Lezione VI. Mappatura dei cromosomi eucariotici · sesso in Drosophila e nell’uomo ... Se la...

Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

Mappatura deicromosomi eucariotici


Mendel -> i caratteri di un individuo sono specificati da geni e sono ereditari

Ma dove sono i “geni” nella cellula?

Morgan -> alcuni caratteri vengono trasmessi di generazione in generazione allo stesso modo di come vengono trasmessi i cromosomi sessuali (ovvero alcuni caratteri sono specificati da particolari cromosomi che determinano il sesso dell’individuo)

I geni sono sui cromosomi?


Prova cruciale della teoria cromosomica

Esperimento di Bridges

♀ ♂

♀♂

atteso

XRXb occhi rossi ½

XbY occhi bianchi ½


ma da incroci su larga scala si puo’generare una “progenie eccezionale”

♀♂ atteso

XRXb occhi rossi ½


♀♂

occhi bianchi XbXb?

occhi rossi, sterili

+Progenie eccezionale primaria, 0.05%

xbxb xRy


XbXb? XRY

Progenie eccezionale secondaria

♀♂

attesoXRXb occhi rossi ½


♀♂

occhi bianchi XbXb?

occhi rossi, fertili

+Progenie eccezionale secondaria, 4%


Determinazione del sesso in Drosophila


Determinazione cromosomica del sesso in Drosophila e nell’uomo

Homo Sapiens ♀ ♂ ♂ ♀

Drosophila ♀ ♂ ♀ ♂

Specie XX XY XXY XO

Cromosomi sessuali


Determinazione del sesso in DrosophilaRapporto X:A


spiegazione


Origine della progenie eccezionale primaria


Origine della progenie eccezionale secondaria

XbXbY x XRYGameti XbXb /Y

Xb/XbYXR /Y

YYXYY

XbXbYXXbXbXbXb

YX

XbYYXXbYXbY

XbYXXbXb

YX

4%

♀ ♂♂ ♀


Bridges confermo’ la sua ipotesi con osservazioni citologiche dirette

Le ♀ eccezionali primarie avevano cromosomi sessuali di tipo XbXbY

I ♂ eccezionali primari avevano cromosomi sessuali di tipo XRO


I geni sono sui cromosomi e questo spiega la segregazione meiotica di caratteri indipendenti nella formazione dei gameti

AaBb

A e B su cromosomi diversi-> segregazione indipendente


E se i geni si trovano sullo stesso

cromosoma?

Geni associati


Geni associati

Geni su cromosomi diversi


Esperimento di Bateson & Punnett

-Studio di altri 2 caratteri del Lathyrus odoratus

1) colore del fiore (porpora/rosso)

2) forma del granulo pollinico (lungo/tondo)

PP pp

LL ll


IncrocioPP/LL x pp/ll

Pp/LlP

F1

435 (1)1338Rosso cortopp/ll

1303 (3)393Rosso lungopp/L-

1303 (3)390Porpora cortoP-/ll

3911 (9)4831Porpora lungoP-/L-

attesi (Mendel)

osservati

autofecondazione

F2


• I 2 caratteri non assortiscono in modo indipendente ma sono accoppiati (maggiore frequenza dei fenotipi identici ai parentali)

• Deviazione dalla seconda legge di Mendel

• Accoppiamento dei caratteri (Coupling)

• La comprensione del fenomeno si ottenne con gli esperimenti di Morganfatti su Drosophila

Osservazioni


plplparentale

pLpLricombinante

PlPlricombinante

PLPLparentale

Caratteri accoppiati

Caratteri indipendenti

Pp/Ll

Stessa probabilita’

Alta probabilita’

Alta probabilita’

Bassa probabilita’

Bassa probabilita’


