Le patologie mitocondriali

Simone VespaEdoardo VespaStefano Spagna

Dario Zuppardo

Prof. Cinzia di Pietro

Polo D 2011/2012

I mitocondri ed il mtDNA• I mitocondri sono organuli semi-

autonomi presenti in tutte le cellule animali e vegetali, aventi la ben nota funzione di “produttori di energia” da immagazzinare sottoforma di ATP.

• La peculiarità che li contraddistingue rispetto agli altri organelli cellulari è la presenza all’interno della matrice di un proprio DNA circolare (mtDNA), probabilmente residuo di un organismo procariota originariamente a sé stante.

• Questa ipotesi sostiene la teoria dell’endosimbiosi, secondo la quale un protoeucariota avrebbe inglobato al suo interno il protomitocondrio, in cambio di reciproci benefici (accumulo di energia tramite metabolismo ossidativo).

• Il genoma mitocondriale codifica per il 93% delle sue sequenze: ne risulta quindi una struttura genica compatta, policistronica e quasi totalmente priva di introni.

• Esso contiene 37 geni, 13 dei quali codificano per polipeptidi propri del mitocondrio (11 subunitàdella catena respiratoria, e 2 subunità della ATP-sintetasi), 22 per i tRNA e 2 per gli rRNA, che esprimono il genoma mitocondriale a livello dell’0rganismo umano.

• Ovviamente il genoma mitocondriale, in quanto tale, può andare incontro a mutazioni, più o meno estese, ma che (così come avviene nel genoma nucleare) sono il fattore scatenante di numerose malattie genetiche.

Le patologie

• Le malattie mitocondriali rappresentano un gruppo eterogeneo di sindromi cliniche accomunate da un deficit energetico del metabolismo mitocondriale. [Wallace, 1999]

• Nonostante il mitocondrio sia sede di varie vie metaboliche fondamentali, per malattie mitocondriali in senso stretto si intendono le sindromi associate al deficit della fosforilazione ossidativa (OXPHOS).

Le normali funzioni mitocondriali dipendono dalla relazione simbiotica di DNA nucleare (frecce blu e nere) e DNA mitocondriale (frecce rosse).L’omeostasi cellulare è sotto il doppio controllo di questi due genomi. Le patologie mitocondriali possono sorgere da disfunzioni che scaturiscono dall’uno o dall’altro genoma (testo in rosso: malattie del DNA mitocondriale; testo in blu: malattie del DNA nucleare).

• Poiché i mitocondri sono presenti in tutti i tessuti, le malattie mitocondriali possono teoricamente colpire qualsiasi organo. Più spesso, però, interessano le cellule muscolari e quelle nervose, data la maggiore richiesta di ATP di questi tessuti, specie durante lo sviluppo.

• Per la localizzazione specifica che spesso va ad assumere, le malattie mitocondriali sono spesso definite come neuro-mio-patie mitocondriali.

Caratteristiche generali

• Le malattie mitocondriali possono essere causate da mutazioni del DNA mitocondriale. Alcune di esse colpiscono un determinato organo (ad esempio la LHON, Neuropatia ottica ereditaria di Leber, che coinvolge sostanzialmente l’occhio), ma molte altre riguardano un intero sistema e spesso si presentano con associate disfunzioni neuro-miopatiche.

• Le malattie mitocondriali possono manifestarsi a qualsiasi età, con una maggiore incidenza nell’età dello sviluppo puberale, dovuta al maggior consumo energetico.

• In alcuni individui, il quadro clinico ècaratteristico di una specifica disfunzione mitocondriale e la diagnosi può essere confermata tramite il test del DNA.

• In molti individui è necessario invece ricorrere ad un approccio più complesso, che comprende:

1. l’analisi dell’albero genealogico (con particolare attenzione ai soggetti di sesso femminile, visto che il DNA mitocondriale è di esclusiva eredità materna);

2. la misurazione della concentrazione di acido lattico (che si va gradualmente ad accumulare nei tessuti, che passano alla fermentazione in quanto risulta inefficiente la riduzione dell’ossigeno);

3. la biopsia muscolare per analisi istologiche;4. l’analisi molecolare delle basi del mtDNA, qualora sia

sospettabile una mutazione a livello del genoma mitocondriale.

