Les «neutrophil extracellular traps»ou NETs et leur ...rhumatologie-bichat.com/CHOLLET MARTIN...

Immunologie « Auto-immunité et Hypersensibilités »

GHPNVS, Hôpital Bichat

INSERM UMR 996, Université Paris-Sud

Pr Sylvie Chollet-Martin

Les « neutrophil extracellular traps » ou NETs

et leur implication dans la polyarthrite rhumatoïde

Neutrophil functions: state of the art in the early 2000s.

Mócsai A J Exp Med 2013

Brinkmann,

Science, 2004

La nétose : première description en 2004

Alberto Mantovani, Nature Rev Immunol, 2011

Nétose : libération de « neutrophil extracellular

traps » (NETs) par les PN activés

Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Structures composed of chromatin associated with nuclear histones and

various granular and cytoplasmic proteins.

Resting PN

Activated PN

Brinkmann, et al. Science (2004)

ββββ2integrine

image personnelle

Visualizing NETs using chromatin antibodies or DNA- intercalating dyes

Brinkmann V , Zychlinsky , JCB 2012

Protein composition of NETs

Urban, et al. PLoS Patho (2009)

Marin-Esteban, et al. (IAI)

Naugeri, Workshop (2010)

Traskelotase

α-enolaseGlycolitic

Enzymes

Cytokeratin-10

Plastin-2

α-actin 1 and 4

Miosin-9

Actin β and γ

Cytoskeleton

β2-integrin CD11bMembrane

S100 calcium-binding protein A8, A9 et A12Cytoplasm

HMGB1

MNDA

Histones: H2A, H2B, H3 et H4

Nucleus

ProteinsOrigin/Function

Traskelotase

α-enolaseGlycolitic

Enzymes

Cytokeratin-10

Plastin-2

α-actin 1 and 4

Miosin-9

Actin β and γ

Cytoskeleton

β2-integrin CD11bMembrane

S100 calcium-binding protein A8, A9 et A12Cytoplasm

HMGB1

MNDA

Histones: H2A, H2B, H3 et H4

Nucleus


CatalasePeroxysomal

BPI

LL-37

Gelatinase

Defensin 1 and 3

Lysozyme C

PR3

MPO

Cathepsin G

Azurocidin

Lactotransferrin

Elastase

Granules


CatalasePeroxysomal

BPI

LL-37

Gelatinase

Defensin 1 and 3

Lysozyme C

PR3

MPO

Cathepsin G

Azurocidin

Lactotransferrin

Elastase

Granules


Catalase 0,02%

Lysozyme C 0,13%

Actin 0,17%PR3 0,71%

MPO 1,01%

S100A9 1,4%

Azurocidin 2,7%

Cathepsin G 2,5%

S100A8 4%Lactoferrin 2,7%

H4 4,4%

Elastase 5,8%

H3% 14,5

H2A 26,3%

H2B 23,95%

MicroorganismesCytokines

pro-inflammatoires

Plaquettes activées

FcγR

Complexes immuns

PMA

PKC

NOX2PAD4

Noyau

FRO

Citrullination des histones

+

Protéolyse partielle

des histones

NE,

MPONE,

MPO Décondensation chromatine

Mélange des composants granulaires,

cytoplasmiques et nucléaires

+

rupture membrane plasmique

NETs

Ca2+

Désintégrationmembranes granulaires

Rupture membrane nucléaire

V Granger et al, Med et Sci, en révision

Intracellular signaling pathways leading to NET rel ease

Dwivedi N et al ARD, 2013

M Philipson and P Kubes, Nat Med, 2011

En fait…. plusieurs mécanismes de nétose

Suicidal NETosis vs vital NETosis.

Yipp B G , and Kubes P Blood 2013

Vital NETosis allows PMNs to maintain conventional host defensive functions.

Yipp B G , and Kubes P Blood 2013

Signal de

danger

Neutrophile

Cellule

dendritique

Lymphocytes

Les NETs peuvent-ils moduler la réponse immunitaire?

Blood PMN-derived NETs : production, isolation and characterization

A23187, 3h

Dextran/Ficoll

Netosis activation

NET isolation

Characterization and quantification

of NET compounds :

DNA, LF, H3, citH3, ELA

Alu I, 20 min

Blood PMN isolation

Barrientos et al. Front Immunol 2013

DNAProteins

Isolated NETs downregulate LPS-induced MoDC maturation and T-cell proliferation

NS NET LPS LPS/NET NS NET LPS LPS/NET

RF

I

Autologous Allogeneic

Barrientos et al., submitted

Réponse

anti-infectieuse

Maladies

auto-immunes

-Vascularite

-SLE

-Psoriasis

-PR …

- Destruction des

pathogènes

- Lésions

tissulaires

- Asthme

- Choc

anaphylactique?

