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Les anticorps antinucléaires ANA

Nicole FABIEN

Service d’immunologie

Hospices Civils de Lyon

Joëlle GOETZ

Laboratoire central d’immunologie

CHU Strasbourg

René-Louis HUMBEL

Laboratoire Luxembourgeois d’Immuno-Pathologie

Luxembourg

LES COMPARTIMENTS NUCLEAIRES Spector

Antigènes membranaires

DOMAINE OPT

PORE NUCLEAIRE

Antigènes nucléaires

solubles

COMPARTIMENT

PERINUCLEOLAIRE

Antigènes chromatiniens

DOMAINE DE

TRANSCRIPTION

HETEROCHROMATINE

DOTS

MULTIPLE DOTS

Les compartiments du noyau et antigènes cibles des ANA

NUCLEOLE Antigènes nucléolaires

Antigènes nucléaires solubles

- TF II F

- P75 Act.

- RNA Pol III - RNA Pol I

- UBF (Nor 90)

ADN

Poly (ADR)

PMS1

Topo II PCNA

- hn RNP

- sn RNP (RNP,Sm) - SS-A (Ro)

- SS-B (La)

- U3 snoRNP

(Fibrillarine./Myo22/25)

ARNm ARNt ARNr

Nucléosome

Centromère

HISTONES

NUCLEOSOME

Mi2 ADN R

EP

LIC

AT

ION

ADN

Tip49 II

Hélicase hMYH

XRCC4

DNA-Ligase IV

DNA-K (Scl-70)

Topo I

Ku

(Ki/Si)

RIBOSOME

ARNt-Synthétases

CHROMATINE

HMG

HMG

CHROMOSOME Chromodomaine HP1p25

Pré-mRNA Pré-tRNA Pré-r-RNA

Réticulum Endoplasmique

PROTEINES RIBOSOMIQUES (PO,P1,P2,L7,L10,L12,L14,S10)

Signal Recognition

Particule

Jo1, PL7, PL12, EJ, 0J, SC, KJ

Elongation factor EF1 (Fer)

- RNA Pol II

- PML/Sp100

- OPT

- TF III F - ASE

- SLI

- TTF1

- nucléoline

- RNA Hélicase II (Gu)

- RNAse MRP

- B23 - Th/To

- PMScl (PM-Scl)

-SPOP

-SR

-Coiline p80

Cibles des ANA: noyau et cytoplasme D’après Pr.R.L Humbel , LLIP, Luxembourg

Cytoplasme Cytoplasme

antigènes

chromatiniens

antigènes

nucléolaires

antigènes

nucléoplasme

615 protéines

29 protéines

136 protéines

271 protéines

23 protéines

ANA

antigènes nucléaires ET cytoplasmiques

SYNDROME DE GOUGEROT-SJOGREN

MAI systémiques MYOPATHIES AUTO-IMMUNES

LUPUS SYSTEMIQUE

SCLERODERMIES SYSTEMIQUES

ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques

Ac anti-ADNdb, Sm, Ro±La, RNP,Ku

Ac anti-SS-A (60 kDa) ±SS-B

Ac anti-centromères, Scl-70 fibrillarine, ARNpol3

Ac anti-t-RNA synthétases, SRP, Mi2, Ku

ANA et diagnostic des hépatopathies auto-immunes

polyarthrite rhumatoïde

Situations cliniques avec ANA (HEp-2)

Données cliniques % sujets ANA +

Lupus érythémateux systémique > 95

Sclérodermie systémique 60 - 90

Syndrome de Gougerot-Sjögren 40 - 70

Dermatomyosite, polymyosite 40 - 70

Connectivite mixte 100

Polyarthrite rhumatoïde 15 - 50

Hépatopathies auto-immunes (*HAI type 1) Variable – 70*%

Thyroïdite auto-immune 30 - 50

Purpura thrombopénique idiopathique 10 - 30

Sclérose en plaques 25

ANA: facteurs prédictifs

avant les symptômes cliniques du LES:

moyenne de 3.3 ans à 9.4 ans

• 1 ANA + : 88% des 130 patients atteints de LES

• ANA (IFI) au 1/120 78%

• Anti-ADNdb 55%

• Anti-SS-A/Ro-60 29-47%

• Anti-SS-B/La 34%

• Anti-Sm 32%

• Anti-U1RNP 26%

• Anti-phospholipides 18%

Arbuckle MR et al. (N Engl J Med, 2003)

