7/27/2019 Large DNA transformation.pdf

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1 9 9 0 - 1 9 9 6 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 5 , V o l . 2 3 , N o . 1 1

T r a n s f o r m a t i o n o f Escherichia c o l i w i t h l a r g e DNAm o l e c u l e s by e l e c t r o p o r a t i o nY u L i n g S h e n g , V a l e r i a M a n c i n o a n d B r u c e B i r r e n *D i v i s i o n o f B i o l o g y 1 4 7 - 7 5 , C a l i f o r n i a I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , P a s a d e n a , CA 9 1 1 2 5 , USAR e c e i v e d J a n u a r y 2 4 , 1 9 9 5 ; R e v i s e d a n d A c c e p t e d A p r i l 4 , 1 9 9 5

ABSTRACTWe h a v e e x a m i n e d b a c t e r i a l e e c t r o p o r a t i o n w i t h as p e c i f i c i n t e r e s t i n t h e t r a ns f o r ma t i o n o f l a r g e D N A , i . e .m o l e c u l e s > 1 0 0 k b . We h a v e u s e d DNA f r o m b a c t e r i a la r t i f i c i a l chromosoms ( B A C s ) r a n g i n g f r o m 7 t o 2 4 0k b , a s w e l l a s BAC l i g a t o n m i x e s c o n t a i n i n g a r a n g e o fd i f f e r e n t s i z e d m o l e c u l e s . T h e e f f i c i e n c y o f e l e c t r o -p o r a t i o n w i t h l a r g e DNA i s s t r o n g l y d e p e n d e n t o n t h es t r a i n o f E s c h e r l c h l a c o i l u s e d ; s t r a i n s w h i c h o f f e rc o m p a r a b l e e f f i c i e n c i e s f o r 7 k b m o l e c u l e s d i f f e r i nt h e i r u p t a k e o f 2 4 0 k b DNA b y a s much a s 3 0 - f o l d . E v e nw i t h a h o s t s t r a i n t h a t t r a n s f o r m s r e l a t i v e l y w e l l w i t hl a r g e D N A , t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y d r o p s d r a m a t i -c a l l y w i t h I n c r e a s i n g s i z e o f t h e D N A . M o l e c u l e s o f 2 4 0k b t r a n s f o r m - 3 0 - f o l d l e s s w e l l , o n a m o l a r b a s i s , t h a nm o l e c u l e s o f 8 0 k b . M a x i m u m t r a n s f o r m a t i o n o f l a r g eDNA o c c u r s w i t h d i f f e r e n t v o i t a g e g r a d i e n t s a n d w i t hd i f f e r e n t t i m e c o n s t a n t s t h a n a r e o p t i m a l f o r s m a l l e rD N A . T h i s p r o v i d e s t h e o p p o r t u n i t y t o i n c r e a s e t h ey i e l d o f t r a n s f o r m a n t s w h i c h h a v e t a k e n u p l a r g e DNAr e l a t i v e t o t h e n u m b e r i n c o r p o r a t i n g s m a l l e r m o l -e c u l e s . We h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t c o n d i t i o n s may b es e l e c t e d w h i c h I n c r e a s e t h e a v e r a g e s i z e o f BACc l o n e s g e n e r a t e d b y e l e c t r o p o r a t i o n a n d c o m p a r e t h eo v e r a l l e f f i c i e n c y o f e a c h o f t h e c o n d i t i o n s t e s t e d .I N T R O D U C T I O NT r a n s f o r m a t i o n o f b a c t e r i a w i t h e x o g e n o u s DNA h a s p l a y e d ac e n t r a l r o l e i n d e f i n i n g t h e m o l e c u l a r e v e n t s t h a t u n d e r l i e g e n e t i cp h e n o m e n a ( 1 ) . H i g h e f f i c i e n c y t r a n s f o r m a t i o n m a k e s t h ec r e a t i o n o f r e p r e s e n t a t i v e l i b r a r i e s f e a s i b l e w h e n l a r g e n u m b e r so f c o l o n i e s a r e n e e d e d o r w h e n t h e s o u r c e DNA i s l i m i t e d .A l t h o u g h c h e m i c a l t r e a t m e n t s o f t h e c e l l s h a v e h i s t o r i c a l l y b e e nt h e m e a n s o f p r o m o t i n g c o m p e t e n c e t o t a k e u p DNA, e l e c t r o -p o r a t i o n p r o d u c e s t h e h i g h e s t e f f i c i e n c i e s ( r e v i e w e d i n 2 ) ,m a k i n g i t t h e m e t h o d o f c h o i c e f o r c o n s t r u c t i o n o f g e n o m i cl i b r a r i e s . E l e c t r o p o r a t i o n , i n w h i c h c e l l s a n d DNA a r e s u b j e c t e dt o b r i e f h i g h v o l t a g e p u l s e s , i s t h o u g h t t o i n v o l v e t h e t r a n s i e n ta p p e a r a n c e o f p o r e s ( 3 , 4 ) , t h r o u g h w h i c h t h e DNA i s d r i v e n i n t ot h e c e l l b y t h e e l e c t r i c f i e l d ( 5 , 6 ) . Many t e c h n i q u e s f o r p r o d u c i n gt h e e l e c t r i c f i e l d h a v e b e e n a p p l i e d ( 7 - 1 1 ) . T h e m o s t commo nm e t h o d i s c a p a c i t o r d i s c h a r g e , w h i c h p r o d u c e s a f i e l d t h a t d e c a y se x p o n e n t i a l l y o v e r t i m e ( 1 2 ) .

