Laura Gallaugher, DVM, DACLAMClinical Laboratory Animal Veterinarian

ULARULARgallaugher.8@osu.edu

Vertebrates ScalelessAmphibios “double life”p

Aquatic larvae & terrestrial adultsClosely associated with aquatic or very moist environments 

ALAT, 30, 2009 Introduction

**Ectotherms: Cold‐bloodedBody temperature is regulated by the Body temperature is regulated by the external environment

ALAT, 30, 2009 Introduction

h l h dPhylum:  ChordataClass:  Amphibia (4300 species)Order(s):  Gymnophiona, Caudata & Anura

Developmental research **pRegenerate body parts

Ease of breeding

**g

• Large embyrosFull development visible

Near extinction in the wild

ALAT, 2009 Introduction

Tiger Salamander g(Ambystoma tigrinum)Ophthalmology Limb regeneration

Red Spotted Newt (Notophthalmus viridescens) Leg and lens Leg and lens regenerationALAT,30, 2009 Introduction

3800 Species3 pRanidae (True Frogs)Bufonidae (True Toads)Bufonidae (True Toads)Pipidae (Clawed Frogs)

Anatomy for jumpingAnatomy for jumpingNo tail (Order Anura)

**Bullfrog (Rana f g (catesbeiana)Physiology and acousticsMotion sickness in space travel

Leopard frog (Rana pipiens)H   diHormone studies

ALAT, 30, 2009 Introduction

XenopusXenopus tropicalistropicalis

XenopuspAfrican clawed frogEntirely AquaticEntirely AquaticOriginally used in pregnancy assaysp g y y

Urine → dorsal lymph sac → eggs

XenopusXenopus laevislaevispp

ALAT, 30, 2009 Introduction

**Cell and molecular biologyCell and molecular biology

Foreign DNA or mRNA is expressed in oocytes 

ALAT, 30, 2009 Introduction

Metamorphosis:  2 monthspSexual maturity:  8 monthsOptimum egg production:  2‐3 yearsp gg p 3 yBreeding females:  max. 1/month ideally 1/4months

•Mature oocytes are darkly pigmented in the animal hemisphere & light pigmented in vegetal hemisphere

Nonsurgical:  manual expressiong pSurgical:  MS‐222

Paramedian incision in lower abdominal quadrantFrogs should be rested for 1 month between surgery

Maximum of 6 surgeries

Developmental researchpDevelopmental toxicologyFETAX (Frog Embryo Teratogenesis Assay:  X )Xenopus)

Test material added to a solution containing Xenopus embryosp yEmbryos checked for developmental abnormalitiesM t litMortalityMalformationGrowth inhibition

**Mucous Glands

Slimy protective layerGranular Glands

Head & shouldersCompounds & chemicals Poison dart frog

Defense compounds (neurotoxins, hallucinogenics)

( h b h f h )Magainins (inhibit growth of pathogens)Pheromones

Skin sheddinggPermeable abdominal skin for absorption of waterwater

Skin = primary respiratory surfacep y p yPlethodontids (lungless salamanders)

Larvae use gillsgLungs:

No diaphragm (single cavity)p g g y

Lymphatic Heartsy pDorsal lymph sacs in frogs

SQ over hindendQInjected substances go directly to venous circulation

L t l li   tLateral line systemLarval & aquatic

High vs. low frequency detection

Mouthl k ll d l dXenopus lack a well developed tongue

Vocal sac in male frogsG  GI Tract

CarnivorousSh t GI t tShort GI tract

Vomiting as a defense mechanism

****Like BirdsUrine, Feces and Reproductive substancespXenopus sexing

Female Male

Salamanders & NewtsSalamanders & Newtsmostly cartilaginousLimb regenerationg

AnuransRibs absent/greatly reducedg yUrostyleTibiofibula

F > MF > MColoration Anura:Anura:

Males: Tympanum > eyeFemales:  Tympanum = eyee a es: y pa u eyeMales large colorful vocal sacsMale nuptial padsp p

Amplexus grip

****

Male Female

****

Nuptial pads, bufonid Amplexus

Simple → elaborateSimple  elaborateHula dancing, phermone trails & vocalizations

Salamanders:  Internal fertilizationFrogs:  External fertilization

Midwife toad (Alytes obsetricans)Darwin’s frogGastric brooder (Rheobatrachus)

Heart

LiverLungs

Spleen

Small IntestineP

Fat Bodies

Pancreas

Fat Bodies

Large Intestine

http://www.biokids.umich.edu/critters/2744/Caudata/specimens/

Stomach Liver

Oviduct Small Intestine

Ovary w/ Eggs

**

ALAT, 2009 Introduction

**Neotenic:  Retain Larval Neotenic:  Retain Larval Characteristics throughout life

Northern climates > Southern latitudesLarger & aquatic > smaller & terrestrialXenopus laevis has been documented to live  15 yearsAge determined by counting layers in bone

