Le strutture batteriche

Il peptidoglicano (PGN)

Il Peptidoglicano (PGN): [1]

• Il componente principale della parete batterica• Responsabile della conformazione e della rigidità della parete

Il Peptidoglicano (PGN): [2]

Preserva l’integrità della cellula battericaL’’inibizione della biosisntesi del PGN, sia attraverso mutazioni, sia attraverso il trattamento conantibiotici, o la rottura della struttura del PGN (lisozima) si accompagna alla lisi della cellulabatterica.

Contribuisce al mantenimento di una forma definita

Serve come scaffold per le altre componenti della parete

È assente in alcuni batteri: Mycoplasma, Planctomyces e in alcuni ceppi diRickettsia

In Chlamidia, seppur presenti i geni per la biosintesi del PGN, non è stato maiidentificato

Resistenza del PGN

• Unica grossa molecola nelle tre direzioni dello spazio

• Legami b-1,4 particolarmente forti

• Presenza di zuccheri non comuni (MurNac)

• Alternanza di aminoacidi D e L risulta in una resistenza

maggiore

• Sembra che tra i vari gruppi peptidici si stabiliscano

numerosi legami idrogeno

COMPONENTE GLUCIDICA

Catene lineare di n unità di un disaccaride:

N-acetil-D-glucosammina (NAG)

Acido N-acetil-muramico (NAM)

COMPONENTE PEPTIDICA

Corta catena di aminoacidi (TETRAPEPTIDE) alternati negli stereoisomeri D e L

Il Peptidoglicano (PGN)

Il Peptidoglicano (PGN): il legame delle catene peptidiche [1]

Il Peptidoglicano (PGN): il legame delle catene peptidiche [2]

I tetrapeptidi

I tetrapeptidi si legano tra di loro con due modalità principali:1) DIRETTAMENTE (nei Gram negativi)2) INDIRETTAMENTE (nei Gram positivi)

Il Peptidoglicano (PGN): [3]

Le catene glicaniche vengono assemblate attraverso l’oligomerizzazione di unità disaccaridiche/peptidiche.

Queste reazioni sono catalizzate da numerosi enzimi e vengono indicate come reazioni di transglicosilazione.

È posibile stabilire una lunghezza delle catene glicaniche?

La lunghezza media delle catene varia considerevolmente da batterio a batterio e all’interno della stessa popolazione rispetto alla fase di crescita, alla composizione del mezzo di crescita, presenza/assenza di antibiotici, condizioni di crescita extra/intra cellulari

Nel PGN dei Bacilli, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis, lo sheletro saccaridico ha una lunghezza compresa tra le 50 e le 250 unità saccaridiche

Negli Staphilococchi, S. areus, le catene sembrano essere molto più corte con una lunghezza media di 18 unità

Biosintesi del PGN

Biosintesi del PGN

La sintesi del PGN ha luogo in tre diversi compartimenti

1. Fase citoplasmatica2. Fase di membrana 3. Fase periplasmatica

Fase citoplasmaticaSintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica

Fase di membrana Assemblaggio del glican-pentapeptide e attraversamento della membrana citoplasmatica

Fase periplasmaticaPolimerizzazione del PGN (reazioni di transglicosilazione) e formazione dei legami crociati (reazioni di transpeptidazione)

Fase citoplasmatica (stage I)

Sintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica

Sintesi del NAG

Si parte dal fruttosio-6 fosfato e attraverso l’azione coordinata di diversi enzimi si arriva alla formazione del primo substrato attivato del PGN: l’UDP-NAG

Fase citoplasmatica (stage I)

Sintesi dei precursori di natura saccaridica e proteica

Sintesi del NAM

UDP-NAM

Nucleotide di Park

Fase di membrana (stage II)

Formazione del glican-pentapeptide e traslocazione nel periplasma

Bactoprenolo

Fase di membrana (stage III)

Polimerizzazione del PGN e formazione dei legami crociati

Fase di membrana (stage III)

Polimerizzazione del PGN e formazione dei legami crociati

Sintasi mureinicheEnzimi presenti fino a circa 200 copie per cellula batterica

Possono essere 1. monofunzionali e quindi agire o come transpeptidasi (TP) o come transglicosilasi

