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严重联合免疫缺陷病（severe combined immunode原ficiency，SCID）是一组有不同基因异常所致的严重 T细胞缺乏或功能异常，并伴随 B淋巴细胞功能异常的疾病[1]。SCID是一类比较多见的原发性免疫缺陷病，新生儿的发病率为 1/75 000~1/100 000[2]。目前发现的 SCID相关基因有 13 个，包括 IL-2RG、ADA、JAK3、RAG1、RAG2、IL-TRa、DCLRE1C、LIG4、DNA-PKcs、CD3啄、CD3着、CD3灼、CD45 [3]。其中 LIG4 基因突变引起的 SCID 称为LIG4综合征，这是一种非常罕见的常染色体隐性遗传病，患儿常表现为发育异常和肿瘤倾向[4]。LIG4综合征是严重的致死性遗传病，药物治疗效果差，早期基因诊

断行免疫重建是治疗和延长已出生患儿生存期的最好

办法。但是，预防患儿出生是最终目标。因此，本研究通

过应用芯片捕获后行高通量测序法检出先证者的基因

突变，成功对其母亲再次妊娠进行产前诊断，有效避免

患儿的出生；现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者女，足月顺产出生，头围偏小，体重

偏轻。1岁时因接种疫苗后开始持续有中耳炎、腹泻、巨细胞病毒感染，血常规检查提示全血细胞减少，对抗生

素和免疫球蛋白的治疗效果差，一直转辗于本院与外院

治疗。当时先证者及其父母均抽取外周血作基因检测。

先证者 3岁时因颅内肿瘤死亡。父母表型正常。现母亲再次怀孕（高龄并孕 20周），为避免再次分娩 LIG4综合征患儿，2016年 11月 8日来本院作产前诊断。1.2 目标序列捕获 抽取先证者及其父母外周静脉血

5ml，标准流程提取基因组 DNA（QIAamp DNA BloodMidi Kit，德国 Qiagen）。质检合格的基因组 DNA使用Covaris LE220超声波仪（美国 Massachusetts）进行随机打断，产生 200~250bp的随机片段。随后进行 AmpureBeads纯化，将纯化后的 DNA片段进行末端修复、加“A”以及加接头反应，再经过连接介导 PCR（ligation-

mediated PCR，LM-PCR）进行扩增和纯化。利用定制的1445 号基因片段捕获芯片（Roche Nimble Gen，美国Madison）与 20个标记好的患者 DNA库 47益杂交 64~72h，通过芯片杂交捕获下来的 DNA片段用链霉亲和素磁珠富集，被捕获的片段使用 LM-PCR 生成测序用的DNA库。1.3 序列分析 首先对生成的测序 DNA库进行质检，去除低质量以及被接头污染的测序序列。合格的 DNA库与 Illumina 测序原件上的互补接头进行杂交，然后使用高保真的 DNA聚合酶对其进行扩增，在 HiSeq 2000测序平台上进行高通量测序。测序深度＞100X，测序数据分析采用 Illumina分析流程。使用 Illumina basecall原ing 1.7软件进行原始图像数据处理。每条测序序列产生90bp的双向测序读长。

一个 LIG4综合征家系基因突变分析和产前诊断

【 摘要 】 目的 对一个 LIG4综合征家系进行基因突变分析和产前诊断。 方法 选择该家系疑似 LIG4综合征的女患儿（先

证者，现已死亡）及其父母外周血，通过目标序列芯片捕获技术获得 LIG4综合征发病相关基因的可疑突变，用高通量测序技术对突

变基因测序。再对突变基因进行 Sanger测序验证。在确定家系突变基因型后，于母亲再次妊娠 20周时抽取羊水，通过 Sanger法验

证进行高危胎儿的产前诊断。结果 先证者携带 LIG4基因的复合杂合突变，突变位点为 c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.

K424fs），两者均为已知突变。先证者父母为杂合突变携带者。胎儿的羊水细胞基因型亦有与先证者相同的 LIG4基因型突变，家属选择

终止妊娠。结论 LIG4基因复合杂合突变是先证者患 SCID的致病突变。通过芯片捕获高通量测序技术可以完成对 LIG4综合征

家系的基因突变分析和产前诊断。

【 关键词 】 严重联合免疫缺陷病 LIG4综合征 高通量测序 复合杂合突变 产前诊断

张鑫丽 沈国松 李雯雯 阳鑫妙

doi：10.12056/j.issn.1006-2785.2018.40.13.2017-263

基金项目：湖州市科技计划研究项目（2014GZ13）

作者单位：313000 湖州市妇幼保健院产前诊断中心

通信作者：沈国松，E-mail：xinli.66@163.com

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1.4 Sanger法验证 对所有发现的致病突变，在其所

在片段上下游设计引物。行 PCR扩增，对产物作 Sanger测序，所得结果与 LIG4基因标准序列进行比对，从而验证基因芯片捕获和高通量测序的结果。

1.5 羊水母血污染鉴定和产前诊断 对先证者母亲在

超声引导下经腹行羊膜腔穿刺术抽取羊水 20ml，其中10ml 按标准流程提取基因组 DNA 后，选用 16HSSystem 试剂盒（Promega Corporation，美国 Madison）、ABI3130XL遗传分析仪，与父母 DNA进行个体识别和亲子鉴定。确定无母源污染后，再对羊水 DNA的 LIG4