Photo of Brady Barr w/ giant salamander (National Geographic Channel)

**Moist, powder‐free gloves

Skin toxinsFine‐meshed nets, jarsNo tails!Eye protectionNever restrain larval forms or caudate w/ gills around the 

kneck

**Salamanders & frogs:g

Pectoral girdle & pelvic girdle/legs

Mycobacterium fortuitum, M. marinum, M. Mycobacterium fortuitum, M. marinum, M. xenopiSalmonellosisChlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniaeRare allergies to skin secretionsRa e a e g es to s sec et o s

**Unique markings (Photographs)

l d dToe‐clipping discouragedFreezingSki   l iSkin transplantationBeadsP i  i t t d t d  (PIT)Passive integrated transponders (PIT)

Usually from the ventral tail vein (salamanders) y ( )or abdominal vein (frogs)

26‐27ga needle, midway between pelvis & sternum

FecalImpression smears, skin scrapingAbdominocentesisRadiology

No restraint neededExtremity settingBarium sulfate

R bb   hRubber catheter10‐15ml/kg PO

SubcutaneousSkin overlying shoulder/pelvis

IntramuscularF li b  l  i  fForelimb muscles in frogsBack muscles in salamanders

IntracoelomicIntracoelomicOff midline, lower abdomen

Oral GavageOral GavageBall‐tipped needles or soft catheters

**2007 AVMA Guidelines on EuthanasiaAcceptable:

Overdose of inhalant anestheticCO  COCO2, CO

Barbiturate overdose (IC or DLS)MS‐222 overdose (3g/L)MS‐222 overdose (3g/L)Double Pithing

Pithing does not work well for Xenopus d/t g pthe difficulty in bending the head forward to expose the atlanto‐occipital space

http://www.treknature.com/gallery/photo128926.htm

**The health of the captive amphibian is p pdirectly proportional to the “health” of their environment

TerrestrialTerrestrialSemiaquaticAquaticAquatic

ALAT, 2009 Anatomy & Physiology

Impermeable, easily sanitizedp , yHeight to allow for climbing & jumpingFitted  nonabrasive lidsFitted, nonabrasive lids

Pharmacal Research

Terrestrial Species:pMoist substrate

moistened sphagnum 

Eastern mud salamander

mossheat‐treated soil w/ leaves ( H) (pH) moistened filter paper/paper towelspaper/paper towels

MistingShallow dishesShallow dishes

**Semiaquatic species:Semiaquatic species:

Sloping floor

Hiding placesBark

http://www.amphibiancare.com

BarkPVC pipesDarkly colored cagingDarkly colored caging

http://www.xenopus.com/husbandry.htm

**Chlorine

Age 24‐48hrsAerationSodium thiosulfateActivated carbon filters

ChloraminesActivated charcoal filter (unused)( )Sodium thiosulfate

CopperCopperOxygenAmmoniaAmmonia

Sodium thiosulfate + choramines = ammoniaZeoliteseo tes

Test kitspHp

6.8‐7.0

**Static

Frequent cleaningFrequent cleaningLower humidity

RecirulatingRecirulatingFilters remove debris & nitrogenous waste

Flow‐throughFlow throughDeclorination built‐in

**Pheromones!Terrestrial:  q2wksAquatic:  prevent water foulingq p g

i.e. Xenopus, cleaned after feeding (3x week)Avoid cleaning solutionsg

Dilute bleach (1:32 ratio w/ water)Rinse thoroughly

**lTNZ tropical vs. temperate

Tropical species – 21‐29 ° C (70‐85°F)T t   8 °C (6 °F)Temperate – 18‐22°C (65‐72°F)Not too hot!

Hi h h idit  8 %High humidity: 80%Lighting

f ll  l th  tfull wavelength spectrumShelterBreeders & species differencesBreeders & species differences

Generalists!Wide species varietyVariety depending of life stage

Sight feedersMoving food is preferred over stationary

TimingNocturnal

Ca/Phosphorus balance1:1 or 2:1

**Adults:  Carnivores

Vertebrate & invertebratesCrickets & mealworms

Vitamin/mineral mix dusting or “gut load” insectsVitamin/mineral mix dusting or  gut load  insectsDaily‐twice weekly

Larval salamanders:  CarnivoresLarval salamanders:  CarnivoresTadpoles:  HerbivoresLarval amphibians are feed more frequently than p q yadults