Occhio rosso

Ali normali

Occhio porpora

Ali vestigiali

x

pr+pr+

vg+ vg+ vg vg

pr pr

F1

P

Esperimento di Morgan. IStudio di altri 2 caratteri 1) colore dell’occhio

2) grandezza dell’ala

Occhio rosso

Ali normali

pr+ pr / vg+ vg


Testcross

xF1

Occhio rosso

Ali normali

pr+ pr / vg+ vg

Occhio porpora

Ali vestigiali

pr pr / vg vg

Ci concentriamo solo sulla meiosi del doppio eterozigote


F2

710 (1)1195Porpora vestigialepr pr/ vg vg

710 (1)154Porpora Normalepr pr/ vg+vg

710 (1)151Rosso vestigialepr+ pr/ vg vg

710 (1)1339Rosso Normalepr+ pr/ vg+vg

attesi (Mendel)osservati


Osservazioni I.Coupling tra

pr+ e vg+e tra pr vg


Esperimento di Morgan. II

pr+ pr+ vg vg pr pr vg+ vg+

P x

F1

pr+ pr vg+ vg

occhio rossoala vestigiale

occhio porporaala normale

occhio rossoala normale


F1

pr+ pr vg+ vg

x

pr pr vg vg

Testcross


F2

558 (1)146Porpora vestigialepr pr/ vg vg

558 (1)1067Porpora Normalepr pr/ vg+vg

558 (1)965Rosso vestigialepr+ pr/ vg vg

558 (1)157Rosso Normalepr+ pr/ vg+vg

attesi (Mendel)osservati


Osservazioni II.Repulsion tra

pr+ vg+e tra pr vg


SpiegazioneI geni pr e vg sono fisicamente uniti sullo

stesso cromosoma, viaggiano insieme nella formazione dei gameti

I 2 caratteri vengono ereditati insieme nei gameti per questo motivo e’ maggiore la frequenza dei fenotipi uguali ai parentali

1 2


Come si spiega la comparsa dei non parentali?

Morgan sapeva che durante la meiosi i 2 cromatidi non fratelli ma omologhi duplicati si appaiano a formare un

chiasma


Ricombinantida assortimento indipendente

Fenotipi

Perentali50%

Fenotipi

Ricombinanti

50%


Ricombinantida crossing-over

Fenotipi

Perentali>50%

Fenotipi

Ricombinanti<50%


Il crossing over non avviene sempre in tutte le meiosiIl crossing over è un evento raro, solo una parte degli omologhi ricombina; questo spiega perché prevalgono i cromosomi parentali.


Ricombinanti nei cicli vitali aploidisemplice da determinare

Non c’e’ eterozigosi che puo’mascherare il carattere recessivo


Ricombinanti nei cicli vitali diploidi

Linee pure omozigoti

testcross


Importanza del testcross


La proporzione di progenie ricombinante varia a seconda di quali geni sono presi in esame

La frequenza di crossing over e quindi di ricombinanti ottenuti puo’ essere indicativa della distanza tra 2 geni

Osservazioni III.


Il numero di crossing over che si puo’ verificare tra 2 geni e’ funzione della loro distanza


Maggiore è la distanza tra i geni

associati, maggiore è la probabilità che si

verifichi uno scambio nella regione

compresa tra le due coppie e quindi

maggiore è la percentuale di meiosi nelle

quali si verifica uno scambio in questa

zona. Quindi, misurando la frequenza di

ricombinazione si può ottenere una

misura della distanza di mappa tra

coppie di geni.


Mappa di associazione

165Porpora vestigiale

pr pr/ vg vg

23Porpora Normale

pr pr/ vg+vg

21Rosso vestigialepr+ pr/ vg vg

191Rosso Normalepr+ pr/ vg+vg

osservatiSturtevant uso’ la percentuale di ricombinanti come indice quantitativo della distanza lineare di 2 geni