• (A) Eredità materna nella Leber hereditary optic neuropathy(LHON): la donna trasmette la mutazione ad ogni nascituro, mentre l’uomo non trasmette mai alcuna mutazione;

• (B) Eredità autosomica dominante nella dominant optic atrophy (DOA): uomo e donna hanno la medesima possibilitàdel 50% di trasmettere la mutazione ad ogni nascituro;

• (C) Eredità autosomica recessiva nella Friedreich ataxia(FRDA): ogni allele mutato del genitore ha un possibilità del 50% di essere trasmesso alla generazione successiva, ma la malattia si manifesta sono quando il nascituro riceve l’allele mutato da entrambi i genitori.

Concentrazione di acido lattico nel siero di

pazienti affetti da miopatie mitocondriali

Variazioni istopatologiche nelle miopatie mitocondriali

Neuropatia ottica ereditaria di Leber

• La neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON) è la più frequente delle patologie mitocondriali: comporta perdita della vista (in genere tra i 15 ed i 35 anni di età) a causa della progressiva demielinizzazione del nervo ottico, che nella gran parte dei casi va incontro a morte.

• La causa, identificata per la prima volta nel 1988 dal ricercatore statunitense Douglas Wallace, consiste in una mutazione puntiforme, a carico di una specifica coppia di basi: le mutazioni primarie più comuni sono la G11778A, la G14484A o la T3460C.

• La prima mutazione scoperta (G11778A) nonché la più frequente e pericolosa, produce la sostituzione di istidina al posto di arginina (CAC anziché CGC) in una subunità del complesso I della catena di trasportatori di elettroni (NADH deidrogenasi IV), che risentirà così di un funzionamento anomalo.

• Simile è il procedimento che segue alle altre due mutazioni(G14484A e T3460C), ma esse riguardano rispettivamente la ND6 e la ND1).

Gene Symbols

Proportion of Leber Hereditary Optic Neuropathy Attributed to Mutations in This Gene

Test MethodMutationsDetected

Test Availability

MT-ND4

~90%Targeted mutation analysis

m.11778G>A

Clinical

MT-ND6 m.14484T>C

MT-ND1 m.3460G>A

Select mitochondrial genes (ND6)

~10%Sequence analysis

Other mtDNA sequence variants

• Queste anomalie riducono la capacità dei mitocondri di compiere correttamente la fosforilazione ossidativa, e quindi di produrre ATP, anche se è stato provato che nell’eziologia della malattia sono compresi altri svariati fattori, genetici ed ambientali.

• In ogni caso, della carenza di energia risente immediatamente il nervo ottico, in quanto fortemente dipendente dal metabolismo ossidativo, producendo le manifestazioni cliniche della malattia come la rapida degenerazione del nervo e quindi la perdita della vista.

Patogenesi e sviluppo della malattia

• (A) Forma acuta: iperemia, pseudoedema, micro-teleangectasia (dilatazioni e tortuosità dei vasi papillari);

• (B) Forma cronica: a tre anni dalla comparsa, atrofia ottica, specialmente a carico del settore temporale; perdita delle fibre nervose papillari.

Epidemiologia

• L’incidenza della malattia è stata stimata, con variazioni a seconda dei luoghi, tra 1/25.000-50.000. Ricordiamo che la LHON è una malattia ad eredità materna. Tuttavia non tutti gli individui che presentano il difetto a livello del genotipo presentano anche un fenotipo patologico: solo il 10% delle femmine ed il 50% dei maschi che posseggono il gene mutato vanno incontro allo sviluppo della malattia.

• Quest’ultimo dato ci permette di introdurre la caratteristica di penetranza incompleta del gene mutato della LHON e l’evidente superiorità di frequenza nei maschi anziché nelle femmine (come abbiamo visto a causa di fattori ambientali, fisiologici e genomici particolari).

MutationsNumber of analyzed pedigrees

Median onset age

Male:female ratio

Visual recovery

G3460A 17 24,5 3,3:1 24%

G11778A 115 26 4:1 16%

T14484C 40 23 4,7:1 45%

Approcci terapeutici

• Anche se la perdita della vista è di solito il sintomo più evidente, sono state riportate associazioni della LHON con anomalie cardiache, neurologiche o scheletriche.

