INFORME ANUAL 1995

LINEA 6BIOLOGIA MOlECULAR Y CELULAR DE ANIMALES

6.1 Implementaci6n y desarrollo de sistemas para la producci6n de celulas y animalestransgenicos

6.2 Mecanismos de control de la proliferaci6n, diferenciaci6n y muerte celular6.3 Regulaci6n de la expresi6n genica en celulas animales6.4 Farmacologfa molecular6.5 Genetica y biologfa molecular del desarrollo de Drosophila melanogaster6.6 Biologfa molecular de insectos

PROGRAMA 6.1Implementaci6n y desarrollo de sistemas para laproducci6n de celulas y animales transgenicos

EI estudio de la expresion de genes recombinan-tes en animales completos es una estrategia ex-perimental invaluable para entender el funciona-miento normal del organismo adulto y durante eldesarrollo. Ademas. los ratones transgenicos sonuna alternativa insustituible para generar anima-les modelo de enfermedades humanas. y asf po-der estudiar estas y disefiar estrategias terapeu-ticas adecuadas. Por otro lado. la posibilidad depoder modificar el genoma de animales de inte-res comercial abre nuevas vfas para su mejara-miento genetico. asf como la utilizacion de estosen la produccion de bienes de consumo. Actual-mente hemos establecido el procedimiento basi-co de construccion de animales transgenicos parmicroinyeccion de ovocitos fertilizados de raton.Alternativamente estamos cultivando y manipu-lando celulas embrionarias comunmente cono-cidas como "ES" (del ingles Embryonic Stem) lascuales pueden ser manipuladas geneticamente yreintroducidas al animal completo y eventual-mente generar un animal transgenico a partir deuna sola celula modificada in vitro. Dentro de esteprograma consideramos la evaluaci6n continuade nuevos procedimientos que incremente la efi-

ciencia y facilite su aplicabilidad a especies di-versas. Por otro lado. hemos implementado y mo-dificado la introduccion de DNA recombinante invitro e in vivo usando liposomas sinteticos.

-Optimizacion de la microinyeccion de DNA re-combinante al pronucleo de ovocitos fertiliza-dos de rat6n para la generacion de animalestransgen icos

D. ESCALANTE Y L. COVARRUBIAS

I990/P/DGFM-Implementaci6n de la microinyecci6n de DNA

recombinante al pronucleo de ovocitos fertiliza-dos de rat6n para la generaci6n de animalestransgen icos

D. ESCALANTE. j. SANTA OLALLA Y L. COVARRUBIAS

1991/l/DGFM

-Animales y celulas transgenicas para estudiarenfermedades humanas: los orfgenes del cancercervico uterino

F R. D. ESCALANTE. F RECILLAS, P. GARICLIO Y L. COVA-

RRUBIAS

I992/P/DGFM-Construcci6n de ratones quimericos con celulasembrionarias modificadas

S CASTRO, R. RAMfREZ Y L. COVARRUBIAS

I993/P/DGFM

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA

PROGRAMA 6.2Mecanismos de control de la proliferaci6n,diferenciaci6n y muerte celular

Durante el desarrollo, !as o~lulas en diferencia-ci6n tienen que tomar decisiones crfticas para queel organismo se forme adecuadamente. Estas de-cisiones conducen alas celulas a cuatro estadosdiferentes: proliferativo, diferenciativo, quiascentey el que tiene como finalidad iniciar el programaend6geno que conlleva a la muerte (i.e. muertecelular programada). Evidencias experimentaleshan sugerido que la proliferacion y la diferencia-cion terminal son procesos exclusivos y que, enel inicio de este ultimo, existen un numero demoleculas que se expresan y participan de igualmanera en el proceso de quiascencia y senescen-cia celular. Sorprendentemente, datos recientesindican la participacion de moleculas tfpicas delcontrol del cicio celular, como el oncogen m!lG, elantioncogen p53 y la cinasa p34, en el procesode muerte celular. Asf entonces, podemos postu-lar que la proliferacion, diferenciacion, quiascen-cia y muerte celular son procesos exclusivos ycuya determinacion se establece por moleculascomunes. Recientemente se ha demostrado quela oxidacion es, por 10 menos, uno de los meca-nismos participantes en la muerte celular "ane-cr6tica" y existen datos que sugieren que algunosfactores de sobrevivencia pudieran encender unmecanismo antioxidativo para prevenir la muerte.Por otro lado, el producto del gene bcl-2, el anti-apoptotico endogeno mejor caracterizado, pro-tege de muerte probablemente mediante su inte-raccion con el balance oxido-reduccion. Nosotroshemos establecido distintos modelos experimen-tales que nos permitiran analizar varios aspectossobre el mecanismo de regulacion de la prolife-raci6n, diferenciacion y muerte celular programa-da. En uno de ellos, hemos inducido a proliferary/o diferenciar precursores neurales a traves detratar cultivos primarios de mesencefalo em brio-nario con insulina, EGF y bFGF. don de este ultimoparece actuar, en parte, como un factor de sobre-vivencia. Aquf hemos encomrado que en condi-ciones particulares donde la diferenciacion no