Heinlen LD, et al. (PLoS ONE 2010)

Excitation dans l’UV Emission fluorescente

Y Ac anti-IgG humaines marquées par un fluorochrome

Auto-Ac du patient

Fluorescence mouchetée

Fluorescence homogène

Fluorescence nucléolaire

Fluorescence cytoplasmique

Anti-ENA: SS-A, SS-B, Sm, U1 RNP Anti-ADN natif ou db Scl-70, fibrillarine, PM/Scl ARNt synthétase (JO1, PL7,PL12) SRP, ribosomes

Recherche des ANA au laboratoire d’immunologie: IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE = GOLD STANDARD Antigènes nucléaires solubles du noyau : ENA

Chromatine/ADNdb/nucléosomes Antigènes nucléolaires

Antigènes cytoplasmiques

Cellules “HEp2” = HeLa Dépistage: première dilution:

1/80 ou 1/160 ou 1/320

Titre: dilution de deux en deux: 1280 B 40 : 10.80 Euros

Fluorescence mouchetée

Fluorescence homogène

Fluorescence nucléolaire

Fluorescence cytoplasmique

Anti-ENA: SS-A, SS-B, Sm, U1 RNP Anti-ADN natif ou db Scl-70, fibrillarine, PM/Scl ARNt synthétase (JO1, PL7,PL12) SRP, ribosomes

Recherche des ANA au laboratoire

IDENTIFICATION: autres techniques

ELISA, fluorimétrie en flux,dot Farr, ELISA, crithidia ELISA, fluorimétrie en flux, dot

DEPISTAGE: IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE

Nomenclature Ac anti-ENA (Extractable Nuclear Antigen) 2ères lettres du nom du 1er malade chez lequel l’Ac a été mis en évidence Sm, Ro, La, Ku, Jo-1 Maladie associée : Scl-70, SS-A, SS-B, PM-Scl Nature de la cible :U1-RNP, PCNA, ARN-t synthétases Technique de mise en évidence: immunoprécipitation, precipitin line (PL): PL-7, PL-12

ANA positifs en Immunofluorescence indirecte

identification de l’antigène cible

*Stratégie consensuelle des laboratoires si titre ≥ 320 avec aspect

homogène Ac anti-ENA + ADNdb recherchés

moucheté Ac anti-ENA recherchés

Données cliniques !!!

*ANA positifs quel suivi?: inutile !!!

/ ADNdb

-Bilan initial

ANA, anti-ADNdb, anti-SS-A/SS-B, anti-RNP, anti-Sm, anti-phospholipides, C3, C4

-Suivi de l’activité de la maladie

anti-ADNdb, C3, C4, anti-SS-A/SS-B: avant une grossesse

Recommandations de la Ligue Européenne de Lutte contre le Rhumatisme pour le suivi des patients présentant un LES en pratique clinique et dans les études observationnelles.M.Mosca et col ; Ann Rheum Dis 2010 : 69

* Sauf grossesse, *sauf évolution clinique

Utilité de répéter la recherche des ANA connus positifs?

questionnaire: rhumatologues, internistes, dermatologues, pneumologues

Autoanticorps Chaque

consultation Une fois

/trimestre Une fois

/semestre Une fois

/an Ne doit plus être

prescrite

Anti-nucléaires (ANA) par immunofluorescence indirecte * 55% 45% *

Anti-centromères par immunofluorescence indirecte 25% 75%

Anti-ADNdb* grossesse 25% 25% 50%

Anti-ENA identifiés: SS-A, Sm, U1RNP, Scl-70, JO1 50% 50%

Valeur diagnostique des ANA positifs > si la cible antigénique est identifiée

Données cliniques % sujets ANA +

Infections Δ, si chronique 10 – 50

Cancers Variable

Fibromyalgie 15 - 25

ANA induits par médicaments 50 -100

Implants mammaires en silicone 15 - 25

Sujets apparemment sains

Population normale (titre 1/160) 5 %, F > M

Apparentés de sujets avec connectivite 5 - 25

Grossesse 5 - 10

Patients âgés de plus de 60 ans 20

0

5

10

15

20

25

30

35

≥ 1/40 ≥ 1/80 ≥ 1/160 ≥ 1/320

ANA dans une population témoin 21 à 60 ans (Tan. Arthritis Rheum 1997;40:1600)