• Un approccio terapeutico a questa malattia prevede l’intensificazione del metabolismo ossidativo tramite la somministrazione di cofattori della via del trasporto degli elettroni, quali il succinato o il coenzima- Q, anche se, ad oggi, i risultati sono sempre stati poco influenti ai fini del decorso.

• Un’altra via risolutiva potrebbe consistere nella terapia genica, in pratica la sostituzione, nei mitocondri, del gene mutato con un gene normale.

Atassia di Friedreich(FRDA)

CARATTERI GENERALI

• Malattia genetica degenerativa, rara (1:50000), che si manifesta come atassia (perdita di coordinazione) cerebellare

• L’origine è una mutazione a carico del DNA nucleare (primo introne del gene FXN del cromosoma 9): la tripletta GAA subisce un numero eccessivo di ripetizioni

• Riduzione della sintesi di frataxina mediante il silenziamento di FXN, che codifica la proteina

• Trasmissione autosomica recessiva

FRATAXINA

• Proteina di 210 amminoacidi, ubiquitaria, principalmente localizzata nella matrice mitocondriale.

Funzioni:

• Regolazione fosforilazione ossidativa (produzione di ATP)

• Assemblamento di ISC (complesso contenente ferro-zolfo appartenente alla catena respiratoria)

• Biogenesi dell’eme (come chaperonina)

• Deposito e omeostasi del ferro

TRIPLETTA GAA

• Si ripete per slippage mispairing

• L’espansione può essere sia meiotica che mitotica, e risulta fortemente instabile; è età-dipendente; e cellularmente selettiva (principalmente neuroni gangli dorsali, ad alto dispendio energetico)

• Lunghi tratti ripetuti causano la formazione di strutture secondarie anomale (sticky DNA), che possono dar luogo a:

– Strutture auto-associanti, che rallentano meccanicamente lo scorrimento della RNA polimerasi.

– Formazione di eterocromatina, che silenzia il gene.

Formazione dell’eterocromatina dovuta a ripetizione di GAA

• Il meccanismo di regolazione (patologica) del gene èquindi epigenetico.

• La FRDA infatti viene definita come “malattia da cromatina”, poiché è la modalità di compattamento della cromatina che determina l’inibizione del gene e la disfunzione proteica.

• Perché la disfunzione genica si manifesti sul fenotipo, ènecessario che entrambi gli alleli di FXN presentino l’espansione di GAA (omozigosi).

• In FXN può verificarsi anche una eterozigosi “allele con GAA ripetuto-allele con mutazione puntiforme”

Silenziamento del gene

• La completezza dell’mRNA trascritto da FXN dipenderà dall’estensione dell’espansione eterocromatica.

• Anche la variabilità nella presentazione clinica si può spiegare col numero di nucleotidi ripetuti.

• Maggiore è il numero di ripetizioni di GAA (quindi la lunghezza del tratto eterocromatico), maggiore sarà l’inibizione della sintesi di frataxina.

Differenze tra mRNA di FXN in sani e affetti da FRDA

I principali effetti patologici del deficit di frataxina sono:

• Accumulo mitocondriale del ferro dovuto al decadimento degli ISC, che in breve tempo ad uno squilibrio delle difese antiossidanti e alla formazione di radicali liberi.

• Aumento della sensibilità a stress ossidativi.

• Mancata funzionalità della catena respiratoria e di conseguenza carenza di energia in quelle cellule che ne abbisognano maggiormente:– Cellule nervose dei gangli dorsali (cervelletto)

– Fibre di tessuto miocardico.

ASPETTO CLINICO

Sono proprio i danni da stress ossidativo a queste cellule che determinano l’aggravarsi della patologia. I primi sintomi sono:

• Progressiva perdita del coordinamento motorio e della sensibilità

• Danni neurologici come atrofia ottica e perdita d’udito (20 % dei casi),

• Diabete mellito (10 %).

• Il danno più grave riguarda le fibre miocardiche, il cui malfunzionamento porta a cardiomiopatia ipertrofica, che è la causa di morte principale per gli affetti da FRDA.