esta favorecida, la muerte celular es activada porlos factores de crecimiento. Otro sistema involu-cra la manipulacion de celulas embrionarias "ES",las cuales se pueden inducir a diferenciar in vitro ymodificar su genoma y asf evaluar la relevanciade genes especfficos en los procesos de diferen-ciacion proliferacion y muerte. Estas celulas re-quieren del l3-mercaptoetanol, un antioxidante,para sobrevivir en condiciones en las cuales nose ha afiadido ningun inductor de la diferencia-cion. En cambio, aun en presencia del antioxidan-te, cuando las celulas son inducidas a diferenciarneuronas con acido retinoico (AR), se observa unaabundante muerte celular. Finalmente, las celu-las germinales primordiales es uno de los pocostipos celulares donde se ha observado in vivo lamanifestacion de eta pas proliferativas y diferen-ciativas (i.e. inicio de la meiosis) yen las cualesel control de la sobrevivencia es crftico. La inmor-talizaci6n de estas celulas mediante la utiliza-cion de oncogenes inmortalizantes, nos permitiraestudiar en detalle los mecanismos que contro-Ian su patron de desarrollo.

ePapel de los factores de crecimiento en la dife-renciacion de las celulas neurales

J. SANTA OLALLA Y L. COVARRUBIAS

I 990/P/DG FM

eLa muerte celular programada en celulas em-brionarias

S. CASTRO, R. RAMIREZ Y S. CASTRO

1992/P/OGFM

elnmortalizaci6n de las celulas germinales pri-mordiales y el control de la meiosis

D. ESCALANTE Y L. COVARRUBIAS

I990/P/DGFM

PROGRAMA 6.3Regulaci6n de la expresi6n genica en celulasanimales

Las caracterfsticas fenotfpicas de una celula estandefinidas por la expresion de genes especfficos,

INfORME ANUAL 1995

por 10tanto, la caracterizaci6n de estos es una al-ternativa para conocer mejor funcionalmente auna celula. Par otro lado, la regulaci6n de estosgenes es un indicativo de las modificaciones intra-celulares que estan ocurriendo, pudiendo debersea cambios ambientales 0 parte de un programaencendido durante el proceso de diferenciaci6n.

- Expresi6n de tirosfn hidroxilasa y glutamatodescarboxilasa en neuronas derivadas de pre-cursores neurales in vitro

j. SANTA OLALLA Y L. COVARRUBIAS

1992/P/DGFM-Caracterizaci6n de la regi6n promotora del gene

de la fosfatasa alcalina tejido no-espedfica encelulas embrionarias y germinales primordialesasf como en animales transgenicos

D. ESCALANTE, F. RECILLAS Y L. COVARRUBIAS

I990/P/DGFM- Regulaci6n de la expresi6n de genes espedficos

durante la gonadogenesisS. CASTRO, E. SALAS, H. MERCHANT Y L. COVARRUBIAS

I 990trlDG FM

-Caracterizaci6n molecular de las celulas germi-nales primordiales

H. LOMELI, D. ESCALANTE Y L. COVARRUBIAS

1993/P/DGFM

PROGRAMA 6.4Farmacologfa molecular

Actualmente muchos de los farmacos empleadostienen como blanco a ciertas protefnas de mem-brana como los canales i6nicos, los receptores ylas protefnas acarreadoras (bombas). Estas pro-tefnas intrfnsecas pertenecen a varias familiasque participan en la excitabilidad y la comunica-ci6n celular Dichas protefnas se encuentran enla superficie celular y, par 10tanto, son accesiblesa moleculas presentes en el medio extracelularPar otra parte, este grupo de protefnas regulafunciones celulares que operan en milisegundoso segundos Un medico puede medir dichas fun-

ciones rapidamente y el paciente las experimen-ta clara mente. Lo anterior destaca la importanciamedica que tienen los efectos de compuestosque actuan sobre este grupo de protefnas.