(TG)2. Bifunzionali: hanno attività sia di TP che TG

• Tutte le sintasi mureiniche sono ancorate alla membrana citoplasmatica grazie a un dominio transmembrana adiacente la regione N-terminale (citoplasma)

•Il dominio catalitico è presene all’estremità C-terminale

•Un gruppo specifico di sintasi con attività TP sono le PBPs (penicillin-binding proteins)

PBPs in E. coli

Il Peptidoglicano (PGN): [4]

Come per l’LPS anche per il PGN esistono numerose modificazioni, che si realizzano sia a carico dello scheletro glucidico, sia a livello della componente proteica.

1. le modificazioni della componente saccaridica possono essere fatte rientrare nelle seguenti categorie: deacetilazione, acetilazione, glicolilazione2. Le variazioni della componente peptidica (peptide stem) sono ascrivibili a due meccanismi:

a) azione degli enzimi Mur (durante la biosintesi)b) fasi tardive della biosintesi: amidazione, acetilazione,

idrossilazione, aggancio di gruppi proteici

Le maggiori variazioni si osservano a livello dell’aminoacido in terzaposizione!

Il Peptidoglicano (PGN): Modificazioni nella componente glicanica

Modificazioni nella componente glicanica [1]: la deacetilazione

Osservata inizialmente in ceppi di S. pneumoniae reisistenti all’attività del lisozima: una significativa proporzione dei residui di GlcNAC risulta deacetilata

B cereus, B. anthracis, L. monocytogenes, E. faecalis, H. pylori In S. pneuomniae è stato identificato il gene responsabile di questa modifica:

pgdA (peptidoglycan deacetilase A) PgdA appartiene a una superfamiglia di proteine: le esterasi saccardidiche di

classe 4 I membri di questa famiglia presentano due caratteristiche:

1) vengono espresse come proteine con una sequenza segnale di taglio; 2) necessitano, per l’attivazione, del legame a ioni (Zn, Co, Mg)

Qual è il ruolo biologico della deacetilazione del PGN?

La presenza di amminozuccheri deacetilati nella composizione del PGN riduce drasticamente l’attività del lisozima

Lisozima: enzima con attività muramidasica ubiquitariamente presente nei liquidi corporei e nelle secrezioni, nei fagociti (granuli), cellule del Paneth

Qual è il ruolo biologico della deacetilazione del PGN?

È possibile che l’effetto della deacetilazione del PGN non sia limitato alla riduzione dell’attività enzimatica del lisozima

La deacetilazione introduce cariche positive nella parete cellulare con conseguente modulazione dei legami con altre strutture batteriche di superficie (proteine) o altri componenti batterici (capsula polisaccaridica)

Maggiore resistenza del batterio ai peptidi cationici antimicrobici (AMPs)) dell’ospite

La deacetilazione può alterare/modulare il riconoscimento di un patogeno attraverso i PRRs: L. monocytogenes, mutante pgdA risposta interferonica (IFN-b) attraverso il riconoscimento mediato da TLR2 e NOD1

Modificazioni nella componente glicanica [2]: la glicolilazione del MurNAC

Osservata inizialmente in ceppi di M. smegmatis

Rappresenta un marker di molti generi batterici appartenenti al phylum degli Actinobatteri (Gordonia, Nocardia, Rhodococcus)

L’aggiunta di un ulteriore gruppo idrossile si realizza durante il pathway biosintetico del PGN

Qual è il ruolo biologico della glicolilazione del PGN?

Il gruppo idrossilico sembra partecipare alla formazione di nuovi legami idrogeno con componenti della parete, conferendo maggiore stabilità e resistenza alla parete stessa

Mutanti di M smegmatis nel gene namH sono più suscettibile all’azione del lisozima e degli antibiotici b-lattamici

Modificazioni nella componente glicanica [3]: l’acetilazione del MurNAC

Aggiunta di un secondo gruppo idrossilico al C6 con formazione di un residuo di diacetil muramico

L’acetilazione del residuo di MurNAC è la modificazione che si presenta con maggiore frequenza nei Gram positivi e negativi

Il grado di acetilazione del residuo di MurNAC varia considerevolmente tra le specie batteriche e tra i diversi ceppi batterici (dal 20 al 70%)

Gene oatA (O-acetil transferasi) di S. aureus e adrA di S. pneumoniae

Enzimi transmembrana (11 regioni predette transmembrana) con la regione carbossi-terminale extra-citoplasmatica con attività catalitica

Modificazioni nella componente glicanica [3]: l’acetilazione del MurNAC

Qual è il ruolo biologico dell’acetilazione del PGN?