• Le principali terapie per FRDA, anche se fino adesso non hanno mostrato grande efficacia, riguardano:– Antiossidanti per combattere la formazione di

radicali liberi, contrastando la perdita di elettroni durante la respirazione cellulare.

– Chelanti del ferro per ridurre gli accumuli mitocondriali.

– Eritropoietina, che sembra agire a livello post-trascrizionale.

– Inibitori delle deacetilasi istoniche, in grado ripristinare l’espressione del gene silenziato (eterocromatico).

– Cellule staminali mesenchimali, che aumentano l’efficacia di enzimi antiossidanti (catalasi e glutatione-perossidasi), o autologhe adulte, il cui gene per la frataxina è stato modificato in vitro.

MERRFMyoclonic Epilepsy with Ragged Red Fibers

• L’epilessia mioclonica a fibre rosse sfilacciate(nota anche come sindrome di Fukuhara) è dovuta ad una mutazione del mtDna (A8344G).

CARATTERISTICHE PRINCIPALI:1.Mioclono2.Epilessia generalizzata3.Atassia4.Fibre rosse sfilacciate

MANIFESTAZIONI FREQUENTI:•Perdita dell’udito neurosensoriale•Miopatia•Neuropatia Periferica•Demenza•Bassa statura•Atrofia ottica

NOTA: <50% presenta

cardiomiopatie,retinopatie

pigmentose,oftalmoparesi e

lipomi multipli.

ANALISI CLINICAIl paziente presenta:

• Acido lattico nel sangue e nel liquido cerebrospinale.

• Aumento della proteina CSF.

• EEG mostra picchi e scariche d’onda,rilevate scariche epilettiformi focali.

• RM cerebrale mostra atrofia cerebrale e calcificazione dei gangli della base.

• La biopsia muscolare mostra le tipiche fibre rosse sfilacciate(RRF).(tricromica di Gomori).

• Analisi biochimiche di enzimi della catena respiratoria in estratti muscolari di solito mostrano una diminuita attività del complesso della catena repiratoria contenenti subunitàcodificate dal mtDna,soprattutto carenza di citocromo c ossidasi.

(A) Le fibre muscolari mostrano eteroplasmia , con lievi proliferazioni di mitocondri mutanti, che manifestano delle fibre " rosse sfilacciate “nel momento in cui sono trattate con coloranti.(B) Proliferazione contrassegnata là dove la maggior parte dei mitocondri ha il gene mutato.

Mutazioni del mtDNA

MERRF può essere causata da più di una mutazione del mtDNA,anche su diversi geni.

Gene Symbol

Test Method MutationsDetectedMutation Detection Frequency by Test Method 1

Test Availability

MT-TK Targeted mutation analysis

m.8344A>G >80%

Clinical

m.8356T>C

~10%m.8363G>A

m.8361G>A

MT-TF

Mutation scanning/sequence analysis

m.611G>A

<5% 2MT-TPm.15967G>A

mtDNA

Mutation scanning/sequence analysis

Sequence variants 90%-95% 3

Cloverleaf structures of human mitochondrial tRNALys from wild-type cells (left) and from MERRF patient-derived cells with the A8344G mutation (right). sU* indicates the modified uridine, and U on a round black background, unmodified uridine. G on a square black background represents the point mutation. The other modified nucleosides were determined previously: 1-methyladenosine (m1A), 2-methylguanosine (m2G), pseudouridine ( ) and N6-threonino carbonyladenosine (t6A) (Helm et al., 1998; Yasukawa et al., 2000a).

Ereditarietà

• La malattia si trasmette con ereditarietà materna.Il padre di un probando non è a rischio di avere la malattia.La madre invece,che possiede sicuramente la mutazione,può presentare o meno i sintomi. La diagnosi prenatale èpossibile solo se la malattia ègià stata rilevata nella madre. Tuttavia non si può prevedere il fenotipo.

Sindrome di Kears-Sayre

• La KSS è un disturbo multisistemico di origine

mitocondriale: esordisce entro i 20 anni, con oftalmoplegia

esterna progressiva e degenerazione pigmentaria della

retina, ed in aggiunta almeno uno dei seguenti danni: blocco

cardiaco completo, proteine nel CSF maggiori di 100 mg/dl e

atassia cerebellare.