• 1/40 = 31,7 % 1/80 = 13,3 % • 1/160 = 5,0 % • 1/320 = 3,3 %

Titre 80 160 320

Sensibilité 73 60 38

Spécificité 69 81 96

LR + 2 3 8

LR – 0.7 0.5 0.4

PPV 51 59 79

NPV 85 82 77

Situations cliniques avec ANA « faux positifs » le plus souvent sans antigène cible identifié

ANA induits par les médicaments

Anti-arythmiques: quinidine,(procainamide)

Antibiotiques: minocycline, isoniazide

Anti-convulsivants: carbamazépine, phénytoïnes

Anti-hypertenseurs: β bloquants, (hydralazine), captopril, α méthyl-dopa

Anti-inflammatoires : D pénicillamine,sulfasalazine

Anti-psychotiques : chlorpromazine

Antithyroïdiens: PTU

Biothérapies : anti-TNF α, IL-2, IFN-α, β, γ.

Hypocholestérolémiants : fénofibrate, statines

Titre variable

Images de fluorescence variable : homogène, nucléolaire, moucheté

Les ac anti-histones ne sont plus recherchés car ils ne sont pas des marqueurs de lupus induit

Disparaissent à l’arrêt du traitement

ANA induits par des agents infectieux

Infections virales : EBV, VH C, VHA, VH B, parvovirus B19, VIH, virus Coxackie, influenza, rougeole, varicelle

Maladies bactériennes : maladie de Lyme, infections à streptocoques, tuberculose, endocardites lentes

Parasitoses : leishmaniose

Titres généralement faibles mais cas avec titres élevés

Présence transitoire

ANA et cancers

Epiphénomène? Modification des antigènes lors de la cancérogénèse?

Avant l’apparition ou au cours de cancers (traitement?) * ANA et LMNH

* Ac anti-Scl-70 associé à un risque accru de cancer

* Ac anti-TIF1 : marqueur de DM associé au cancer (adulte)

Titre et aspect de fluorescence variable mais parfois très typique

Ac anti-Mitotic Spindle Apparatus 2

50 % à 70% des sujets +: cancer hépatique, mammaire, ORL, lymphome

Ac anti-centromères F

Sclérodermies

et cancer

ANA positifs par quelle technique?

Prudence dans l’interprétation

ANA positifs en test d’identification

*ANA avec aspect non compatible en IFI

anti-Scl-70 (aspect moucheté )

anti-U1 RNP

Aspect de type moucheté dense

Ac anti-DFS70 (dense fine speckled, 70 kDa)

Lens epithelium derived growth factor p75 (LEDGF/p75)

= maladie non auto-immune? Étude GEAI en cours

Marquage granulaire dense des noyaux en interphase

+ chromosomes condensés /Cellules en mitose

ANA positifs en IFI Prudence dans l’interprétation

*ANA négatifs en IFI

anti-ADNdb (ELISA/fluorimétrie)

anti-SRP, PL

anti-SS-B sans anti-SS-A

Ac anti-SmD : 10% spécificité > 95%

Ac anti-SS-A (60 kDa) ± SS-B : 35%

quelques faux négatifs en IFI ou très faibles titres ou cytoplasmiques

Ac anti-Ro/SS-A 52 kDa (= Ac anti-TRIM 21)

Aucune utilité diagnostique en pratique médicale, BAV?

Horton, Hépatite virale, Cirrhose éthylique, LMNH (D.Lakomy, N.O.Olsson Dijon)

mélange de protéines!!! SS-A60+TRIM21(SS-A52): risque de faux + SS-A 60

Ac anti-U1 RNP 70kDa (« Sm/RNP ») : 30% Ac anti-Ku : 5-10%

Ac anti-PCNA: 5% spécificité? thyroïdite, PR, hépatite autoimmune, sclérodermie, rhumatisme psoriasique , fibromyalgie

X. Bossuyt, Leuven, D.Lakomy Dijon

!