21+23/400=0.1111%

pr vg

11.0

locus locus

u.m. unita’ di mappa o cM

F2


La Mappatura genetica serve per

1.conoscere il genoma di una specie e confrontarlo con quello di specie vicine

2. Diagnosticare malattie genetiche associate a determinati geni (marcatori)

3. Migliorare varietà di interessezootecnico o agrario mediantecostruzione di ceppi particolari


Frequenza di ricombinazione (FR) di 0.01 (1%) corrisponde per definizione a 1 u.m.o 1 centiMorgan (cM)


Incrocio a tre punti

P

F1

F2


Distanza ed ordine dei loci sc/ec/cv295/3248=0.09 x 100= 9% sc-ec

342/3248=0.105 x 100= 10.5% ec-cv

633/3248=0.195 x 100=19.5% sc-cv

sc ec

9.0

locus locus

ec cv

10.5

locus locus

sc cv

19.5

locus locus

sc cv

19.5

locus locusec

locus


Altro casosc/sc ec/ec vg/vg X sc+/sc+ ec+/ec+ vg+/vg+

sc/sc+ ec/ec+ vg/vg+Triplo eterozigote

sc/sc ec/ec vg/vgXTriplo recessivo

P

F1

F2

16sc+ ec vg

14sc ec+ vg+

14sc+ ec vg+

233sc+ ec+ vg

12sc ec+ vg

1008

243sc ec vg+

241sc+ ec+ vg+

235sc ec vg Non c’e’ rapporto 1:1:1:1:1:1:1:1

Geni associatiParentali che assortiscono in

modo indipendente

con vg


Distanza ed ordine dei loci sc/ec/vg12+14+14+16/1008=0.055 x 100= 5.5% sc-ec

243+233+12+14/1008=0.498 x 100~ 50% ec-vg

243+233+14+16/1008=0.50 x 100=50% sc-vg

sc ec

5.5

locus locus

ec vg

50

locus locus

sc vg

50

locus locus


Se la frequenza di ricombinazione e’ pari al 50% ci dobbiamo chiedere se i geni sono associati o no-> situazione limite

In ogni caso, poiche’ la frequenza dei ricombinanti e’ 50%, anche se sono sullo stesso cromosoma, li consideriamo NON ASSOCIATI, poiche’ la loro distanza e’ talmente grande che la probabilita’ che intervenga un crossing over a disgiungerli e’ appunto pari al 100%. Allora il 50% dei gameti sara’ di tipo parentale (non avra’ subito il crossing over) e il 50% di tipo ricombinante (avra’ subito il crossing over)

A B

a b

A b

a B


Altro caso IIv+/v+ cv/cv ct/ct X v/v cv+/cv+ ct+/ct+

v/v+ cv/cv+ ct/ct+Triplo eterozigote

v/v cv/cv ct/ctXTriplo recessivo

P

F1

F2

5v+ cv ct+

3v cv+ ct

94v+ cv+ ct+

40v+ cv+ ct

89v cv ct

1448

45v cv ct+

592v+ cv ct

580v cv+ ct+ Non c’e’ rapporto 1:1:1:1:1:1:1:1

Geni associati

V=vermillion

cv= crossveinless

ct= cute (ali con bordi sfrangiati)


Distanza ed ordine dei loci v/cv/ct45+40+89+94/1448=0.185 x 100= 18.5% v-cv

89+94+3+5/1448=0.132 x 100~ 13.2% v-ct

45+40+3+5/1448=0.064 x 100=6.4% cv-ct

v cv

18.5

locus locus

v ct

13.2

locus locus

cv ct

6.4

locus locus


cv v

18.5

locus locuslocus

ct

19.6

5v+ ct+ cv

3v ct cv+

classi rare

592v+ ct cv

580v ct+ cv+

parentali

P

P

Doppio crossing-over

Ricombinanti che derivano da 2 eventi di crossing-over

0.064 0.132


Poiche’ si assume che la distanza di mappa e’funzione lineare del numero di crossing-over, ovvero dei ricombinanti, nel calcolare la distanza v-cv dobbiamo considerare i ricombinanti rari 2 volte, perche’ prodotti da 2 processi di crossing-over da cui:

45+40+89+94+3+3+5+5/1448=0.196 x 100= 19.6% v-cv

E’ stato possibile individuare il doppio crossing-over poiche’ il gene intermedio ct e’ in eterozigosi


interferenza

Nella maggior parte degli organismi superiori la formazione di un chiasma riduce la probabilità che un altro chiasma si formi in una regione adiacente. Il risultato netto di questa interferenza consiste nella formazione di un minor numero di doppi crossing over di quelli che si attendono rispetto alla distanza di mappa


dimostrazioneSecondo la regola del prodotto, il prodotto delle frequenze dei

ricombinanti nelle regioni adiacenti dovrebbe essere uguale allafrequenza dei doppi ricombinanti

Prodotto dei singoli crossing over0.132 x 0.064=0.0084 x 1448= 12.23 ricombinanti

Ma in realta’ se ne formano solo 8!

Stima dell’interferenza I = 1 –c.o.c =1 –

Frequenza doppi ricombinanti osservata

Frequenza doppi ricombinanti attesac.o.c.= coefficiente di

coincidenza


interferenza

AB BCAC

singolo doppio singolo


esempioIl cromosoma 3 del mais contiene 3 loci che possono portare gli alleli b e b+, v e v+, Ig e Ig+. Un incrocio di tripli recessivi con triplo eterozigote F1 per i 3 geni dà origine alla progenie F2 indicata in tabella. Dite qual e’ la sequenza dei geni sul cromosoma, calcolate la distanza di mappa tra i geni ed il coefficiente di coincidenza.

18b v Ig22+ + +66b v +

112+ v +74+ + Ig

1000

128b + Ig275b + +305+ v Ig Parentali + v Ig triplo

b + + eterozigote

Si calcola la distanza b-v in base al numero dei ricombinanti:

74+66+22+18/1000=0.18 x 100= 18 u.m.

Si calcola la distanza b-Ig in base al numero dei ricombinanti:

128+112+22+18/1000=0.28= 28 u.m.

F2


Si calcola la distanza v-Ig in base ai ricombinanti:

128+112+74+66/1000=0.38= 38 u.m.

Da cui si ricava che: v b Ig

18 u.m 28 u.m

38 u.m.

18 u.m. + 28 u.m.=

46 u.m.

Nel calcolo v-Ig abbiamo omesso i doppi ricombianti. Sapendo ora che la sequenza dei geni e’ v-b-Ig possiamo individuare i doppi ricombinanti, ovvero le classi piu’ rare:

v-Ig=128+112+74+66+22+22+18+18/1000=

0.46= 46 u.m.

I parentali diventano:

v + Ig+ b +

+ b +

v + Ig


Calcolo del coefficiente di coincidenza

Frequenza doppi ricombinanti osservata

Frequenza doppi ricombinanti attesa

c.o.c.=

c.o.c.=

(0.18 x 0.28) x 1000

22+18=

40

50.4= 0.79

Interferenza = I = 1-0.79=0.21= 21%

=

FDR(O)

FDR(A)


Natura del crossing overNel crossing over avviene uno scambio fisico di pezzi di

cromosomi omologhi (Creighton, McClintock)

Cromosoma 9 del mais

Due forme: una aberrante e una normale

Colore del seme

Composizione dell’endosperma

Studio di 2 loci sul cromosoma 9 del mais

nodo


x

Evidenza di scambi cromosomali nei ricombinanti

CC /wx wx cc /Wx Wx

Cc /Wx wx

Ricombinanti o


Mappa del cromosoma X di Drosophila


Linearita’ tra frequenza di ricombinazione e distanza di mappa


Linearita’ tra frequenza di ricombinazione e distanza di mappa

Quando 2 geni sono molto distanti tra loro si perde la linarita’ tra frequenza di crossingover e distanza di mappa. Si stima che fino a 20 cM c’e’ linearita’.