Desgraciadamente los compuestos con los quese cuenta en el presente, aun cuando son muyutiles, tienen muchos efectos secundarios. Aqufsolamente mencionaremos un ejemplo por limi-taci6n de espacio; las dihidropiridinas, como lanisoldipina, bloquean canales de calcio y son uti-les en el tratamiento de angina de pecho. Sin em-bargo, pueden causar hipotenci6n ortostatica albloquear la contracci6n dependiente de calcioen los musculos lisos de las arterias.

Considerando 10 anterior, uno de los objetivosprincipales que se plantea la farmacologfa mo-derna es desarrollar compuestos que sean masespedficos para un subtipo particular de protef-nas de membrana involucradas en eventos de ex-citabilidad y/o comunicaci6n celular. La c1onaci6ndel DNA ha demostrado que muchas de estasprotefnas estan codificadas par familias de mul-tigenes. La diversidad de RNA mensajeros que co-difican a dichas protefnas, de hecho, sobrepasala variedad de subtipos reconocidos farmacol6-gicamente. Estas protefnas se pueden expresarhoy dfa en celulas de diferente origen como ovo-citos de Xenopus 0 Ifneas celulares de mamffero.En general los productos expresados retienen lascaracterfsticas particulares de los diversos subti-pos de la familia de protefnas. En el caso de ca-nales i6nicos, dichas caracterfsticas se puedendeterminar electrofisiol6gicamente con toda pre-cisi6n, Asf. la expresi6n heter610ga puede con-vertirse en una herramienta poderosa para buscarcompuestos que actden espedficamente sobreun subtipo de canales i6nicos y, por 10tanto, quedisminuyan los efectos secundarios que produ-cen. Mas aun, la expresi6n heter610ga puede per-mitir, en principio, la obtenci6n de suficientematerial para realizar estudios estructurales.

Oueda claro que el desarrollo de la nueva far-macologfa molecular requiere de un esfuerzo in-terdisciplinario En este sentido, ellnstituto poseela infraestructura academica basica para em-prender esta interesante e impartante tarea. Por

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA

un lado, se cuenta (grupo del Dr. Possani) conamplia experiencia y reconocimiento internacio-nal en el area de bioqufmica de toxinas de ala-cran. Vale la pena hacer notar que las toxinashan sido herramientas cruciales en el estudio delos canales i6nicos. Ahora que se cuenta con lasestrategias apropiadas seguramente se encon-traran fracciones altamente especfficas para cier-tos subtipos de canales. Por otro lado, el Instituto(grupo del Dr. Bolivar/Becerril) maneja las tecni-cas avanzadas en biologfa molecular y se ha inte-resado recientemente en la clonaci6n, expresi6ny mutaci6n de los canales i6nicos. Finalmente,para cerrar el cfrculo interdisciplinario necesariopara iniciar la farmacologfa molecular en nuestracomunidad, se cuenta con un grupo (Dr. Darszon)que desde hace bastantes afios emplea tecnicasde reconstituci6n y medici6n de canales unita-rios. Recientemente se ha incorporado a dichogrupo el Dr. Lievano, que montara en el Institutola metodologia para expresar y caracterizar elec-trofisiol6gicamente mensajeros de canales i6ni-cos en ovocitos y otras Ifneas celulares. Nuestrogrupo (Dr. Darszon) estudia los canales i6nicosdel espermatozoide ya que estos participan enforma determinante en la fecundaci6n. Este sis-tema plantea problemas interdisciplinarios atrac-tivos cuya resoluci6n puede Ilevar al desarrollode toxinas y peptidos muy especfficos que poten-cialmente se podrfan usar para controlar la fe-cundaci6n en el hombre. Esto ultimo disminuirfalos riesgos de efectos secundarios y relevarfa, almenos parcialmente, a la mujer de la responsa-bilidad total que hasta ahora se Ie ha conferidode manera arbitraria y un tanto injusta como uni-co blanco de control de la natalidad.

- Papel del potencial de membrana en la induc-ci6n de la reacci6n acrosomal en el espermato-zoide de mamfferos

F. ESPINOSA, A. LiEVANO, C. BELTRAN Y A. DARSZON

1991 II/S/DG FM

-Canales i6nicos presentes en la membrana pI as-matica del espermatozoide de rat6n y su regu-laci6n durante la reacci6n acrosomal inducidaporZP3

A. LiEVANO Y A. DARSZON

1990/P/S/DGFM

- Estudios sobre la regulaci6n que ejercen lasprotefnas G en la permeabilidad de espermato-zoides de erizo de mar y de rat6n

