Lintolleranza al glutine Alberto Tommasini, Laboratorio Immunologia Pediatrica, IRCCS Burlo Garofolo...
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L’intolleranza al glutine
Alberto Tommasini, Laboratorio Immunologia Pediatrica, IRCCS Burlo [email protected]
Samuel Gee, 1888
Che cosa è la celiachiaEnteropatia da causa alimentare
Malassorbimento
Difetto di crescita
Possibili concause infettive
Crisi celiaca
Quali alimenti ? Enteropatia da causa alimentare
- anni ‘30: esclusione di tutti i farinacei
- anni ‘40: solo i derivati del frumento
Trattamento dietetico:dall’inizio del ‘900 diete ipersemplificate 1908 Herter: I grassi sono tollerati meglio dei carboidrati1924 Haas:Dieta povera in carboidrati ad eccezione di quelli contenuti nelle banane
(che consentono di tollerare bene I grassi).
Quale parte del frumento ? Intolleranza al glutine
Glue = colla
+ glutine+ intrappolamento di aria durante la lievitazione
Dove si trova il glutine ?
frumento orzo
segaleavena
farro
Alimenti privi di glutine
Dove non si trova il glutine ?alimenti privi di glutine
www.farmacialoreto.it/
, Mais, Legumi
Enteropatia
Atrofia dei villiVilli normali (enorme superficie di assorbimento)
Effetto tossico del glutine sui villi intestinali
200 anni
Malassorbimento
Intestino tenue
Tratto prossimale ferro, calcio, lipidi
vitamine idrosolubili
Digiuno carboidrati e aminoacidi
Tratto distale acidi bilari e vitamina B12
Determinante è l’azione del colon per l’assorbimento di
acqua ed elettroliti
Alimenti privi di glutine
Malassorbimento
Mancanza di nutrienti:- dimagrimento, distrofia, difetto di crescita
Mancanza di vitamine e microelementi- anemia sideropenica- osteopenia /osteoporosi
Passaggio di cibo non digerito nel colon- Metabolismo batterico, meteorismo- presenza di grasso nelle feci
La diagnosi
Con glutine Senza glutine Con glutine
Stu
di d
i to
ssic
ità
Stu
di d
i to
ssic
ità
Valutati gli effetti di peptidi sintetici sintetici di gliadina in diversi modelli in vitro (intestino di pollo, fegato di ratto).
Peptide candidato: residui 75-86 dell’ -gliadina RPQQPYPQPQPQ
Produzione di INF- da sangue di celiaco stimolato con I singoli peptidi
Infusione intraduodenale dei petidi in soggetti celiaci
HLA
e C
ELIA
CH
IAH
LA
e C
ELIA
CH
IAL’85 % dei celiaci ha l’HLA DQ2, il 10% il DQ8:L’85 % dei celiaci ha l’HLA DQ2, il 10% il DQ8:Associazione di linkage o ruolo patogenetico dell’HLA?Associazione di linkage o ruolo patogenetico dell’HLA?
1 05011 05011 02011 0201
HLA
e g
luti
ne
HLA
e g
luti
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peptide
Clo
ni T,
HLA
, g
luti
ne
Clo
ni T,
HLA
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luti
ne
Biopsia di soggetti celiaci in GFD
- incubate per 18 h con digesto peptico-triptico di gliadina
- isolamento di cellule CD25+ e allestimento di linee e cloni T
- misura della risposta proliferativa specifica al glutine
- inibizione dell’attivazione con anticorpi anti-specifici HLA
T riconoscono il glutine in maniera ristretta dal DQ2
Cause e meccanismirisposta immune: infezione da glutine
Anticorpi anti-glutine (AGA)Linfociti T anti glutine produttori di INFgamma
Risposta simile a quella verso un agente infettivo continuamente somministrato
Ris
posta
al g
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nti
gliad
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Streptavidina-RPE
PeptideHLA
- Tetrameri costruiti in baculovirus con peptide covalentemente legato- coniugati con strepatvidina R-PE- peptidi -1 -2 e -1
Tetr
am
eri
HLA
Tetr
am
eri
HLA
com
e m
on
oclo
nali
com
e m
on
oclo
nali
Limiti: la colorazione diminuisce fortemente dopo stimolo specifico, a causa di una downregolazione del TCR
Tet
ram
ero-
PE
ANALISI CITOMETRICA SU SANGUE PERIFERICO CONANALISI CITOMETRICA SU SANGUE PERIFERICO CONTETRAMERI-PE CON PEPTIDE TETRAMERI-PE CON PEPTIDE -1-DQ -1-DQ -1-DQ 2 -1-DQ 2 -2-DQ -2-DQ
Quanto è frequente
Rara 1:1000/ 1:10000
Quadro clinico: ben caratterizzato;enteropatia glutine-dipendente
Patogenesi: non compresa
Diagnosi: lungo iter; 3 biopsie
“Celiachia”
Prevenzione: ritardare l’introduzione del glutine.
LA nuova celiachia IL PRESENTE
Non sempre l’enteropatia è evidente
Anemia isolataOsteopenia isolata
Altre manifestazioni più “distanti”
- Dermatite erpetiforme- Malattie autoimmuni (diabete, tiroidite …)
Cause e meccanismi
Gli anticorpi anti endomisio (EMA) - Capire la patogenesi dell’autoimmunità celiaca ?- Migliorare la diagnostica sierologica della malattia !
Qual è l’auto-antigene responsabile ?
Dagli EMA all’autoimmunità
Dagli anni ’80 l’associazione con malattie autoimmuni aveva spinto alla ricerca di marcatori autoimmuni
Cause e meccanismiLa transglutaminasi tessutale
- Come ci si è arrivati
- Un enzima importante
Che c’entra con il glutine e la celiachia?