Quando le distanze tra geni sono molto grandi si tende a sottostimarle se ci si basa sulla frequenza di ricombinazione


Il crossing-over è molto meno frequente nella regione cromosomica intorno al

centromero e nelle altre regioni eterocromatiche ( = povere di

geni ), rispetto alle regioni eucromatiche


Crossing over mitoticoScoperto in Drosophila

y colore giallo del corpo

sn setole corte e ricurve

incrocio

y+ sn/y+ sn x y sn+/Y

y+ sn/y sn+♀ ♂

♀ selvatiche

(Stern)


Macchie gemelle in Drosophila(Stern)

In femmine y+ sn / y sn+

Troppo frequenti per essere un evento mutazionale


Crossing over mitotico

Macchia gialla

Macchia singed

Separazione dei cromatidi fratelli


Mappe di linkage dei cromosomi umani

Problematiche:

- Impossibile eseguire incroci controllati con individui testcross (piu’ facile per l’X)

- Numero limitato di figli, insufficiente per eseguire un calcolo affidabile delle distanze di mappa

- I geni umani posso essere separati da distanze molto grandi (necessita’ di individuare dei marcatori)


Mappe di associazione tramite analisi di alberi genealogici

Gli individui che manifestano la sindrome nail-patella(dominante) NPS1 presentano il gruppo B

4/13=0.30=30%=30 u.m.

In realta’ la distanza NSP1-locus dei gruppi sanguigni e’10 u.m.


MAPPAGGIO FISICOlocalizza i geni sui cromosomi dando una

posizione espressa con misure fisiche reali, cioè il numero di paia di basi (bp).1) a bassa risoluzione: permette di posizionare un gene su un cromosoma o in una regione del cromosoma; 2) ad alta risoluzione: localizza i geni con una precisione fino al singolo nucleotide


Mappaggio mediante ibridazione in situ con fluorescenza (FISH)Metodo diretto di visualizzazione della posizione di un gene. Impiega sonde a DNA o RNA marcate con fluorocromi che ibridano su DNA denaturato di cromosomi metafasici.I cromosomi marcati vengono osservati al microscopio a fluorescenza.


Un gene clonato puo’ essere usato per trovarne la posizione sui cromosomi mediante FISH

Tre diverse specie di conifere

Sonde: 5, 8S, 26S, 18S rosa; SGR-31 DNA satellite (verde)


Mappatura dei geni umani mediante ibridi somatici uomo-topo

I cromosomi umani vengono persi


Per eliminare gli ibridi topo/topo o uomo/uomo e per evitare la perdita dei cromosomi umani si usa un terreno selettivo

Terreno HATH hypoxantina

A aminopterina blocca la sintesi de novo degli acidi nucleici

T timidina

Le cellule murine mancano

dell’enzima TK fornito dalle

cellule umane mentre le cellule umane mancano

dell’hgprtfornito dalle

murine


Selezione degli ibridi somatici col sistema HAT

Mutante HGPRT-

HGPRTipoxantina->guanina

Via di salvataggio delle purine

Mutante TK-Timidinachinasi (TK)Timidina->acido

timidilico

Via di salvataggio delle pirimidine

aminopterinaprecursori semplici

normale

bloccata daSi ottiene daVie di sintesi dei nucleotidi

Mediante selezione in terreno HAT si possono ottenere ibridi somatici contenenti il gene umano che conferisce resistenza


Mappatura dei geni umani mediante ibridi somatici uomo-topo

Sendai virus o PEG

Estrazione dei cromosomi e loro analisi per l’individuazione


Una volta selezionate le cellule ibride vengono organizzate in una banca di linee che contengono ciascun differente

cromosoma umano

La presenza di uno specifico prodotto genico e’correlata con la presenza di uno specifico

cromosoma umano


Gli ibridi uomo/topo sono utili per determinare marcatori biochimici di cui può essere fatto uno

screening a livello cellulare con approccio biochimico, come pure per proteine di superficie

(FACS)

Ibrido con antigene umano di superficie

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