje de recuperación de L. monocytogenes
siguiendo la técnica convencional descrita en de la Norma COVENIN 3718:2001,
se realizaron seis homogeneizados, en los cuales se agregaron a uno 10 mL del
inóculo estandarizado y al resto diluciones seriadas de 10-2, 10-4, 10-6, 10-8 del
inóculo estandarizado. Por otra parte, se realizó un homogeneizado sin inóculo
(molusco sin Listeria) para ser usado como control negativo. A la par, en un frasco con
caldo de enriquecimiento se inoculó una concentración conocida de Listeria para ser
usado como control positivo (Listeria sin molusco) y así poder evidenciar que no existe
interferencia en el crecimiento de Listeria cuando se encuentra con los moluscos
bivalvos.
Fotografía 5. Proceso de Licuado (Homogenización).Fuente: Propia (2013) A partir de cada uno de los homogeneizados se tomó una alícuota de 0,1 mL y se
hicieron diluciones seriadas (Fotografía 6) a las 0, 24, 48 72 y 96 horas para sembrarlas
en placas de Agar Palcam con el fin de observar el crecimiento de las colonias
características (Fotografía 7) con lo que se pudo obtener la carga microbiana en
UFC/mL.
35
Fotografía 6. Diluciones seriadas de los Homogeneizados. Fuente: Propia (2013)
Fotografía 7. Crecimiento en Agar Palcam de Listeria monocytogenes. Fuente: Propia (2013)
Los datos fueron graficados para que de esta manera se pueda conocer el
porcentaje de recuperación de la técnica establecida en la Norma COVENIN
3718:2001.
36
5. Identificación de Listeria monocytogenes en moluscos
Se realizaron homogeneizados según lo descrito en la Norma COVENIN
3718:2001. A partir del caldo de homogeneizado (Fotografía 8) a las 24, 48 y 72 horas
de incubación, se inocularon con un asa en la superficie de placas con agar Palcam.
Estas placas se incubaron invertidas a 35ºC – 37ºC por 48 ± 2 horas. Al finalizar el
tiempo de incubación se observaron las colonias presuntivas de Listeria
monocytogenes las cuales en Agar Palcam se evidencian de color verde oscuro con un
halo negro con un hundimiento central y de un tamaño de 1,5 – 2 mm (Fotografía 9).
Fotografía 8. Homogeneizado de moluscos bivalvos con caldo de enriquecimiento para
Listeria. Fuente: Propia (2013)
Fotografía 9. Colonias presuntivas de Listeria monocytogenes en Agar Palcam. Fuente: Propia (2013)
37
Luego se transfirieron con una asa tocando el centro de la colonia, 5 ó
más colonias típicas de cada medio selectivo a placas agar STYE, estriando
por agotamiento para obtener colonias aisladas. Se utilizó un control positivo
de L. monocytogenes ATCC 19115. Se incubó a 35 ± 1ºC durante 24 horas
para obtener colonias aisladas en el agar STYE (Fotografía 10).
Fotografía 10. Colonias presuntivas de Listeria monocytogenes en Agar STYE. Fuente: Propia (2013) A partir de cultivos de 24 horas en caldo STYE se realizó una coloración de
GRAM, prueba de motilidad y prueba de hemólisis. En una coloración de GRAM se
observa como bacilos cortos, GRAM positivos que pueden aparecer en forma cocoide.
La prueba de motilidad, se realizó en un medio SIM por punción central y se incubó a
temperatura ambiente por 48 horas hasta 7 días. Un resultado positivo es la
observación de un crecimiento en forma de paraguas. La prueba de hemólisis se
practicó con la ayuda de un asa en punta, sembrando por punción (sin llegar hasta el
fondo) un inóculo denso de Listeria spp, en placas previamente secas de agar sangre
de caballo al 5%.
38
Se dibujó una rejilla en el fondo de la placa, con 20 a 25 cuadros, utilizando un
cuadro para cada cepa y utilizando un control positivo de L. monocytogenes y un control
negativo. Estas placas se incubaron a 35ºC por 48 horas.