A. LIEVANO, C. BELTRAN Y A. DARSZON

1991/I/S/DGFM

-Caracterizaci6n del transporte de Ca2+ y de laregulaci6n del pH en vesfculas formadas a par-tir de membranas plasmaticas aisladas del es-permatozoide de rat6n

c. BELTRAN, F. ESPINOSA, A. LiEVANO Y A. DARSZON

19911I/S/DG FM

- Incorporaci6n de protefnas de la membranaplasmatica de espermatozoide en diversos esta-dios de purificaci6n, a vesfculas y bicapas lipfdi-cas, con la finalidad de purificar y caracterizarlos canales i6nicos

c. BELTRAN, A. LiEVANO Y A. DARSZON

1991 II/S/DG FM

-Caracterizaci6n de canales i6nicos que se ex-presan durante el desarrollo del espermatozoi-de de mamfferos

A. LiEVANO

199 III/S/DG FM

-Caracterizaci6n de toxinas capaces de bloquearla reacci6n acrosomal y los flujos i6nicos en elespermatozoide del erizo de mar y de mamfferos

o. ZAPATA, A. LiEVANO, L. D. POSSANI Y A. DARSZON

1991/P/S/DGFM/DRMB

- Disefio y sfntesis qufmica de peptidos que blo-quean canales i6nicos

G. GURROLA, L. VACA, A. DARSZON Y L. D. POSSANI

1990/P/S/DGFM/DRMB

- Estudio del efecto de toxinas del veneno de ala-cranes y de peptidos N-terminales sinteticoscorrespondientes a la noxiustoxina sobre cana-les de potasio de celulas epiteliales

L. VACA, L. D. POSSANI Y D. KUNZE

19911P/S/DRMB

INFORMf ANUAL 1995

PROGRAMA 6.5Genetica y biologfa molecular del desarrollode Drosophila melanogaster

La mosca de la fruta D. melanogaster es el organismoanimal mejar comprendido a nivel de biologfa deldesarrollo. En el laboratorio hemos iniciado unaserie de proyectos encaminados a entender la fun-ci6n de algunos loci geneticos que parecen estarimplicados en algunas etapas daves del desarro-llo de Drosphila En particular estamos trabajandocon dos genes que mapean uno despues del otroen el cromosoma X (CBP5 y CBP8) AleJos de CBP5son letales al no completarse el ultimo estadiolarvario y presentan la caracterfstica de farmar cro-mosomas politenicos mas cortos y sin "puffs" enlas glandulas salivales. Alelos de CBP8 producenmalfarmaciones en la parte anterior del embri6n.Ambos muestran fenotipos muy diferentes a pe-sar de estar continuos en el genoma y creemosque tienen un papel relevante en diferentes eta-pas del desarrollo de la mosca. Por el momento,nos encontramos caracterizando donas de CDNAcorrespondientes a cada uno de estos dos genesyen un futuro esperamos determinar la funci6nen el desarrollo a nivel molecular de CBP5 y CBP8.

Asimismo, se ha iniciado un nuevo proyectodentro de esta Ifnea de investigaci6n, que com-prende la donaci6n y caracterizaci6n de genesinvolucrados en los mecanismos de reparaci6nde DNA en Drosophila. Mutaciones de este tipo degenes en levadura y en humanos ocasionan unfenotipo de hipersensibilidad a la luz ultraviole-ta. En levadura existen par 10 menos 30 genes in-volucrados en este proceso y en humanos seconsidera que existe un numero equivalente, de-terminado a partir de diferentes grupos de com-plementaci6n. En humanos ademas del fenotipode hipersensibilidad a UV, tambien se han aso-ciado mutaciones en estos genes a diferentes ti-pos de sfndromes degenerativos como son el Sfn-drome de Cockayne, Xeroderma pigmentosum y Ataxiatelangiectasia. Es importante sefialar que, si bien lalevadura a mostrado una gran utilidad para el es-tudio de la funci6n de estos genes y que en hu-manos se han descrito los diferentes alelos invo-

lucrados en estos s;ndromes, no hay estudioscon un modelo intermedio. Por 10 tanto, decidi-mos estudiar estos genes en Drosophila melanogaster,ya que la posibilidad de utilizar la gran diversi-dad de metodologfas de genetica y biologfa mo-lecular presenta un modelo ideal para estudiar lafunci6n de estos genes en un animaL Hemos ini-ciado este proyecto con la donaci6n de genehom610go de Drosophila a rad 3 de levadura y XPDde humano.

