Large scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic

cowsPatrick H.C. van Berkel, Mick M.Welling, Marlieke Geerts, Harry A. van Veen, Bep Ravensbergen,Mourad Salaheddine, Ernest K. J. Pauwels, Frank Pieper, Jan H. Nuijens, and Peter H. Nibbering

Discentes: Bruna MarquesIsabela SeabraVictor Martins

Lactoferrina• Glicoproteína de cadeia simples.

• Pertence às transferrinas.

• Peso molecular: 77 kD.

• 703 aminoácidos.

LEITE HUMANO LEITE BOVINO

0,2 a 2,6 mg/mL 0,9 mg/mL

Lactoferrina• É constituída de dois lóbulos altamente homólogos ,

designados os lobos N e C. Cada um pode se ligar a um único íon férrico e concomitantemente com um bicarbonato .

Lactoferrina

• Diversas funções fisiológicas na proteção do trato gastrointestinal.

• Atividade antimicrobiana.

• Ação anti-inflamatória.

• Estudos recentes: combate à obesidade abdominal, contra HIV, herpes e hepatite C.

Lactoferrina comercial• Diante da importância da lactoferrina na prevenção de

doenças infecciosas em crianças aleitadas no peito, a indústria vem desenvolvendo, desde a década de 80, tecnologias para expressar essa proteína em larga escala.

Introdução• A capacidade limitada de biorreatores atuais tem levado a

indústria biofarmacêutica a investigar alternativas.

• O leite de vacas transgênicas pode fornecer um veículo atraente para a produção em grande escala e de baixo custo de biofármacos.

Introdução: produção de lactoferrina humana recombinante (rhLF)

• hLF natural de leite humano e rhLF têm propriedades de liberação/ ligação de ferro idênticos.

• Embora hLF natural e rhLF tenham sido submetidas a diferentes formas de N-glicosilação, elas foram igualmente eficazes em três diferentes modelos de infecção in vivo empregando camundongos imunocompetentes.

• Tomados em conjunto, os resultados ilustram o potencial dos bovinos transgênicos para a produção em larga escala de biofármacos.

O estudo• O estudo relata a geração de vacas transgênicas expressando

recombinante de lactoferrina humana ( rhLF ) no seu leite , e as propriedades de rhLF em comparação com a hLF natural (de leite humano).

Protocolo experimental

Proteínas• hLF natual• BSA

Lactoferrina humana. Protein Data Bank.

Indução da lactaçãoA lactação foi induzida da idade de 6-8 meses com injeções

subcutâneas de hormônios.

• Acetato de medroxiprogesterona• Benzoato de estradiol

2 dias de descanso seguido de Dexametasona para iniciar a retirada do leite duas vezes ao dia.

Após a ordenha, injeção intramuscular de espiramicina.

Comitê para avaliação ética de modificação genética de animais, instalado pelo governo alemão.

Purificação do hLF do leite bovino

• A fração contento hLF e bLF foram capturadas em S Sepharose.

• Após várias lavagens, a lactoferrina foi eluída com tampão com alta concentração de sal.

• Tween 80 e tri-N-butil fosfato inativar vírus envelopados.

• hLF foi separada da bLF por cromatografia de troca de cátions MacroPrep High S Suport (Bio-Rad, CA). Eluída com aumento da concentração de NaCl.

ELISA• Este método foi utilizado para quantificar lactoferrina

humana recombinante e natural.

• ELISA específico para bLF foi realizado de forma similar, usando anti-bLF de coelhos e anti-bLF de coelhos conjugado com peroxidase de rábano.

ELISA

SDS-PAGE• Amostras de rhLF e hLF foram digeridas com:• N-glicosidase• Endoglicosidase H

• Estes tratamentos e o controle foram fervidos por 5 minutos e analisados em SDS-PAGE 7.5%, com proteínas coradas com Comassie brilliant blue.

Ligação ao ferro• Solução de citrato de ferro foi adicionada ao rhLF e hLF.

• O aumento na absorbância a 450 nm foi medido a cada 30 s por 45 minutos, quando a saturação estava essencialmente completa (>98%).

• Para estudar a liberação do ferro dependente de pH, as preparações foram diluídas em tampões variando o pH e a A465

nm foi medida após incubados por 21h a 20°C

Composição de monossacarídeos

• As proteínas foram liofilizadas, neutralizadas, centrifugadas e o sobrenadante foi evaporado e seco.

• A amostra foi analisada por cromatografia gás-líquido, coluna CP Sil 5CB com um detector de ionização de chama.