T h e a b s o l u t e e f f i c i e n c y o f e l e c t r o p o r a t i o n , o r t h e n u m b e r o ft r a n s f o r m a n t s p e r a m o u n t o f i n p u t DNA, i s c r i t i c a l f o r l i b r a r yc o n s t r u c t i o n a n d m a n y s t u d i e s h a v e r e p o r t e d p r o c e d u r e s f o ri n c r e a s i n g t h i s e f f i c i e n c y . E f f i c i e n c y c a n b e i n f l u e n c e d b y f a c t o r ss u c h a s t e m p e r a t u r e ( 1 3 ) a n d o t h e r e l e c t r i c f i e l d p a r a m e t e r ss e l e c t e d b y t h e u s e r , i n c l u d i n g t h e v o l t a g e g r a d i e n t , r e s i s t a n c e a n dc a p a c i t a n c e ( 1 0 , 1 4 , 1 5 ) . I n a d d i t i o n , q u a l i t i e s a s s o c i a t e d w i t h t h eh o s t c e l l s , s u c h a s t h e i r g e n e t i c b a c k g r o u n d ( 2 ) , g r o w t h c o n d i -t i o n s ( 1 6 ) a n d p o s t - p u l s e t r e a t m e n t ( 1 2 ) , a s w e l l a s t h e t o p o l o g i c a lf o r m a n d t r e a t m e n t o f t h e DNA s a m p l e s ( 1 7 , 1 8 ) , w i l l a l s o a l t e rt h e n u m b e r o f t r a n s f o r m a n t s r e c o v e r e d .We a r e e n g a g e d i n t h e c o n s t r u c t i o n o f l i b r a r i e s c o n t a i n i n g l a r g eDNA f r a g m e n t s u s i n g a n F f a c t o r - b a s e d v e c t o r t o c r e a t e b a c t e r i a la r t i f i c i a l c h r o m o s o m e s ( B A C s ) ( 1 9 ) . I n t h i s w o r k , p a r t i a l l y - c u t ,s i z e - s e l e c t e d DNA o f s e v e r a l h u n d r e d k i l o b a s e p a i r s i s l i g a t e d t oa 7 k b v e c t o r a n d t h e l i g a t i o n m i x i s e l e c t r o p o r a t e d t o g e n e r a t e al i b r a r y o f c l o n e s . W h i l e a w e a l t h o f e m p i r i c a l o b s e r v a t i o n s a n d as t r o n g t h e o r e t i c a l f r a m e w o r k e x i s t s t o g u i d e t h e c l o n i n g o fs m a l l e r DNA f r a g m e n t s , t h e a p p l i c a t i o n o f t h e s e p r o c e d u r e s t ol a r g e r s i z e d DNA m o l e c u l e s i s a r e c e n t p h e n o m e n o n . C o n s e -q u e n t l y , l i t t l e d a t a e x i s t t o d i r e c t c l o n i n g o f l a r g e f r a g m e n t s i nb a c t e r i a a n d i t i s n o t c l e a r h o w w e l l we c a n p r e d i c t t h e o p t i m a lc o n d i t i o n s f o r a n y o f t h e s t e p s i n t h e p r o c e d u r e . F o r e x a m p l e , o u rl a c k o f u n d e r s t a n d i n g a b o u t t h e u p t a k e o f l a r g e DNA m o l e c u l e si n t o b a c t e r i a h a s m a d e i t d i f f i c u l t t o s e l e c t c o n d i