Como pruebas secundarias se realizaron: prueba de catalasa y prueba de
fermentación de maltosa, xilosa, manitol, esculina, ramnosa y dextrosa. Para la prueba
de catalasa se tomó un inóculo a partir de caldo STYE, escogiendo una colonia típica,
la cual se ha colocado en una lámina portaobjeto donde previamente se colocó una
gota de solución salina, se mezcló hasta suspender el inóculo y luego se agregó una
gota de agua oxigenada al 3%, dando como resultado positivo la formación de burbujas.
Para la fermentación de maltosa, xilosa, manitol, esculina, ramnosa y dextrosa, se
inoculó a partir del cultivo de caldo tripticasa de soya cada de seis tubos de caldo
púrpura con carbohidratos (0,5% p/v) dextrosa, manitol, esculina, xilosa, maltosa,
ramnosa y otro sin carbohidratos como control. Incubar a 35 – 37 ºC por 5 – 7 días. La
Tabla 1 muestra los resultados característicos de L. monocytogenes
Tabla 1
Características bioquímicas de Listeria monocytogenes.
Prueba Listeria monocytogenes
Coloración de Gram Cocobacilos Gram positivos
Motilidad Positiva
β-Hemolisis Positiva
Prueba de Catalasa Positiva
Fermentacion de maltosa Positiva
Fermentacion de ramnosa Positiva
Fermentacion de dextrosa Positiva
Fermentacion de xilosa Negativa
Fermentacion de manitol Negativa
Fermentacion de esculina Positiva
Fuente: Norma COVENIN 3718:2001
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6. Metodología para detección de Listeria monocytogenes en moluscos bivalvos mediante la técnica de inmunoensayo enzimático (ELISA) La técnica utilizada se basó en un Inmunoensayo Enzimático (ELISA) tipo
sándwich (TRANSIA PLATE Listeria monocytogenes Validado por la Asociación
Francesa de Normalización y la Norma ISO 16140), es un ensayo de fiabilidad el cual
recupera y detecta L. monocytogenes, después de las etapas de enriquecimiento y un
choque térmico que permite la liberación de antígenos de L. monocytogenes. La placa
de microtitulación esta recubiertas con anticuerpos específicos para la proteína P60 de
Listeria monocytogenes.
Se realizaron homogeneizados de las muestras de igual forma como se describió
anteriormente y se transfirieron de 1 a 2 mL de las muestras en viales a fin de llevarlos
a baño de maría a 95-100 °C (ebullición) para darles a las muestras un choque térmico
por 20 min.
Fotografía 11. Homogeneizados en viales. Fuente: Propia (2013)
40
Fotografía 12. Baño de María a 95-100 °C. Fuente: Propia (2013)
Se numeró la cantidad correspondiente de pozos en la placa: dos pozos para el
control negativo, uno para el control positivo y uno para cada muestra, luego se
distribuyó 100 μL de los controles y muestras en los respectivos pozo (Fotografía 13).
Fotografía 13. Distribución de controles y muestras en los pozos de microtitulación. Fuente: Propia (2013)
41
Luego, se agregó 100 μL del conjugado dentro de cada pozo usando una pipeta
automática cuidando de no tocar las extremidades de los pozos con las puntillas, se
mezcló gentilmente el contenido de los pozos con movimientos circulares (Fotografía
14).
Fotografía 14. Distribución del conjugado en los pozos de microtitulación. Fuente: Propia (2013)
Se incubaron a 37 ± 2 ºC por 2 horas (Fotografía 15).