LUPUS ERYTHEMATEUX SYSTEMIQUE

!

Ac anti-ADN double brin/natif



Prévalence Spécificité

RIA: test de Farr 60-80% - 70-95%

Crithidia 15-75% - 93-100%

ELISA 90-96% - 19*-82% * certains/Ag utilisés:ADNdb purifié, ADN plasmidique

Fluorimétrie ??-96% ?

quelle technique?

Syndrome de Gougerot-Sjögren Hépatites auto-immunes Médicaments : anti-TNF α, D-pénicillamine, sulfalazine,

Virus : Parvovirus B19 (IgM)

!

Ac anti-nucléosomes

Prévalence 85%

10 à 30% patients ac anti-ADNdb négatifs

Nucléosomes purifiés ou reconstitués: tests non standardisés

Ac anti-ribosomes

Prévalence 12-42%

Très spécifiques du lupus!! > 98%

Manifestations neuropsychiatriques? Neurolupus?



ANA : prévalence

Anti-SS-A/SS-B 60-81%

FR 60%


Syndrome de Gougerot-Sjögren

MAI systémiques MYOPATHIES AUTO-IMMUNES

SCLERODERMIES SYSTEMIQUES


Ac anti-centromères, Scl-70, fibrillarine, ARNpol3

Ac anti-t-RNA synthétases, SRP, Mi2, Ku

Sclérodermie systémique limitée: 20-57-82%

Sclérodermie systémique diffuse: 5-8%

Syndrome de Raynaud I: 25 %

Anticorps anti-centromères A, B, C Protéines de 19 - 80 - 140 kDa /Attachement fuseau de mitose

Meilleur pronostic / autres Ac

survie à 5 ans(2000) 86%

Valeur prédictive pour le développement d’une sclérodermie

Spécificité : excellente?

Confirmation possible: Dot/ELISA/Fluorimétrie en flux


SCLERODERMIES

Basedow rares cas

Cancer poumon rares cas

Cancer sein 33 %

CBP 9 – 30 %

Connectivite mixte rares cas

Déficit en IgA 5 %

LES 2 – 5 %

PR rares cas

PTI rares cas

Sjögren 2 – 27 %

Vitiligo rares cas

Témoins sains 0 – 10 %

Discordance: identification positive (dot /ELISA/fluorimétrie)

MAIS IFI négative: rares cas de sclérodermies

(N.O Olsson, CHU Dijon et groupe du GEAI)

Autoanticorps anti-Scl-70 Topo-isomérase I, Protéine de 105 kDa: produit de dégradation de 70 kDa

Nucléoplasme + Centre fibrillaire du nucléole

Relaxation de l’ADN compact/Transcription de l’ADN ribosomal

Identification indispensable

Dot/ELISA/Immunodiffusion/

Fluorimétrie en flux/ Westernblot

Pronostic sévère: Fibrose interstitielle diffuse, HTAP, cancers


Persistance des anticorps: pronostic plus sévère

Sclérodermie systémique diffuse: 20-50-70 %

Sclérodermie systémique limitée: < 10%

Association avec anti-centromères: très rare

Polymyosite/sclérodermie: 12%


SCLERODERMIES

Antigène purifié/recombinant humain: Faux positifs

Spécificité: 90-98%

Autoanticorps anti-ARN Polymerase III

Sclérodermie systémique limitée: 2-6% Sclérodermie systémique diffuse: 13-23%

2 Cohortes (Paris et Lyon): 9-11%

Spécificité: 98% LES

Pronostic plus sévère/anti-Scl-70 ? HTAP, fibrose pulmonaire Crise rénale sclérodermique carcinomes

Anti-nucléolaires = sclérodermies autres maladies autoimmunes: présence d’aAcs anti-ADN db, anti-SS-B , anti-ribosomes: maladies non autoimmunes: anémies, maladies hépatiques, carcinomes

Autoanticorps anti-nucléolaires

Identification de l’antigène cible indispensable dot/ELISA/radioimmunoprécipitation

Autoanticorps anti-Fibrillarine: prévalence et intérêt clinique

Sclérodermie systémique limitée: 10% Sclérodermie systémique diffuse: 5-18% Spécificité: 95-97% LES, PR, Sharp, S.Sjögren