Allergie

Rôle des NETs en physiopathologie

� Alowing a high local concentration of

antimicrobial components

� Promoting a physical containment of

microbes.

� Degrading bacterial virulence factors

� However, NETs antimicrobial activity is

regulated by microbial components

NETs play an important role in

combating pathogens

S. flexneri S. aureus C. albicans

Triggers Cell type Trapping Killing

Streptococcus

species

neutrophils + -

mast cells + -

Staphylococcus

speciesneutrophils + +

Pseudomonas

aeruginosa

mast cells + ?

neutrophils + -

Candida albicans neutrophils + +

Shigella flexneri neutrophils + +

Salmonella

typhimuriumneutrophils + +

Escherichia coli neutrophils + +

Aspergillus

fumigatus

Neutrophils

mast cells+ -

Aspergillus nidulans neutrophils ? +

Leishmania

amazonensisneutrophils + +

Leishmania

donovanineutrophils + -

Plasmodium

falciparumneutrophils + ?

Mycobacterium

tuberculosisneutrophils + -

Urban, et al. Cell Microbiol (2006); Kockritz-Blickwede, et al. Cell Microbiol (2007); Baker, et al. Malar J (2008); Ermet, et al. J Innate Immun

(2009); Ramos-Kichik, et al. Tuberculosis (2009); Guimaraes-Costa, et al. Proc Natl Acad Sci USA (2009); Yost, et al. Blood (2009); Lauth, et al. J

Innate Immun (2009); Bianchi, et al. Blood (2009); Bruns, et al. PLos Phatog (2010); Marcos, et al. Nat Med (2010); Gabriel, et al. J Immunol (2010)

Braedon McDonald et al, Cell host and microbes, 201 3

Intravascular NETs

are released in liver

sinusoids during

endotoxemia

Rapid in vivo NETosis during acute Gram-positive bacterial

infections is directly visualized in vivo.

Yipp BG et al, Nature Med, 2012

Case of invasive non typable Haemophilus influenzae

respiratory tract infection with NETs in sputum.

Hamaguchi S, J Infl Reserach 2013

NETs bactericidal effect

DNA

10

20

30

40

50

60

70

80

% B

act

eri

cid

ie (

E c

oli

+ P

LB-9

85

)

- DNase

*

S. Chollet-Martin et al. (IAI, 2012)

Afa/Dr diffusely adherent Escherichia coli (Afa/Dr DAEC)-induced NETs contribute

to bactericidy and ephitelial injury: a model of inflammatory bowel diseases

Caco-2/TC7

F-ACTIN

CD11b / DNA

+(PLB-985+E. coli)

- PLB-985 cells infected with enteropathogen E. coli (C1845) desorganize the actin

cytoskeleton of Caco-2/TC7 ephitelial cells.

- Prevented by PTX

Réponse

anti-infectieuse

Maladies

auto-immunes

-Vascularite

-SLE

-Psoriasis

-PR …

- Destruction des

pathogènes

- Lésions

tissulaires

- Asthme

- Choc

anaphylactique?

Allergie


Libération de

NETs

Manifestations

cliniques

Neutrophil elastase

Cathepsine G

Chromatin, histones,

Nuclear proteins

NETs

curare

IgG

FcγR

Neutrophile

Choc anaphylactique per-anesthésique aux curares

Etude NASA en cours (AP-HP, DGOS, IP)(collaboration P Bruhns, U760)

Réponse

anti-infectieuse

Maladies

auto-immunes

-Vascularite

-SLE

-Psoriasis

-PR …

- Destruction des

pathogènes

- Lésions

tissulaires

- Asthme

- Choc

anaphylactique?

Allergie


NETs et auto-immunité: Hypothèses

- La nétose permet la formation de protéines modifiées

(citrullination par la PAD4, liaison à l’ADN, oxydation…)

susceptibles de former des néo-épitopes antigéniques.

- Ces protéines sont exposées à l’extérieur de la cellule dans un

contexte inflammatoire, en contact direct avec l’environnement

tissulaire.

. Induction d’une réponse immunitaire contre ces

auto-antigènes.

. Effets délétères tissulaires des NETs

En 2013 : vascularite à ANCAlupuspsoriasis polyarthrite rhumatoïdediabète de type1…

Kai Kessenbrock, Nature Medicine, 2009

Co-expression de PR3, MPO, LL37 issus des

granulations avec l’ADN et les histones des NETs

Les sérums de patients avec

des auto-AC anti-MPO ou

anti-PR3 reconnaissent des

auto-Ag sur les NETs

Certains composants des

NETs peuvent induire une

réponse auto-immune

Vascularite à ANCA

LB

Y Y

TLR9

Y

Lésions tissulaires :

Glomérulonéphrite

Lésions cutanées

…

IFNα

« priming »

LL37

RNP

FcγR

Anti-ADN

HMGB1MPONE

Y YYC1qActivation du complément Protection contre

DNase 1Auto-anticorps

TLR9

YY Y

Auto-anticorps

Nétose

?

pDC

V Granger et al, Med et Sci, en révision

Yu C et al J Clin cell Immunol, 2013

Rôle des NETS au cours du lupus

Et dans la polyarthrite rhumatoïde ?