Fotografía 15. Incubación a 37 °C. Fuente: Propia (2013)
42
Se vertió el contenido de la placa a través de movimiento rápido del pulso, para
luego enjuagar cada pozo dejando la solución de lavado dentro de los pozos por 5-10
segundos. Se descartó el líquido de la placa y se removió el restante invirtiendo la placa
sobre papel absorbente, varias veces. El proceso de lavado se repitió cinco veces. Se
agregaron 50 μL del substrato y 50 μL del cromógeno dentro de cada pozo y se dejó
incubar a temperatura ambiente (18 – 25 ºC) por 30 minutos, para luego agregar 50 μL
de la solución stop dentro de cada pozo, siguiendo la misma orden usado
anteriormente, se mezcló el contenido de los pozos, agitando la placa con movimientos
circulares para observar el cambio completo de color (de azul a amarillo). Por último se
procedió a leer la densidad óptica en 450/595 nm usando una lectora de micro placas
STAT FAX 303+ (contra un blanco de aire).
7. Determinación de indicadores de calidad en los moluscos bivalvos
Como indicadores de contaminación fecal, se determinaron Coliformes Totales,
Coliformes fecales o termotolerantes y Escherichia coli por la técnica del Numero Más
Probable (NMP) Igualmente se determinó la presencia de Salmonella en las muestras
analizadas.
8. Determinación de Coliformes Totales y Coliformes fecales o termotolerantes.
Siguiendo la técnica descrita en la Norma COVENIN 1104:1996, en un envase
estéril se pesaron 25 g de la muestra y se agregaron en un frasco que contenía 225 mL
del medio de pre-enriquecimiento (agua peptonada al 0,1%) y se licuó por 60 segundos
(Fotografía 16).
Fotografía 16. Preparación del homogeneizado para Coliformes Totales, Fecales y Escherichia coli. Fuente: Propia (2013)
43
A partir del homogeneizado preparado, se inocularon 15 tubos de Caldo lactosado
(CL) con alícuotas de 10 mL, 1 mL y 0,1 mL (Fotografía 17). Se vorterizaron
suavemente asegurándose que no se formen burbujas dentro de los tubos Durhams.
Estos tubos se incubaron a 35 ± 1 ºC por 24-48 H (Imagen 18) y al finalizar el periodo
de incubación, se traspasó un inóculo de los tubos positivos de CL (gas + crecimiento) a
tubos de caldo Bilis Verde Brillante (CBVB) previamente rotulados (Fotografía 19).
Fotografía 17. Inoculación de tubos con Caldo Lactosado a partir del homogeneizado. Fuente: Propia (2013)
Fotografía 18. Tubos de caldo Lactosado. Fuente: Propia (2013)
44
Fotografía 19. Caldo Bilis Verde Brillante, a la izquierda un tubo negativo y a la derecha uno positivo. Fuente: Propia (2013) Se mezcló con ayuda de un vorter suavemente asegurándose que no se formaran
burbujas dentro de los tubos Durham. Se incubaron los tubos de CBVB en una
incubadora a 35 ºC por 24 – 48 h y los tubos de CEC en Baño de María con agitación a
44,5 ºC por 24 h. Al finalizar el periodo de incubación, se anota la combinación de tubos
positivos (gas+crecimiento).
Se calculó el NMP 100 mL-1 totales y termotolerantes utilizando las combinaciones
de CBVB y CEC, respectivamente utilizando la tabla del Índice de la norma Covenin
(1104-1996).
9. Determinación de Escherichia coli
Siguiendo la técnica descrita en la Norma COVENIN 1104:1996, de los tubos
positivos de la determinación de NMP para la detección de Coliformes Fecales, se
procedió a sembrar placas de agar Eosina Azul de metileno Levine (EMB), estas placas
se incubaron a 35°C ± 1°C durante 24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo se
seleccionaron las colonias de color violeta oscuro o negro, con o sin un brillo metalico y
45
se repicaron en tubos que contenían agar nutritivo a fin de obtener un cultivo puro,
estos tubos se incubaron a 35°C ± 1°C durante 24 ± 2 horas. Luego se realizó una
coloración de Gram.
Se realizaron pruebas confirmatorias como son la producción de indol, rojo de
metilo, Voges Proskauer y la utilización del citrato (IMViC), para verficar la presencia de
E. coli (Tabla 2).
Tabla 2
Características Bioquímicas para Escherichia coli.