基因作针对性的 Sanger法验证；另外 10ml羊水用于常规细胞培养、制片及 G显带核型分析。2 结果

2.1 LIG4基因突变的确定 高通量测序显示先证者携

带 LIG4 基因的复合杂合突变，位点为 c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.K424fs），见图 1。其中父亲携带 c.833G＞C（p.A278L），是错义突变；母亲携带 1271-1275del（p.K424fs），是框移突变。2个位点为已证实的突变，故本研究未在健康群体中验证。

图 1 先证者 LIG4基因测序图

2.2 胎儿的产前诊断 羊水 DNA 的 LIG4 基因经过Sanger验证，显示胎儿携带与先证者相同的 LIG4基因突变位点，即 c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.K424fs）。胎儿的羊水染色体核型为 46，XX。2.3 遗传咨询 本院产前诊断中心告知该胎儿出生后

将发展为 LIG4综合征患者，家属选择终止妊娠。3 讨论

LIG4综合征是一种 DNA双链断裂后非同源末端链接（non-homologous end joining，NHEJ）通路缺陷病，

为罕见的常染色体隐性遗传病，在 2011版原发性免疫缺陷病分类中被归为联合免疫缺陷病[5]。其临床表现为辐射敏感，小头畸形，生长发育迟缓，联合免疫缺陷、自

身免疫性疾病和肿瘤等。LIG4 综合征的发病机制是LIG4基因异常。LIG4即 DNA连接酶 4，是 NHEJ的核心组分之一，基因位于 13q33-34。含有 1个氨基端催化域和 2 个羧基端乳腺癌易感蛋白的 LC 末端结构域。LIG4和 XRCC4通常以复合体的形式存在，主要参与DNA断链末端的对比和缺口填补，还能与 DNA断链末端的 DNA-Pkcs、Ku蛋白相互作用，促进 DNA断链的连

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接。LIG4在复制和 V（D）J重排过程中起着重要作用。因此，当 LIG4缺陷时，若细胞出现损伤会因无法正常修复而死亡；或在发生免疫反应时，T、B淋巴细胞因受体重排障碍而失去免疫功能，从而导致联合免疫缺陷[6]。

Buck等[7]报道 15例 LIG4缺陷的患者中，有 6例出现血液恶性肿瘤，2 例为前 T细胞白血病和（或）淋巴瘤，1例骨髓发育不良，4例出现 B细胞增殖性疾病。而本例患儿的临床表现与上述报道相符，其 LIG4的基因测序显示为 1271-1275del（p.K424fs）的复合杂合突变。其中 c.833G＞C（p.Arg278Leu）导致 LIG4 蛋白氨基酸（aa）序列第 278位点发生密码子改变：由精氨酸变为亮氨酸；该 aa位点位于活化中心周围的一个高度保守基因序列，其改变将导致 LIG4功能明显受损[7]。已有该位点致病性的相关报道，Jiang等[8]同时用 Sift和 Polyphen软件对其蛋白功能进行预测，也认为对 LIG4蛋白功能有害，该位点人群发生率极低。而 1271-1275del（p.K424fs）的框移突变是已知的致病突变，它能使编码蛋白序列提前终止，产生截短蛋白或被降解，早期终止密

码子启动无义突变介导的 mRNA降解，大大降低 mR原NA表达及 LIG4蛋白表达，该位点人群发生率也极低。由于 LIG4综合征是一种常染色体隐性遗传病，患儿的父母为 1个突变位点的携带者，未见发病；患儿为同一基因的复合杂合突变，对 LIG4蛋白功能的影响大，使得患儿发病。LIG4综合征的患儿发病早、病情较重、早期致死，因此早期诊断并行造血干细胞移植是目前最有效

的治疗手段。国外已报道 1例 LIG4基因复合杂合突变（q1+H282L+R581fs）的患者免疫重建成功[9]。但是，移植成功率低、移植后并发症多、医疗费用昂贵等限制了其

临床应用。因此，避免患儿出生是产前诊断的根本目标。

该家族父母再次生育 LIG4综合征患儿的概率为 1/4，且胎儿期患儿无典型的外观异常，无法用影像学检查来诊

断，只能依靠基因测序。因此，本中心在患儿母亲再次妊

娠时，根据孕妇年龄、孕周行羊膜腔穿刺术抽取胎儿羊

水细胞，一部分进行胎儿核型分析；同时排除母源污染

后用 Singer法检测胎儿的 LIG4基因，验证胎儿携带与先证者相同的致病突变，告知家属其出生后将发展成

LIG4综合征患者，家属最终选择终止妊娠。此外，本中心已指导该夫妻想要生育健康的胎儿，可行三代试管婴

儿，即胚胎植入前产前诊断，防止该遗传病的传递。

综上所述，本研究采用目标序列芯片捕获 SCID发病相关基因，再通过高通量测序进行 LIG4基因突变检测。芯片捕获高通量测序技术是新一代的测序技术，相

较于传统单基因病成本高、适用疾病少、普及面低、通量

低的检测方法，它能在较短时间内同时对几十万甚至几

百万条 DNA分子进行序列分析，因此更适用于对单基因病隐性遗传病携带者的筛查与产前诊断[10]。本次研究完成了 1个 LIG4综合征家系的基因突变鉴定和再次妊娠的产前诊断，避免了高危胎儿的出生。

4 参考文献

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（收稿日期：2017-02-13）

（本文编辑：陈丹）

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