Les m©diateurs solubles de l’immunit© inn©e

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Les médiateurs solubles de l’immunité innée. Le lysozyme : une Protéine AntiMicrobienne conservée au cours de l’évolution. - PowerPoint PPT Presentation

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Prsentation PowerPoint

Les mdiateurs solubles de limmunit inneLe lysozyme : une Protine AntiMicrobienne conserve au cours de lvolutionImmunit inneL'immunit inne ne ncessite pas d'apprentissage pralable, est gntiquement hrite et est prsente ds la naissance. Elle repose sur des mcanismes de reconnaissance et d'action trs conservs au cours de l'volution.

Trs rapidement mise en uvre, l'immunit inne est la premire intervenir lors de situations varies (atteintes des tissus, infection, cancer). C'est une premire ligne de dfense qui agit d'abord seule puis se prolonge pendant toute la raction immunitaire.2Les barriresLa meilleure faon d'viter l'infection tissulaire, c'est d'empcher l'introduction de l'agresseur : rle de la barrire cutanomuqueuse qui constitue la premire ligne de dfense de lorganisme.

Issu de http://anne.decoster.free.fr/immuno/immuno0.htm

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Les intrus 4Les dfenses de barrire

La peau et le sbum (rle antibactrien des acides gras)Le mucus et lescalator muco-ciliaireLes flores commensales (intestin, vagin, etc.)Colicine et diverses bactriocinesLes milieux acidesLes protines et peptides antimicrobiens (PAM)5Les Protines et peptides AntiMicrobiens chez lHomme (PAM)Enzymes : ex. lysozyme (250-500 mg/mL dans les scrtions nasales, salive, larmes)Lactoferrine (chlation du fer)Dfensines (feuillets b)b dfensines (HBD-1 et HBD-2)Peau et tractus respiratoirea dfensines (=cryptidines)Cellules de Paneth de lintestinCathlicidines (hlices a)Protines A et D du surfactant (opsonines primitives)

Rle essentiel dans les dfenses de premire ligne6Les Protines et peptides AntiMicrobiens : PAMProduits par de multiples types cellulairesGlandes sous-muqueusesCellules pithlialesCellules spcialises de limmunit naturellePolynuclaires neutrophilesMacrophagesSelon les cas, action extracellulaire, intracellulaire (sur des microorganismes phagocyts) ou les deux7Par exemple, sagissant de la production de Protines et peptides AntiMicrobiens par les phagocytes (polynuclaires neutrophiles, macrophages)

Les neutrophiles sont des cellules porteuses dun grand nombre de granules dont le contenu est riche de divers composants lytiques (dont le lysozyme). Les granules peuvent librer leur contenu lintrieur du phagosome ou lextrieur de la cellule.

8Exemples de PAMP (signatures)Flagelline des flagelles bactriensPeptidoglycane des bactries G+Lipopolysaccharide (endotoxine) des bactries G-ARN double brinADN non mthyl9

Les neutrophiles sont des cellules porteuses dun grand nombre de granules dont le contenu est riche de divers composants lytiques (dont le lysozyme). Les granules peuvent librer leur contenu lintrieur du phagosome ou lextrieur de la cellule.

10Zoom sur les mdiateurs de linflammation

PAMPrincipale ligne de dfense de Limmunit inneActivit chimiotactique favorisant le recrutement de monocytesRgulation de la production de cytokines pro-inflammatoiresInfluencent la rponse adaptative ?

Les extrmits des doigts, lavs, dun volontaire sain sont inocules artificiellement avec une souche de S. aureus ou dE. coli. Aprs exposition pendant 30 minutes, les extrmits des doigts sont appliques sur un gel dagar, et les colonies de S. aureus ( gauche) ou E. coli ( droite) dnombres. E. coli nest pas transfr, suggrant que la peau humaine produit de faon constitutive une dfense chimique capable de tuer les souches dE. coli.M/S Volume22,numro2, fvrier 2006,p.153-157Peptides antimicrobiens naturels cutans

Modifications morphologiques observes sur S. aureus trait par hBD-3 (b dfensine inductible pithliale) Sagissant du rle des PAM : 12Des souris dficientes en lysozyme M prsentent des lsions beaucoup plus svres aprs une injection sous cutane de M. luteus

Micrographies (MET) de lsions cutanes 7h aprs une infection par Micrococcus lutus chez des souris normales (A) ou dficientes en lysozyme (B). Sur le clich A, les bactries prsentent une paroi altre (fantmes marqus par des flches) et apparaissent intactes sur le clich B. (Ganz et al. Blood, 2003) et plus particulirement de celui du lysozyme : Choix du sujet dtude : le lysozymeProtine antimicrobienne produite par de trs nombreux organismes (animaux, vgtaux) et implique dans limmunit inne.Bibliographie abondante concernant cette protine, y compris rcente, depuis sa dcouverte en 1922 par Alexander Fleming.Premire enzyme et seconde protine (aprs la myoglobine) dont la structure tridimensionnelle a t tablie par radiocristallographie.Enzyme facile purifier, peu onreuse (lysozyme du blanc duf de poule p.ex) et prsentant une totale innocuit : donc facile manipuler en classe.Le lysozyme duf de poule

une seule chane protique forme globulaire 129 acides amins 4 ponts disulfuresmasse molculaire de l'ordre de 14,6 kDa.Mcanisme daction du lysozyme Le lysozyme permet la destruction du peptidoglycane de la paroi bactrienne :

Structure du peptidoglycaneLe lysozyme catalyse l'hydrolyse de la liaison osidique en b 1-4 entre la N-actylglucosamine (NAG) et l'acide N-actylmuramique (NAM)Consquences

Laction du Lysozyme en milieu hypotonique conduit la lyse bactrienne (nette chez les Gram +) visualisable par une chute de la turbidit de la suspension.