Prueba Resultado
Fermentación de lactosa a 35°C y 45°C Positivo
Gram Cocobacilos o bacilos cortos Gram negativo
Indol E. coli I: Positivo E. coli II: Positivo
Rojo de Metilo Positivo
Voges Proskauer Negativo
Citrato Negativo
Fuente: Norma COVENIN 1104:1996. 10. Determinación de Salmonella. Siguiendo la técnica descrita en la Norma COVENIN: 1291:1988 se procedió de la
siguiente manera:
Pre-Enriquecimiento:
En un envase estéril se pesaron 25 g de la muestra y se agregaron en un frasco
que contenía 225 mL del medio de pre-enriquecimiento y se licuo por unos segundos.
El medio de pre-enriquecimiento utilizado fue agua peptonada tamponada. Este
homogeneizado se dejó en reposo por una hora a temperatura ambiente. Se ajustó el
pH a 6,6-7,0 con solución de hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N según el
caso. Se incubó la muestra enriquecida a 35-37ºC por 24 horas.
46
Enriquecimiento:
Después de la incubación, se transfirió 1mL del cultivo en caldo de pre-
enriquecimiento a 10 mL de caldo tetrationato verde brillante (TT) y se incubó de
preferencia a 43 ± 0,5 ºC por 24 horas.
Aislamiento:
Transcurridas las 24 horas de incubación, se transfirió una asada a la superficie de
placas de agar bismuto sulfito (BS) y Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD). Se Extendió
el inoculo de manera tal que se obtengan colonias aisladas. Las placas se incubaron a
35 - 37 ºC por 24 horas. Al final de este tiempo de incubación si no se observó
crecimiento en las placas de Agar BS, incubar por 24 horas más.
Las placas se examinaron en busca de la presencia de colonias presuntivas de
Salmonella de acuerdo a las características de crecimiento de las colonias de los
medios de cultivo utilizados según la Tabla 3.
Tabla 3
Características de Salmonella según el tipo de medio utilizado.
Medio de Cultivo Características
Agar Bismuto Sulfito
Colonias planas marrones o grises a negro, con o sin brillo metálico. El medio que rodea la colonia generalmente es marrón al principio cambiando a negro según transcurre el tiempo de incubación.
Agar Xilosa-
Lisina-Desoxicolato
Colonias incoloras o ligeramente rosadas, con o sin centro negro o pueden ser completamente negras.
Fuente: Norma COVENIN 1291:1988.
Pruebas bioquímicas preliminares:
TSI: Bisel alcalino (rojo) y taco acido (amarillo), con o sin producción de
hidrogeno sulfurado, el cual se manifiesta por el ennegrecimiento total o parcial del
medio.
LIA: se produce una reacción alcalina (púrpura) por descarboxilación de la lisina,
en este medio también puede observarse ennegrecimiento total o parcial o ausente.
47
Pruebas Bioquímicas Confirmatorias:
Los resultados de las pruebas bioquímicas confirmatorias se pueden observar en
la Tabla 4.
Tabla 4
Pruebas bioquímicas confirmatorias para Salmonella
Prueba Salmonella
Coloración de Gram Bacilos cortos pleomórficos Gram negativos
Caldo Urea Negativo
Caldo malonato Negativo a excepción de Salmonella arizonae
(positiva)
Agar Fenilalanina Negativo
Caldo triptonado Negativo
Urea Negativo
Malonato Negativo
Fenilalanina Negativo
Indol Negativo
Fuente: Norma COVENIN 1291:1988.
48
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
49
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Resultado y Discusión
L. monocytogenes ATCC 19115, mantuvo una fase de adaptación de 4,5 horas,
comenzando su fase de crecimiento exponencial al cabo de las 6 horas de iniciado el
ensayo, el cual se mantuvo hasta las 10,5 horas donde comenzó en su fase
estacionaria (Figura 1).