Cromatografia gasosa

Detector de ionização de chama

Bactéria• Staphylococcus aureus super resistente

• Klebsiella pneumoniae 43816

Efeito da rhLF e hLF em infecções induzidas• Ratos machos saudáveis foram infectados com injeção

intramuscular com S. aureus.• Após 24h, 50µg de rhLF, hLF ou BSA foi injetado

intravenosamente.

• 30 minutos, 2, 16 e 48 horas após injeção de proteínas, os ratos foram sacrificados e seus músculos da coxa removidos, pesados e homogeneizados.• Em seguida, o número de UFC foi determinado.

• Outro experimento foi realizado com ratos que receberam injeção de ciclofosfamida 3 dias antes para induzir leucocitopenia

• Contágem de leucócitos do sangue.

• Injeção intramuscular de S. aureus.• 24h depois foram injetadas diversas concentrações (0-500µg

por rato) de rhLF, hLF ou BSA.• Após 24h determinaram o número de bactérias viáveis,

• No modelo K. pneumoniae, ratos foram infectados intraperitonealmente e após 24h receberam 50µg de rhLF, hLF ou BSA.

• 2 e 24h após a injeção das proteínas, os ratos foram sacrificados, sua cavidade peritoneal foi lavada e o número de bactérias viáveis foi determinado.

• Comitê de experimentação animal alemão, Universidade de Leiden.

Resultados e Discussão Recombinante hLF é expressa em altas concentrações em leite bovino

• Foram obtidas, por microinjeção, linhagens transgênicas (8778 , 8783 , 8785 , 8793 ) com o gene da rhLF, sob regulação do promotor αS1– caseína bovino.

Recombinante hLF é expressa em altas oncentrações em leite bovino

Recombinante hLF é expressa em altas concentrações em leite bovino

• Foram detectados níveis semelhantes de cerca de 0,8 , 0,4, 3,0 e 2,0 g /L de leite em 8778, 8783, 8785 e 8793, respectivamente.

• A expressão dos níveis de hLF recombinante permaneceu constante durante todo o período de lactação (280 dias).

• Parâmetros de leite (produção total de leite, contagens de células totais, proteína , gordura e lactose) ficaram dentro da normalidade e não mostraram alterações pela expressão do transgene.

Resultados e DiscussãohLF e rhLF são estrutural e funcionalmente semelhantes

• rhLF de leite bovino purificada foi submetida a análise Mono S chromatography, que discrimina hLF (humana) e lactoferrina bovina (bLF) . A preparação rhLF era essencialmente livre de bLF.

rhLF

hLF

bLF

Resultados e DiscussãohLF e rhLF são estrutural e funcionalmente semelhantes

• Ensaio imunoenzimático ( ELISA) indicou que a preparação rhLF continha menos de 0.1 % (w/w) de bLF.

• Sequenciamento mostrou que o N-terminal da proteína estava intacto e confirmou a identidade de rhLF.

Resultados e DiscussãohLF e rhLF são estrutural e funcionalmente semelhantes

• Comparação entre rhLF e hLF em SDS- PAGE mostrou que o peso molecular relativo de rhLF foi de cerca de 1-2 kDa, menor do que a hLF natural.

• Depois da desglicolisação completa com N- glicosidase F, não houve diferença de massa molecular e foi constatado que apenas rhLF foi sensível à digestão com endoglicosidase H.

CELULOSE (LIGAÇÃO β 1,4, GLICOSÍDICA)

2,8 2,8 7,3 8,1

rhLFhLF

rhLFhLF

RESULTADOS E DISCUSSÃO

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Conclusão• Foi descrita a expressão de rhLF no leite de vacas transgênicas em

concentrações de até 3 g/l. • A proteína recombinante foi semelhante à hLF natural quando

analisadas suas atividades biológicas, de ligação/liberação do ferro e atividade antibacterianas.

• A diferença na glicolisação entre rhLF e hLF aparentemente não afetou a atividade biológica das proteínas in vitro e in vivo.

Conclusão• O trabalho ilustra o potencial de bovinos transgênicos como

biorreatores.

• Com o nível de expressão observado e uma produção anual de 8.000 litros de leite por vaca, uma vaca da linhagem 8785 produz 24 kg de rhLF por ano (bruta). Portanto, algumas centenas de animais poderiam fornecer milhares de quilogramas do produto anualmente .

Conclusão• Até recentemente, a limitação do uso de bovinos transgênicos

como biorreatores era a ineficiência da microinjeção. Esta questão tem sido melhorada através da técnica de transferência nuclear (NT) como um meio para gerar vacas transgênicas. NT é muito mais eficiente do que microinjeção e permite que o sexo dos fundadores seja predeterminado.

Obrigado.