Mise en vidence de lactivit du lysozyme sur une souche sensible Dosage

Matriel:

Tampon phosphate pH 6,24:100 mL de dihydrognophosphate de potassium 0,066 M ajust pH 6,24 avec KOH 1M : tampon hypotonique.

Lysozyme de blanc d'uf :Lysozyme from chicken egg white, Sigma #L3790-1mL, solution stock en tampon phosphate 10 mg/mL)

Suspension deMicrococcus lysodeikticusMicrococcus lysodeikticus, ATCC No 4698, Sigma # M3770-5g): 0,015% en tampon phosphate (p/V) : 15 mg de bactries lyophilises dans 100 mL de tampon phosphate.

Une souche dE. coli :Souche isole sur une glose nutritive ( titre de contrle)Spectrophotomtre rgl sur 450 nm et cuves en plastique usage unique

Logiciel Excel (par exemple) ou autre tableur Protocole :Approche cintique et quantitative utiliser le spectrophotomtre en mode Acquisition manuelle ou en mode Cintique la longueur donde 450 nm ; raliser un blanc laide dune solution de tampon phosphate ; Introduire ensuite une cuve contenant 2,9 mL de suspension bactrienne (Micrococcus lysodeikticus) ; mesurer labsorbance pendant 2 minutes (temps entre chaque point de mesure 5 s) puis introduire dans la cuve 100 L de la solution de lysozyme tester ou 100 L de tampon potassium (contrle ngatif) - continuer la mesure dabsorbance pendant au moins 5 minutes ;les donnes sont exportes au format Excel pour tre exploites dans ce programme ; Remarque: Une unit de lysozyme est responsable de la diminution de labsorbance 450 nanomtres de 0,001/min 25C.

Exemple de rsultats obtenus avec le lysozyme humain sur une suspension de Micrococcus lysodeikticus

Densit optique 450 nmtemps en slysozyme 200 g/mLlysozyme humain 20 g/mLlysozyme 2 g/mLlysozyme 0,2 g/mLcontrle00,6410,6380,6370,6350,64250,6410,6380,6370,6350,642100,6410,6380,6370,6350,642150,6410,6380,6370,6350,642200,6410,6380,6370,6350,642250,6410,6380,6370,6350,642300,6410,6380,6370,6350,642350,4640,3070,5480,5710,642400,2960,2480,5030,5620,642450,2050,220,4370,5560,642500,1740,1970,390,5510,642550,1530,1770,3610,5450,642600,140,1630,3190,5370,642650,130,1490,30,5290,642700,1230,1380,2940,5230,642750,1180,130,2850,5170,642800,1140,1220,2760,5120,642850,1110,1160,270,5060,642900,1080,110,2650,50,642950,1060,1060,260,4940,642Traitement des rsultats

La vitesse initiale de raction (mesure par la pente lorigine de lajout de lysozyme pendant au moins une minute) est directement proportionnelle la concentration en lysozyme dans une gamme allant de 0.2 quelques g/ml.

Pistes dexploitations pdagogiquesDosage du lysozyme dans des liquides biologiques : srum, larmes, salive, laitComparaison de la teneur en lysozyme du lait de vache et du lait maternis.Dosage du lysozyme dans un antiseptique local(Lysopane) prconis en cas de mal de gorge peu intense, sans fivre ou d'aphtes, de petites plaies de la bouche.Lysozyme et volutionLe lysozyme est une enzyme produite par de trs nombreux organismes, animaux, vgtaux, (voire bactries et bactriophages) permettant, entre autres, la lutte contre les microorganismes.

Dans chacun des grands phylums dans lequel il a t identifi, le lysozyme prsente la capacit dhydrolyser la liaison -glycosidique entre le C-1 du NAM et le C- 4 du NAG du PG, voquant une conservation de son rle biologique dans les mcanismes de dfense inne au cours de lvolution.

Comparaisons de squences primaires et de structures : logiciels Rastop et AnagneEspce et nom du LysozymeOrigine et rfrence des donnesProtineNbre aaFichier .pdbGallus gallus (Poule)Lysozyme de type CNCBI Protine2VB1_A129 aa2VB1Homo sapiens (Homme)Lysozyme de type CNCBI Protine1JWR_A130 aa1JWRAnser anser anser (Goose = Oie)Lysozyme de type gNCBI Protine153L185 aa153 LBombyx mori (Papillon)Lysozyme de type CNCBI Protine1GD6_A119 aa1GD6Ruditapes philippinarum (Tapes japonica)Lysozyme de type iNCBI Protine2DQA_A124 aa2DQAHordeum vulgare (Orge)Lysozyme de type cNCBI Protine2BAA243 aa2BAAMytilus galoprovincialis (Moule mditerranenne)Lysozyme de type CNCBI ProtineAFM43653154 aaInexistantDistribution des diffrents types de lysozymes dcrits dans le rgne animalLe type c: plupart des Vertbrs dont les Mammifres; archtype : lysozyme du blanc duf de poule. Sur la base des squences gnomiques disponibles, on ne retrouve pas de lysozyme de type C chez les Invertbrs autres que les Arthropodes et les Cphalochords.Le Type g: dcrit initialement dans le blanc duf doie (Goose en anglais), dans les ufs de nombreuses espces doiseaux, majoritairement ou avec le lysozyme de type C. des gnes fonctionnels ont t dcrits chez certains Invertbrs, mollusques bivalves et Urochords.Le type i: ou type invertbr; premire squence dcrite chez un mollusq