Por otro lado, otra Ifnea de investigaci6n quese desarrolla en ellaboratorio esta relacionada conla caracterizaci6n a nivel molecular y genetico degenes que regulan la expresi6n de genes home6-ticos en Drosophila En particular con genes del gru-po de Tritorax que son activadores de la trans-cripci6n y que parecen estar involucrados en lamodulaci6n de la estructura de la cromatina. Losejemplos mas importantes de este grupo de ge-nes son Tritorax y Brama. Recientemente se haidentificado una serie de mutantes de genes nue-vos que parecen interaccionar con Brama y queha sido donada. Este proyecto se encuentra, eneste momento, en la fase de caracterizaci6n ffsicadel gene asf como en el analisis de su expresi6ndurante el desarrollo e interacci6n con otros ge-nes modificadores de Brama.

-Clonaci6n y caracterizaci6n del gene hom610gode rad 3 de Drosophila melanogaster

M. ZURITA, M. VAzQUEZ, E. REYNAUD Y H. LOMELI

I 995/I/DG FM

-Caracterizaci6n de mutantes de Drosophila melano-gaster que afectan el gene hom610go de rad 3

M. ZURITA, M. VAzQUEZ, E. REYNAUD Y H. LOMELI

I 995/I/DGFM

-Clonaci6n y caracterizaci6n funcional del geneOsa de D. melanogaster

M. VAzQUEZ Y J. KENNISON

I 994/P/DGFM

-Caracterizaci6n de genes modificados de Bra-ma en D. melanogaster

M. VAZQUEZ Y M. ZURITA

I 995/I/DGFM

INS TIT U TOO E B' lOT E ( N 0 LOG i A

-Caracterizaci6n a nivel molecular de los genesCBPS y CBP8 de Drosophila melanogaster

M. ZURITA, E. REYNAUD Y M. VAZQUEZ

J 991/I/DG FM-Caracterizaci6n molecular y genetica del gene

BPS de Drosophila melanogaster, un gene en el quealgunos alelos alteran la formaci6n de cromo-somas politenicos y el desarrollo embrionario

L. PEREZGASGA, T KOZLOVA Y M. ZURITA

1992/P/DGFM-Caracterizaci6n molecular y genetica del gene

BP8 de Drosophila melanogaster, un gene en el quealgunos alelos alteran la oogenesis y la forma-ci6n de las estructuras anteriores del embri6n

T KOZLOVA, L. PEREZGASGA Y M. ZURITA

1992/P/DGFM

PROGRAMA 6.6Biologfa molecular de insectos

Muchos de los vectores que transmiten parasitosson dfpteros, en particular mosquitos. Interesan-temente, el organismo animal mejor comprendi-do a nivel de biologfa del desarrollo es un dfptero,Drosophila melanogaster. Los mosquitos y la mosca dela fruta comparten caracterfsticas importantes:ambos presentan un desarrollo embrionario muysimilar, la oogenesis es practicamente identica yel mosquito Anopheles gambiae forma cromosomaspolitenicos tan buenos para mapeo como Droso-phila. Asf pues, estamos utilizando la informaci6ny algunas de las metodologfas desarrolladas paraDrosophila en el estudio del mosquito transmisorde la malaria, An. gambiae.

Nuestro interes inicial en el mosquito es el deaislar y caracterizar genes que sean expresadosde manera preferencial en el ovario de hem bras,

despues de que comen sangre. Como es conoci-do, la oogenesis en mosquitos es estimulada 48horas despues de que la hembra se alimenta consangre. Durante este proceso la expresi6n de ge-nes importantes para la formaci6n del ovario ypara el desarrollo temprano es activada haciendoeste fen6meno un modelo interesante de regula-ci6n de la expresi6n genetica. Por el momento,contamos con una colecci6n de donas de cDNA,cuyos transcritos se acumulan de manera prefe-rencial en el ovario de hem bras despues de queestas toman sangre. Su caracterizaci6n moleculary el estudio en paralelo de los genes hom610gosen Drosophila, nos permitira determinar la relevan-cia fisiol6gica de dichos genes durante la ooge-nesis.

- Identificaci6n y caracterizaci6n de genes que seexpresan preferencialmente en el ovario delmosquito A. gambiae

E. REYNAUD, F. C. KAFATOS, V. BARAJAS Y M. ZURITA

I 992/P/DGFM-Clonaci6n y caracterizaci6n de genes expresa-

dos de manera preferencial en el ovario de An.gambiae

E. REYNAUD Y M. ZURITA

1993/I/S/DGFM-ldentificaci6n y caracterizaci6n de protefnas que

reconocen de manera especffica DNA tetraheli-coidal en Drosophila melanogaster

M. ZURITA

1994/I/DG FM-Clonaci6n y caracterizaci6n de genes especffi-

cos de abejas reinas y de obrerasM. CORONA Y M. ZURITA

I 994/I/DG FM