Pronostic sévère survie à 5 ans (2000) 77%

Atteinte pulmonaire, HTAP, fibrose Atteintes musculaire, rénale, cardiaque télangiectasie, lésions cutanées diffuses calcinose, myosite

Identification : Unicap/radioimmunoprécipitation/Immnoblotting / dot

Antigène recombinant humain

Uniquement si marquage nucléolaire

Autoanticorps anti-PM/Scl complexe macromoléculaire nucléolaire: 11 Protéines de 20 à 110 kDa

Principaux antigènes cibles de 75 kDa et 100 kDa

Fonction exoribonucléase, dégradation de l’ARN dans le noyau

Identification : ELISA/Dot/Immunodiffusion

Uniquement si marquage nucléolaire

Association avec les Ac anti-SCl-70 (9-35%)

Chevauchement

Sclérodermie systémique/myosite: 5-55%

Sclérodermie systémique diffuse: 2-3%

Polymyosites isolées: 7-8%

Dermatomyosites isolées: 6-11%

Spécificité 90-98%

LES, S. Gougeröt-Sjögren

Manif. cutanées limitées, PM, calcinose, ulcères digitaux

Marqueur de faible évolutivité ?


Marqueur de pronostic sévère ? (manifestations pulmonaires sévères / cancers)

Autres ANA avec Images nucléolaires

Identification: Radioimmunoprécipitation, dot

Signification des ac anti-NOR90?: lupus, sclérodermie, PR, Gougerot, CBP, hépatocarcinome, mélanome

Anticorps Antigènes cibles

Formes

limitées

Formes

diffuses Aspect nucléolaire

Th/To

HTAP, Hypothyroïdie survie à 5 ans(2000) 65%

Protéines nucléolaires et

cytoplasmiques

40 kDa ARN 7-2 Th et 8-2 To RNA

8- 19%

1-11%

homogène

NOR-90

Protéines de 90 kDa associées à

l'Antigène

organisateur nucléolaire

Upstream binding factor Nucleolar

transcription factor I 2% ponctué

ARN polymérase I ARN polymérase I 4% moucheté fin

Nouvelle classification des myopathies

Consensus d’experts 119th European Neuromuscular Centre International Workshop 2004, Hoogendijk 2004, Troyanov Y 2005

Place importante des ANA dans le diagnostic

*Dermatomyosites

*Polymyosites

*Myosites de chevauchement définies par la présence d’autoanticorps

*Myopathie nécrosante médiée par le système immunitaire

*Myosites associées aux cancers

*Syndrome « des anti-synthétases » myosite : polymyosite >> dermatomyosite

- et/ou pneumopathie interstitielle diffuse (50 à 100 %)

- et/ou polyarthralgies (90 %)

- et/ou atteinte cutanée : « mains de travailleurs », et/ou Raynaud (60%)

- avec présence d’autoanticorps anti-synthétase

- autres maladies auto-immunes : Gougerot-Sjögren (27%), sclérodermie systémique (30%), PR, LES

*Autres myopathies inflammatoires ou génétiques

myosites à inclusion

dystrophie musculaire des ceintures

myopathies génétiques


Myopathies

ANA = marqueurs diagnostique et nosologique = entité clinique

SRP

Mi2

Jo-1

Zo

Ha 0J

PL-12

Ac

anti-ARNt-synthétase

EJ

SC

JS

K

S

PM/Scl

Atteinte pulmonaire Marqueur de Sévérité Marqueur de bon pronostic

PL-7

20-25%

3-10%

3-5%

1-3%?

1-3%?

<1%

< 1%

<1%

<1%

Autoanticorps anti-Jo-1

Recherche des Ac anti-JO1 uniquement si fluorescence typique: risque de faux négatif !!!!

Polymyosite 19-33 %

Dermatomyosite 5-16%

Spécificité 95-99% (Importance du taux) Facteur de mauvais pronostic

Myopathies autoimmunes avec fibrose pulmonaire

Association à des cancers?