Amphibian DiseasesAmphibian Diseases

Postural changesgDecreased avoidance responsesDecreased righting reflexg gChanges in skin colorAbdominal Distentionbdo a ste t o

Physical Exam:Physical Exam:Observe animal & primary enclosureExamine skin, eyes, nares & oral cavityAbdominal palpation is difficultWeigh and assess BCS

Aeromonas hydrophiliay pTransmission: water & can be normal GI floraStress & immunosuppression predispose to colonizationpredispose to colonization

Clinical Signs:Ulceration of skin (legs & abdomen)  Ulceration of skin (legs & abdomen), lethargy

LATG 15, 2007, Frogs

Treatment: Culture & SensitivityyTetracycline (50mg/kg PO BID) Aminoglycosides (5mg/kg IM q48hr) Aminoglycosides (5mg/kg IM q48hr) Chloramphenicol (50mg/kg IM, IC q 24 hr)hr)Gentamicin (2.5‐3mg/kg IM q72hr)

Pseudocapillaroides xenopip p

Transmission: eggs are ingested w/ l h d  ki  sloughed skin Clinical Signs: rough, thickened skin w/ pittingpittingopportunistic infections

LATG 15, 2007, Frogs

Colonizes pre‐existing skin lesionsCottony Cottony 

http://clawedfrogs.tripod.com/id31.html

Intestinal impactionpIngestion of gravel/sandClinical Signs:Clinical Signs:

Lack of fecal outputBloatinggLethargy +/‐ writhingg

May require surgical intervention

http://clawedfrogs.tripod.com/id31.html

DehydrationDehydrationClinical Signs: dull, dark skin w/ dry sticky mucusTreatment:eat e t:

immersion if mild  dexamethasone & fluids if in shock

Batrachochytrium dendrobatidisP i     f  id d   l b l Primary cause of widespread, global amphibian decline

http://clawedfrogs.tripod.com/id31.html

Environmental SensitivityyDouble jeopardy

Research TractabilityResearch TractabilityLab, outdoors and mesocosms

I di  E ti tiImpending ExtinctionOver the past 30 years, Amphibian deaths 

 “ h       i i   f represent “the greatest mass extinction of land vertebrates since the dinosaurs”

Small wetland vs. larger wetlandsgSmall are critical breeding habitatsLarge are valued by the general public

E i l  iEnvironmental contaminantsFreshwater is a scarce resource

Disease and Global ChangeDisease and Global ChangeDisease outbreaks at high‐altitudesDue to atmospheric pollutants?p p

ILAR 48(3), pp. 270‐277.

Upon receipt of amphibians transfer to clean p p pcage with shipping H20House separately  do lastHouse separately, do last2‐4 week minimumT t f   it  f l & b t i l Test for: parasites, fungal & bacterial infections  

Which of the following statements is gFALSE?

A All amphibians have a cloacaA. All amphibians have a cloacaB. All adult amphibians are carnivorous.C All  hibi  h     li  l  C. All amphibians have a slime layer. D. All amphibians require some moisture in 

htheir environment.

Which drug is appropriate for euthanasia of g pp pamphibians?

A. LidocaineB. Tricaine methanesulfonate (MS‐222)C. GentimicinD. Isoflurane

What is the scientific name of the African clawed frog?

A Xenopus laevisA. Xenopus laevisB. Rana catesbeianaC X t i liC. Xenopus tropicalisD. Ambystoma tigrinum

What are two noninvasive methods for identification of amphibians?

A Photographs  toe clipping A. Photographs, toe clipping B. Toe clipping, cage cardsC T tt i     d  C. Tattooing, cage cards D. Cage cards, photographs 

Regarding their diet, larval amphibians g g , pare:

A HerbivorousA. HerbivorousB. FrugivorousC O iC. OmnivorousD. Carnivorous 

With a flow‐through water caging g g gsystem, what must be removed from the incoming water?g

A. Nitrogen B Chlorine B. Chlorine C. Sodium D. Oxygen 

In general, what is thought to be good g , g genvironmental enrichment for amphibians?p

A. Hiding places B Resting boards B. Resting boards C. Balls  

hD. Chew Toys 

What is the process of transforming p gfrom an aquatic animal with gills into a terrestrial animal with lungs called?g

A. TerreformingB Gill depletionB. Gill depletionC. Pneumotransition

hD. Metamorphosis 

What is neoteny?yA. The process of a tadpole losing its gills 

developing lungs  and moving to the land developing lungs, and moving to the land B. A deformed (mutant) salamander C Wh     l d   h   t it  C. When a salamander reaches maturity 

without undergoing metamorphosis b l dD. A newborn salamander