Figura 1. Curva de Crecimiento de Listeria monocytogenes. Fuente: Propia (2013) Basado en este ensayo se logró establecer en lapso de 10 h y una absorbancia de
1,4 para determinar las concentraciones a utilizar. Al inocular las diferentes
concentraciones de L. monocytogenes en los homogenizados con molusco se observó
que la recuperación de L. monocytogenes se hace evidente a partir de la concentración
de 104 (Tabla 5).
0,00E+00
1,00E+10
2,00E+10
3,00E+10
4,00E+10
5,00E+10
6,00E+10
7,00E+10
8,00E+10
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 1,5 3 4,5 6 7,5 9 10,5 12
UF
C/m
l
Ab
so
rban
cia
Tiempo
Abs
UFC/mL
50
Tabla 5
Porcentaje de Recuperación de L. monocytogenes siguiendo la metodología propuesta en la técnica COVENIN 3718:2001.
Concentración UFC/ml
Tiempo (horas)
0 24 48 72 96
101 ND ND ND ND ND
102 ND ND ND ND ND
104 3,1 x 102 (3,1%)
2,9 x 103 (29%)
5 x 103 (50%)
5 x 102 (5%)
1,1 x 103 (11%)
106 6,5 x 104 (6,5%)
5,2 x 106 (520%)
1,5 x 106 (150%)
9 x 105 (90%)
8x 105 (80%)
108 5,2 x 106 (5,2%)
4,9 x 108 (490%)
2,3 x 108 (230%)
NC NC
Control (+) 5,0 x 103
(50%) 9,1 x 103
(91%) 3,7 x 108
(3,7 x 106%) 2,8 x 107
(2,8 x 105%) 6,9 x 106
(6,9 x 104%)
Control (-) ND ND ND ND ND
ND: No Detectado. Control (+): Caldo de enriquecimiento con Listeria monocytogenes (104) sin molusco. Control (-): Caldo de enriquecimiento sin Listeria monocytogenes con molusco. Valores entre paréntesis corresponden a los porcentajes de recuperación. Fuente: Propia (2013) Las concentraciones de 108 y 106 revelaron una recuperación de mas del 100%
del inóculo inicial a las 24 horas, donde el microorganismo mantuvo su multiplicación, a
diferencia de lo ocurrido en el frasco que contenía un inoculo inicial de 104, en el cual
solo se logró recuperar un 29% a las 24 horas y un 50% a las 48 horas. En los frascos
que contenían inóculos iniciales por debajo de 104 no se logró evidenciar el crecimiento
de L. monocytogenes, por tanto no hubo recuperación. En el control positivo (caldo de
enriquecimiento con L. monocytogenes sin molusco) se observa que al cabo de las 48
horas se alcanza y se supera la concentración inoculada a las 0 horas. Por otro lado,
en el control negativo (caldo de enriquecimiento con molusco sin Listeria
monocytogenes), no se detectó crecimiento de L. monocytogenes.
51
Se puede observar en los homogeneizados cuya concentración inicial fue de
104 y 106 que la carga mínima detectada por esta técnica fue a la concentración
de 1 x 104 UFC/mL, permitiendo esto también conocer que la presencia de
moluscos bivalvos no interfiere en la determinación del microorganismo lo cual se
pudo verificar y no hubo modificación en el crecimiento bacteriano, aunque si
mantuvo constante la carga microbiana, ya que en el homogeneizado utilizado
como control negativo, la carga bacteriana se duplicó al cabo de las 24 horas,
mientras que en los demás homogeneizados se observó una disminución de dicha
carga a las 0 horas, pero al cabo de las 48 horas se mantuvo la carga microbiana
inoculada (Figura 2).
Esta disminución de la concentración bacteriana a las 0 horas se puede deber a
que en el proceso de homogenización, la bacteria pudo quedar afectada por el proceso
de homogeneizado (licuado), pero tiene la capacidad de recuperarse a las 24 horas de
iniciado dicho ensayo, lo cual fue avalado por el control positivo también fue sometido al
proceso de homogenización.