Polymyosite: 3-7%

Dermatomyosite: 3%

Myopathie adulte : 5% myopathie nécrosante à anticorps anti-SRP Atteinte musculaire sévère résistante à la corticothérapie,

rhabdomyolyse, atteinte cardiaque, pas d’atteinte cutanée,

atteinte pulmonaire rare

Ac anti-Signal Recognition Particle (SRP) ARN7S+ 6 protéines (SRP9,14,19,54,68,72) passage des protéines synthétisées par les ribosomes à travers la membrane du RE épitopes localisés au niveau de l'extrémité N-terminale et du domaine central G de la sous-unité SRP54

Estomac HEp2 Foie

Anti-PL-7: 3-5%

polymyosite > dermatomyosite

chevauchement sclérodermie/myosite

Anti-PL-12

pneumopathie interstitielle diffuse sans signe

de myopathie/PM>DM

Ac anti-aminoacyl-ARNt-synthétase

anti-PL-7 : thréonyl-ARNt-synthétase

anti-PL-12 : alanyl-ARNt-synthétase

Dépistage HEp2

Identification: Dot, Immunodiffusion, RIA Identification: Dot, RIA

Dermatomyosite: adulte 5-21 % et enfant 4-16 %

Spécificité: 97% (lupus en phase active)

corrélation négative /néoplasies, parfois atteinte pulmonaire

bon pronostic

Autoanticorps anti-Mi2

protéine CHD4 (chromodomain hélicase DNA binding protein)

complexe de 7 peptides 2 sous-unité Mi2 et Mi-2b

hélicase impliquée dans l'activation de la transcription

HEp2

aspect moucheté fin

liseré

Identification: Dot, ELISA,

Immunodiffusion, Western blot

aAc anti-Mi1 non spécifiques

Autres ANA d’intérêt Aspect en immunofluorescence ? ou à valider

HMGRC / Statines SAE

TIF1

Atteinte pulmonaire Marqueur de Sévérité Cancers associés

P140/MJ (NXP2)

MDA-5

CADM-140

•Dermatomyosite amyopathique: 50-73%

•Dermatomyosite :3-35%

• Dermatomyosite juvénile +PID: 38%

•Risque ++ PID rapidement progressive

Transcriptional Intermediary Factor 1

Dermatomyosite adulte et enfant: 17%- 21%

Recherche approfondie d’un cancer associé

carcinomes pulmonaires > digestifs > ovariens ou

mammaires

IFI?: aspect finement moucheté, nucléoles négatifs,

faible titre

NXP2 (Nuclear matrix protein 2 )

Dermatomyosite juvénile: 18% à 28%

IFI?: moucheté à gros grains, nucléole négatif

Dermatomyosites amyopathiques: 8.4

Autoantibodies against 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in

patients with statin-associated autoimmune myopathy.Mammen A.L et coll

Arthritis Rheum. 2011Prévalence: 750 patients présentant une myopathie 6%

IFI?: cytoplasmique?

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21360500

ANA et Polyarthrite rhumatoïde

Prévalence: 15-50%

Parfois titres élevés

Aspect variable: homogène , moucheté

Sans spécificité

sauf anticorps anti-ADNdb au cours des biothérapies

ANA et diagnostic des hépatopathies auto-immunes

Anti-mitochondrie 2

Anti-LKM1

Anti-LC1

Anti-actine

ANA Titres significatifs = critère diagnostique des HAI (2 grilles de scores des HAI)

Prévalence: 70% HAI -1

Ac anti-actine détectés lors de la recherche d’ANA sur HEp2

Ac anti-membrane nucléaire (gp210, Nup 62)

Ac anti-dots

30% CBP

Ac anti-mitochondries détectés lors de la recherche d’ANA

Ac anti-centromères: pronostic + sévère CBP

Les anticorps antinucléaires : IFI + identification

Marqueurs diagnostiques et/ou pronostiques et/ou phénotypiques des maladies auto-immunes systémiques et des hépatopathies auto-immunes

Importance d’identifier la cible des ANA Importance du dialogue clinicien-biologiste!!!

* Orientation vers une recherche plus fine des autoanticorps associés/ maladies auto-immunes * Choix des meilleures techniques d’identification

MAIS détectés *pathologies non auto-immunes

Infections Cancers

*induits par des médicaments *âge des patients > 60 ans

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