Maggiore resistenza all’azione del lisozima

Negli Staphilococchi sembra esserci una chiara correlazione tra patogenicità, resistenza all’attività muramidasica del lisozima e grado di acetilazione del MurNAC

Persistenza di frammenti di PGN con residui di MurNAC acetilati: modulazione del riconoscimento dei patogeni da parte del sistema immunitario innato

Il grado di acetilazione dei residui di MurNAC sembra essere ridotto in seguito al trattamento con antibiotici b-lattamici (Neisseria spp., S. aureus, P. mirabilis)

In N. gonorrhoeae esiste una proporzionalità diretta tra il grado di acetilazione del MurNAC e l’attività della carbossipeptidasi PBP2

Il Peptidoglicano (PGN): [5]

La componente peptidica rappresenta il punto di ancoraggio di proteine della parete cellulare al PGN: nei batteri Gram negativi, la lipoproteina di Brown

CH2 CH CH2 S Cys

O O NH

(aa)56

Lys NH2

COOH

PEPTIDOGLICANO

XXXXXXXXXXXXXX GlcNAc MurNAc XXXXXXXXXXXXXXXXXX

D-Ala

L-Ala

D-Glu

m-Dap NH2

Il Peptidoglicano (PGN): [6]

La componente peptidica rappresenta il punto di ancoraggio di proteine della parete cellulare al PGN: nei batteri Gram negativi, la lipoproteina di Brown

Il legame della BLP al PGN avviene attraverso reazioni di transpeptidazione

Nei batteri Gram positivi ancorate al PGN numerose componenti. Le reazioni di ancoraggio sono catalizzate dalla SortasiA

Metabolismo del PGN

• Gram positivi: le unità neosintetizzate vengono inserite nel versante interno, prima che la degradazione possa iniziare (INSIDE TO OUTSIDE)

• Gram negativi: tre nuovi filamenti vengono inseriti contemporaneamente alla rimozione di un filamento vecchio (THREE FOR ONE)

“Three for one”

Complesso “Yin-Yang”

Complesso multienzimatico che combina l’attività di:

-Transglicosilasi litiche (LT)

-Endopeptidasi (EP)

-Amidasi (AM)

-Transpeptidasi (TP)

-Transglicosilasi (TG)

Processo di recycling nei Gram-

• Durante la crescita batterica, circa il 40-50% del PGN viene degradata nel corso di ogni generazione

• I prodotti di turnover si accumulano nello spazio periplasmatico

• Il 90% dei prodotti di turnover viene riciclato e reincorporato nel sacculo stesso

• Il 10% del materiale degradato viene rilasciato nell’ambiente

“Three for one”

Membrana esterna

Membrana interna

UDP-NAM – pentapeptide

MurF

D-Ala – D-Ala

UDP-NAM – D-Ala – L-Glu – meso-DAP

Mplmurein peptide ligase

UDP-NAM

CITOPLASMA

L-Ala – D-Glu – meso-DAP – D-Ala

LdcAL,D-carboxypeptidase

NAG – anh-NAM – L-Ala – D-Glu – meso-DAP – D-Ala

AmpDanhMurNAc-Lala amidase

LdcAL,D-carboxypeptidase

NagZΒ-N-acetyl-

glucosamidase

PERIPLASMA

MUREINA

ANHYDROMUROPEPTIDE

TETRAPEPTIDETRIPEPTIDE

Oppoligopeptide permease

L-Ala – D-Glu-meso-DAP

L-Ala – D-Glu

meso-DAP

, AmiB, AmiC Amidase

SltY, MltA, MltB Lytic trasglycosylases

AmiA

MpaA Murein peptie amidase

MppA periplasmic murein peptide binding

AmpG muropeptide permease

Il PGN: gli enzimi del recycling