. Au cours du syndrome de Felty, présence d’auto-Ac se fixant

sur les NETs et dirigés contre les histones deiminés par la PAD4

Dwivedi et al 2011 et 2013

. Les NETs sont une source d’auto-Ag citrullinés variés et stimulent

la réponse inflammatoire au cours de la PR

Khandpur et Kaplan, Science Traslational medicine, 2013

Pratesi, ARD 2103

A model of potential factors involved in autoimmune pathogenesis of Felty's syndrome.


Autoimmune sera (SLE and Felty) react with NETsproduced after ex vivo LPS activation


List of deiminated autoantigens present on NETs

Autoantigen Disease Tissue localisation

Filaggrin RA Epidermis

Vimentin RA Mesenchymal cells

α Enolase RA Synovium

Fibrinogen RA Serum

Collagen Type I, II RA Synovium

Fibronectin RA Extracellular matrix

Myelin basic protein MS Neuron sheath

Eukaryotic translation initiation factor 4G1 RA Cytop lasm

F-actin capping protein α-1 subunit RA Synovium

Far upstream element-binding proteins (FUSE-BPs) RA N ucleus

Histones FS Neutrophil extracelluar Traps

•FS, Felty's syndrome; RA, rheumatoid arthritis.


Capacité augmentée de nétose des PN sanguins et articulaires

au cours de la PR en réponse au LPS

Khandpur et al, 2013

Corrélé avec :

CRP

ACPA

IL-17

Induction de NETs par des PN sanguins de témoins sains et de PR - réponse au PMA, LPS, IL-17

- Inhibition par inhibiteurs de FRO (DPI et NAC)


Induction de NETs par des PN de témoins sains et de PR- réponse au serum de PR- Inhibition par AC anti-IL-17 et anti-TNF


PN +

Composition

des NETs


Les NETs issus de PN témoins et de PN de PR expriment la vimentine citrullinée

Les NETs issus de PN témoins et de PN de PR expriment l’ énolase citrullinée


Les Auto-AC anti-vimentine citrullinée de patients PR se fixent

sur les NETs issus de PN contrôles


Les AC anti-vimentine citrullinée isolés de patients PR induisent une

forte nétose de PN de témoins sains


Les NETs isolés de patients PR augmentent l’expression des ARNm

de l’IL-6, l’IL-8, ICAM-1 et CCL20 des synoviocytes de patients PR et arthrose


RA sera bind to citrullinated H4 from isolated NETs (western blots)

Pratesi F et al. Ann Rheum Dis, 2012

Levels of anti-HCP1 and anti-HCP2 antibodies (H4 peptides) in RA and disease control patients, correlation with anti-CCP2

Pratesi F et al. Ann Rheum Dis, 2012

DNA Human IgG merge

ACPA –

serum

ACPA+

serum

Citrullinted proteins in NETs can be targets for ACPA in RA

S Chollet-Martin, unpublished data

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

PR CCP+ PR CCP- Lupus ANCA Donneurs

sains

N=15 N=9N=14N=27 N=13

Sé

rum

sp

osi

tifs

Pourcentage de serums de patients réagissant avec les NETs

S Chollet-Martin, unpublished data

cfDNA

Patie

nts P

R

Témo

ins s

ains

0

1000

2000

3000

4000

5000

cfD

NA

ng/

mL

ADN-MPO

Patie

n ts P

R

Témo

ins0.0

0.5

1.0

1.5

Nor

mal

ized

Opt

ical

den

sity

Dosage de l’ADN extracellulaire (Sytox Green)et des complexes ADN/MPO (ELISA) circulants

Résultats préliminaires (n=40 PR de l’étude AGORRA)

Résultats non publiés

10 100 1000 100000.0

0.5

1.0

1.5

cfADN (ng/mL)

MP

O/A

DN

(D

O)

0,69 (p

Implication of IL-1β in the induction of NET release from PMNs

treated with synovial fluid or serum from patients with gout

Mitroulis I, et al, PLOSone 2011

Synovial fluid-induced NET release by control PMN is decreased

by anakinra in vitro

Mitroulis I, et al, PLOSone 2011

2Saffarzadeh et al, Current Opinion in Hematology, 2013

Luc de Chaisemartin

Pascale Nicaise-Roland

Vanessa Granger

Sandy Peltier

Viviana Marin-Esteban

Lorena Barrientos

Immunologie « Auto-immunité et

Hypersensibilités » Hôpital Bichat, Paris

INSERM UMRS 996, Université Paris-Sud

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