JEM 2000
Cause e meccanismiRuolo della transglutaminasi
Gli Ac anti endomisio- epifenomeno?
- trascinamento?
- patogenetici?
Che cosa c’entra la’utoimmunità?
Il modello celiachiaAlterata immunità - ambiente
Gliadina
Transglutaminasi
B Th
B
Anti glutine
Anti tTG
MHC TCR
Peptide digliadinaIdrolisi dell’antigene
Il modello celiachiaAlterata immunità - ambiente
G
GG
G
G
G
G
IFN -
TNF -
Metalloproteinasi
Danno
tTGG
tTG
NH2
GD
IFN -
TNF -
GD
Quanto è frequente IL PRESENTE
Frequente 1:100/1:250 (testing, screening)
Quadro clinico: polimorfo; enteropatia NON necessaria silente/latente/potenzialeG.I. = “casi atipici”
Patogenesi: alterata risposta immune geneticamente determinata.
Diagnosi: semplificata; autoanticorpi (EMA, htTG)1 (o NO?) biopsia.
“Genetic gluten Intolerance”
Prevenzione: glutine “tanto e subito” Screening di massa?
Ambiente e rischio di Ambiente e rischio di diabetediabete
Quanto pesa l’ambiente ?
Ci sono fattori ambientali identificabili ?
Come interagiscono con l’individuo ?
E’ possibile operare una prevenzione ?
Latte vaccino (Kolb ‘99)
Infezioni da enterovirus (Carratù ‘99, Hiltunen ‘97)
Glutine (SIGEP ‘99)
Fattori ambientali ipotizzati:Fattori ambientali ipotizzati:
1600: allevamenti di vacche da latte
breve tempo
per selezione negativa
Il latte vaccino e l’uomoIl latte vaccino e l’uomo Uomo nomade e cacciatore
Non alleva vacche
A volte ottiene latte da capre
3,5%
0,8%
4,7%
6,2%
0%
1%
2%
3%
4%
5%
6%
7%
Celiaci <2 2-10 >10
Infiammazione glutine dipendente Infiammazione glutine dipendente della mucosa intestinale e rischio di diabetedella mucosa intestinale e rischio di diabete
Permeabilitàdella mucosaintestinale
L’ intestino nel diabeteL’ intestino nel diabete
Infiammazione:aumento di linfocitinella mucosa
Il modello celiachiaStudio con librerie anticorpali
1) Amplificare l’mRNA che codifica le regioni
variabili delle Ig.
2) Clonare i c-DNA in vettori fagici.
3) Selezione dei fagiche riconoscono la tTG.
CK
CH1VK
VH
VK
VH
scFvC-DNA
Ag
scFvgene3scFv
Tag
VKVH
Ciclo fagico
Antigene
Lavaggio
C-DNA
Il modello celiachiaStudio con librerie anticorpali
• Gli anti TTG nel celiaco sono prodotti solo e soltanto dai linfociti della Gli anti TTG nel celiaco sono prodotti solo e soltanto dai linfociti della mucosa intestinalemucosa intestinale (Marzari et al. J. Immunol, 2001).(Marzari et al. J. Immunol, 2001).
• ““Epitope mapping” ovvero esiste una specificita’ epitopica degli anti TTG Epitope mapping” ovvero esiste una specificita’ epitopica degli anti TTG nel celiaconel celiaco (Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001 ). (Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001 ).
• Anche altri autoanticorpi, quando presenti nel celiaco, sono prodotti dai Anche altri autoanticorpi, quando presenti nel celiaco, sono prodotti dai linfociti della mucosa intestinalelinfociti della mucosa intestinale ( Boscolo S. et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. ( Boscolo S. et al, J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001).2001).
• La produzione di autoanticorpi da parte dei linfociti intestinali prescinde La produzione di autoanticorpi da parte dei linfociti intestinali prescinde dalla presenza e dalla gravita’ della lesione istologica e puo’ NON essere dalla presenza e dalla gravita’ della lesione istologica e puo’ NON essere rilevabile nel sierorilevabile nel siero (Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001 ).(Sblattero D. et al J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001 ).
PBL libraryPBL library
IBL libraryIBL library
Il modello celiachia Epitope mapping
Atassia da glutine
- Induzione di tolleranza
- peptidasi batteriche
- riso transgenico?
DALLA CONOSCENZA DEI PEPTIDI TOSSICIA NUOVE TERAPIE
Come si può curare
Il peptide tossico di 33 aa, che viene deaminato dalla transglutaminasi e riconosciuto dall’HLA DQ2, potrebbe essere specificamente scisso da peptidasi batteriche che potrebbero essere utilizzate per pretrattare il cibo
Come si può curare Peptidasi
Digestione inefficace dei peptidi tossici da parte degli enzimi del brush border intestinale
Efficace completamento della Digestione con Prolyl endopeptidasi batterica
Come si può curare Peptidasi
Come si può curare Riso transgenico
• Breeding e selezione di linee di frumento a basso contenuto in gliadine
• Modificazioni per eliminare le sequenze antigeniche
STRATEGIE ADOTTATE PER “DETOSSIFICARE” IL FRUMENTO
PROBLEMATICHE
Elevato numero di geni distribuiti su 42 cromosomi
Elevata variabilità genetica
Diffusione di varietà coltivate
STRATEGIA
Migliorare le proprietà tecnologiche introducendo le sequenze gluteniniche con le migliori caratteristiche reologiche
Utilizzare un cereale non allergenico
Oryza sativa
Come si può curare Riso transgenico
2%
30%200 anni
Glutine
Infezioni DQ2/DQ8
Che cosa è la celiachiaPerché tanto glutine