• Delezioni su ampia scala del DNA mitocondriale sono spesso

evidenziate a livello dei muscoli scheletrici. Caratteristiche

supplementari associate con la KSS possono includere

miopatia, distonia, anomalie endocrine, sordità bilaterale,

demenza, cataratta e acidosi renale tubulare prossimale.

• Si tratta di una miopatia progressiva che coinvolge primariamente i muscoli

oculari estrinseci. Di solito i sollevatori delle palpebre

sono i primi ad essere colpiti, andando in ptosi, seguita da

oftalmoparesi.

• Una volta cominciata, progredisce fino a che gli

occhi si paralizzano. Il coinvolgimento simultaneo

di tutti i muscoli extraoculari fa si che gli occhi rimangano

in una posizione centrale, cosi che strabismo e diplopia

non siano comuni.

Quando il paziente tenta di sollevare le sue palpebre e di guardare verso il basso, il muscolo frontale viene contratto, corrugando la fronte. Le palpebre sono anormalmente sottili a causa dell'atrofia dei muscoli sollevatori. I muscoli orbicolari dell'occhio sono spesso coinvolti insieme a quelli extraoculari-

Diagnosi

• La diagnosi è essenzialmente clinica. I livelli ematici di lattatoe piruvato di solito sono elevati in presenza della KSS. Nel CSF, il livello di lattato è elevato, anche se i livelli del medesimo nel sangue sono nella norma. Inoltre la KSS eleva il livello delle proteine nel CSF. Anche se un test di PCR eseguito su DNA,da campioni ematici può portare alla scoperta di delezioni nell'mtDNA, il modo migliore per raggiungere la diagnosi definitiva è l'analisi di un campione bioptico muscolare.

• Si raccomanda uno screening per escludere le anomalie endocrine, che si presentano in molti pazienti. I metodi di screening possono includere test per misurare il glucosio sierico, la funzione tiroidea, calcio e magnesio.

• L'MRI del cervello ha limitato uso diagnostico infatti i rilievi dell’ MRI possono essere normali o mostrare atrofia cerebrale e cerebellare ma correlano ben poco con la KSS. Utili ad una corretta diagnosi sono l’elettrocardiogramma che rivela difetti nella conduzione cardiaca e l‘ elettroretinografia che aiuta a stimare la degenerazione retinica. Nei pazienti con KSS cambiamenti degenerativi spongiformi si hanno sia nella sostanza grigia che bianca del cervello.

• Questa mutazione di 4.9-kb incide per un terzo dei casi di KSS. Delezioni avvengono in tutti i tessuti; tuttavia al posto di esse si riscontrano talvolta duplicazioni in tandem del DNA.

• La KSS compare in seguito a specifiche delezioni nel DNA mitocondriale in

grado di indurre un particolare fenotipo

patologico, la maggior parte delle quali sono sporadiche

e si crede che accadano come mutazioni della

cellula germinale o a livello dello sviluppo embrionale.

• Le delezioni variano per dimensioni (1.3-8 kb) e

posizione all'interno del genoma mitocondriale;

comunque, il singolo sito più comune e tra le

posizioni 8469 e 13147(deletion hotspots).

Com'e possibile che un gruppo eterogeneo di delezioni mitocondriali possa condurre ad un fenotipo simile?

• Il meccanismo proposto è basato sul fatto che la trascrizione dell'mtDNA è policistronica, cioè che tutti i geni codificanti situati sul filamento H e su quello L sono trascritti come due soli grandi filamenti precursori di RNA.

• Questi poi vengono tagliati in filamenti di RNA separati, che comprendono al loro interno filamenti di RNA transfer. Così, una delezione in qualsiasi punto del genoma mitocondriale può alterare la trascrizione o la traduzione di geni che non erano stati interessati direttamente dalla mutazione.

Terapia

• Non esiste alcuna terapia in grado di modificare la storia della malattia in KSS. In futuro, un potenziale trattamento nei pazienti con KSS può tentare di inibire la replicazione dell'mtDNA mutante o stimolare la replicazione dell'mtDNA wilde-type. La prognosi per i pazienti che ne soffrono è infausta infatti la morte ècomune nella terza o quarta decade di vita