Figura 2. Evaluación de la recuperación de Listeria monocytogenes mediante la técnica descrita en la Norma COVENIN 3718:2001. Fuente: Propia (2013)
Los resultados en la recuperación demuestran que la técnica descrita por
COVENIN 3718:2001 funciona para la detección de L. monocytogenes cuando las
concentraciones bacterianas están como mínimo en 1 x 104 UFC/mL en moluscos
bivalvos. Sin embargo, en caso de encontrarse en concentraciones de 103 se pueda
detectar, ya que al momento del homogeneizado la carga microbiana, como se observa
1,0E+00
1,0E+01
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
1,0E+07
1,0E+08
1,0E+09
INICIAL 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h
UFC
/g
Tiempo
1E+08 UFC
1E+06 UFC
1E+04 UFC
Control Positivo
1E+02 UFC
1E+01 UFC
52
que baja en una proporción de 2 log, lograra llegar a una concentración de 101 y
pudiera comenzar la multiplicación bacteriana que se observó en el resto de los
homogeneizados.
Todas las muestras de moluscos analizadas según la norma COVENIN
3718:2001, resultaron negativas para Listeria monocytogenes. Este resultado difiere al
de un estudio realizado en salmón y pescado blanco, donde se reportó una incidencia
de 14,60% (Hoffman y col, 2003), pero es similar a varios estudios realizados en
diferentes tipos de pescados, carne de cangrejo, pollos, productos comprados en
establecimientos de abarrotes de charcutería en los cuales no se aisló este patógeno
(López, 1999; Laciar y Centorbi, 2002; Carbajal y col, 2003; Falana y col, 2005; Morillo y
col, 2007; Miya y col, 2010; Molero y col, 2010), mediante diversas técnicas que van
desde la técnica convencional (cultivo bacteriológico) hasta con ensayos específicos de
última generación (mini-VIDAS LMO).
En las regiones de agua templada, se ha aislado L. monocytogenes de aguas
superficiales y de los lagos, así como de las zonas costeras. Para las regiones
tropicales también se señala que la incidencia de L. monocytogenes es muy baja,
donde en el pescado obtenido en dichas zonas no se detecta esta bacteria (FAO,
1999).
La Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición, en su informe del
comité científico del 13 de mayo de 2009, menciona la presencia de L. monocytogenes
del 4 al 12% de las muestras analizadas en pescas procedentes de aguas de la zona
templada y del 0 al 2% en pescas procedentes de aguas tropicales. Esto puede explicar
la ausencia de L. monocytogenes en nuestro estudio, ya que nos encontramos
ubicados según nuestra situación geográfica en una zona tropical.
Luego de analizadas las muestras por la técnica convencional, los resultados
fueron sometidos a un ensayo Inmuno – Enzimático (TRANSIA PLATE Listeria
monocytogenes) en el cual, la totalidad de las muestras resultaron negativas,
corroborando la ausencia de Listeria monocytogenes en las muestras analizadas por la
técnica convencional. La técnica TRANSIA PLATE Listeria monocytogenes cuenta con
una Especificidad Relativa del 95,5% y con una Sensibilidad Relativa del 93,7%
(Transia® Plate Listeria monocytogenes BIOCONTROL).
53
En relación a la determinación de indicadores de calidad se encontró que el
44,80% de las muestras de moluscos estudiados sobrepasaban los límites establecidos
por la Gaceta Oficial N° 303.927 de la República Bolivariana de Venezuela para
Coliformes fecales, donde se establece que el límite máximo permitido es de menos de
300 NMP/gr de muestra analizada (Figura 3)
Figura 3. Porcentaje de Coliformes Fecales, Límites establecidos en la Gaceta Oficial N° 303,927. Fuente: Propia (2013)
Los coliformes fecales es un grupo particular que puede estar presente en el
ambiente que rodea a los moluscos bivalvos. La utilización de estos microorganismos
como indicadores de calidad microbiológica, ha sido una práctica establecida desde
hace muchos años (Mossel y col., 1985).
Estos resultados concuerdan con los presentados por Carbajal y col., 2003; donde
encontraron un alto índice de contaminación por Coliformes fecales. Por su parte, un
estudio realizado por Grüa y col., 2004; en moluscos obtenidos en la zona costera
nororiental del estado Sucre, no reportaron valores superiores a lo establecido en la
Gaceta Oficial N° 303.927, aunque pudieron observar un aumentos de estos índices en
los meses lluviosos de la región, los cuales fueron desde Agosto a Noviembre, pero sin
alcanzar valores por encima de lo permitido por la normativa nacional. Este incremento
está relacionado con la capacidad concentradora de los moluscos bivalvos al filtrar
partículas en suspensión en el medio ambiente a través del bombeo del agua, aunado a
una posible relación estacional entre los parámetros ambientales (temperatura y
salinidad), al aumento del volumen de agua por efecto de las lluvias y vertidos, y la
influencia de las corrientes; factores que inciden en un intercambio pronunciado entre el
44,80%
55,20% Sobrepasaron los Limites permitidos
54
cuerpo de agua, los sedimentos con grandes contenidos de materia orgánica y los
microorganismos que se distribuyen con mayor homogeneidad en la columna de agua
(Grüa y col., 2004).
Por su parte, el número de muestras que no cumplieron con la
Reglamentación antes mencionada para Escherichia coli fue de 31,03%, ya que
arrojaron como resultado que contenían más de 250 NMP/gr de dichos microrganismos
(Figura 4).
Figura 4. Porcentaje de Escherichia coli. Límites establecidos en la Gaceta Oficial N° 303,927. Fuente: Propia (2013) Según Martínez y col, 2004; de un total de 80 cepas de E. coli aisladas de
pepitonas cocidas y ostras crudas procedentes de expendios ubicados en la avenida
perimetral de la ciudad de Cumaná, un 67,5% fueron identificadas serológicamente
como cepas comensales y un 32,5% como cepas enteropatógenas. Del 32,5%, un 15%
de las cepas fueron recuperadas de las ostras y un 17,5% de las pepitonas cocidas.
Estos datos son provenientes de las muestras más parecidas a los moluscos bivalvos
publicados en Venezuela hasta la fecha.
En la Tabla 6 se exponen los valores máximo, mínimo y promedio obtenidos para
coliformes fecales (CF) y Escherichia coli (EC). Los coliformes fecales se visualizaron
entre un rango 2,0 x 101 y 1,6 x 105 NMP/100g y Escherichia coli entre 2,0 x 101 y 5,4 x
104 NMP/100g.
31,03%
68,97%
Sobrepasaron los Limites permitidos
Entre los Limites permitidos
55
Tabla 6
Valores promedios, mínimo y máximo de la concentración encontrada de Coliformes fecales (CF) y Escherichia coli (EC).según tabla de NMP
CF EC
Media 7,9 x 103 1,4 x 103
Mínimo 2,0 x 101 2,0 x 101
Máximo 1,6 x 105 5,4 x 104
Fuente: Propia (2013) De las 100 muestras analizadas, se encontró la presencia de Salmonella en cinco
muestras, lo que representa el 4,31% (Figura 5)
Figura 5. Porcentaje de muestras positivas y negativas de Salmonella. Fuente: Propia (2013) Este 4,31% de muestras positivos incumplen con la Gaceta Oficial N° 303.927 de
fecha 06 de abril de 1.998, ya que en dicho se reglamentó no se permite la presencia
de Salmonella en moluscos bivalvos. Este resultado se corrobora con lo reportado por
Carbajal y col, 2.003; ya que ellos obtuvieron una baja incidencia de esta bacteria en las
muestras adquiridas en el Mercado Mayorista Pesquero de Ventanilla en Perú. Por su
parte, Morillo y col. (2.007) contrastan nuestros resultados ya que ellos luego de
procesar 415 muestras de carne de cangrejo obtuvieron aislamientos positivos para
este microorganismo en un 38,9%. Cabe destacar, que solo el hecho de que cualquier
muestra cuente con la presencia de Salmonella ya la convierte en no apta para el
consumo.
4,31%
95,69%
Muestras positivas para Salmonella Muestras negativas para Salmonella
56
Salmonella no es una bacteria autóctona del ambiente acuático razón por la cual
no se aísla comúnmente en pescados y crustáceos capturados en aguas oceánicas, sin
embargo, puede aislarse en ambientes marinos y en alimentos de este origen cuando
provienen de aguas costeras y estuarios contaminados con descarga de agua no
tratada de origen humano, animal o industrial.
La salmonelosis es una infección de importancia en salud pública debido al
impacto socioeconómico que ocasiona tanto en los países en desarrollo como en los
desarrollados, cuyos síntomas son dolores abdominales, diarrea, fiebre, escalofríos,
vómitos y postración, que en casos excepcionales pueden provocar otras
complicaciones. El período de incubación de la enfermedad oscila entre 7 y 72 horas
(Barreiro y col., 1994).
En el humano se presentan tres formas de salmonelosis clínicamente diferentes:
fiebres entéricas, septicemias y gastroenteritis aguda. El prototipo de la fiebre entérica
es producida por Salmonella typhi. La fiebre tifoidea suele empezar de modo insidioso,
tras un período de incubación de 7 a 14 días, la fiebre paratifoidea generalmente es
menos grave, y posee un período de incubación más corto de 1 a 10 días. Las
septicemias por Salmonella se caracterizan por la existencia de fiebre remitente y
bacteriemia, sin que en general haya afección aparente en el tubo digestivo,
generalmente son producidas por Salmonella choleraesuis. En la gastroenteritis, la
enfermedad queda confinada fundamentalmente al tubo digestivo, los síntomas
empiezan tras una incubación de sólo 8 a 48 horas (Davis y col., 1978).
No se evidencia relación alguna entre la calidad microbiológica de los moluscos
bivalvos, la presencia de Salmonella y L. monocytogenes. Resultados similares se han
informado por otros investigadores (De Curtis y col, 2002 y Mpuchane, 1996) los cuales
no hallaron una correlación entre elevados niveles de estos indicadores y la presencia
de Listeria en las muestras.
57
CONCLUSIONES
Bajo las condiciones de estudio, Listeria monocytogenes ATCC 19115 inició su
fase exponencial a las 6 horas, alcanzado valores de hasta 6,5 x 1010 UFC/mL en un
tiempo de 10 horas, donde comienza su fase estacionaria observándose a una
Densidad Óptica de 1,4.
El límite de detección de L. monocytogenes, utilizando la técnica descrita en la
Norma COVENIN 3718:2001, en moluscos bivalvos, fue del 1x104 UFC/mL,
encontrándose un porcentaje de recuperación de 29% a las 24 horas y 50% a las 48
horas.
La presencia del tejido del molusco bivalvo inhibe, bajo condiciones
experimentales, la multiplicación de L. monocytogenes, logrando el microrganismo su
máxima concentración a las 48 horas.
No se detectó Listeria monocytogenes en los moluscos bivalvos expendidos en
Maracaibo – Estado Zulia, mediante la Técnica descrita en la norma COVENIN
3718:2001 y la Técnica de ELISA.
No se evidencia relación alguna entre la calidad microbiológica de los moluscos
bivalvos, la presencia de Salmonella y L. monocytogenes.
Aun cuando el 44,8%, 31,3% y 4,31% de las muestras sobrepasaron la normativa
venezolana para coliformes fecales, E. coli y Salmonella respectivamente, no se
encontró relación con la presencia de L. monocytogenes.
58
RECOMENDACIONES
Evaluar la eficiencia de recuperación de Listeria monocytogenes en diferentes
alimentos, en especial en productos marinos a fin de definir si las técnicas utilizadas
presentan alta sensibilidad para la detección de este microorganismo.
Realizar estudios acerca de la influencia de las técnicas utilizadas en la detección
de Listeria monocytogenes sobre la supervivencia de dicho microorganismo en
moluscos bivalvos.
59
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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