t i o n s f o r t h ee l e c t r o p o r a t i o n o f BAC DNA. We h a v e u s e d t h e BAC s y s t e m t oi n v e s t i g a t e t h e p r o c e s s o f e l e c t r o p o r a t i o n , t o e s t a b l i s h w h i c hp a r a m e t e r s a r e s p e c i f i c a l l y i m p o r t a n t f o r t h e t r a n s f o r m a t i o n o fl a r g e DNA. BAC c l o n e s a r e w e l l s u i t e d f o r s u c h s t u d i e s , s i n c et h e y a r e a v a i l a b l e i n a v a r i e t y o f d e f i n e d l e n g t h s , w i t h e a c hc o n t a i n i n g a common s e t o f v e c t o r s e q u e n c e s . I n a d d i t i o n , t h eb l u e / w h i t e c o l o r s c r e e n p r o v i d e s a r a p i d i n d i c a t i o n o f t h e r e l a t i v et r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o f l a r g e v e r s u s s m a l l m o l e c u l e s .F i n a l l y , t h e F f a c t o r - d e r i v e d p o r t i o n o f t h e m o l e c u l e s e n s u r e s t h a tm u l t i p l e BACs w i l l n o t r e s i d e i n a s i n g l e c l o n e , s i m p l i f y i n g t h ei n t e r p r e t a t i o n o f t r a n s f o r m a t i o n s .MATERIALS AND METHODSP l a s m i d DNA p r e p a r a t i o nBAC m i n i - p r e p s f r o m o v e r n i g h t c u l t u r e s w e r e p e r f o r m e d e i t h e r i nt h e A u t o g e n 7 4 0 a u t o m a t e d m i n i - p r e p s y s t e m ( I n t e g r a t e d S e p a r -a t i o n S y s t e m s , N a t i c k , M A) u s i n g 3 m l c u l t u r e s o r b y h a n d u s i n g1 . 5 m l c u l t u r e s . T h e m a n u a l p r e p a r a t i o n s w e r e a c c o m p l i s h e d u s i n g

* T o whom c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d a t p r e s e n t a d d r e s s : W h i t e h e a d I n s t i t u t e / M I T C e n t e r f o r G e n o m e R e s e a r c h , 1 K e n d a l l S q u a r e , B u i l d i n g 3 0 0 ,C a m b r i d g e , MA 0 2 1 3 9 , USA

( D 1 9 9 5 O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 5 , V o l . 2 3 , N o . 1 1 1 9 9 1a n a l k a l i n e l y s i s p r o c e d u r e ( 2 0 ) w i t h s o l u t i o n s 1 , I a n d H I p r e p a r e da c c o r d i n g t o S a m b r o o k e t a l . ( 2 1 ) . C e l l p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e di n 1 0 0 p 1 c h i l l e d s o l u t i o n I a n d p l a c e d o n i c e . T o t h i s w a s a d d e d 2 0 0p 1 f r e s h l y p r e p a r e d s o l u t i o n I I , t h e t u b e s w e r e i n v e r t e d 7 - 9 t i m e st o m i x a n d r e p l a c e d o n i c e . A f t e r a d d i n g 1 5 0 p 1 s o l u t i o n H I , t h et u b e s w e r e a g a i n i n v e r t e d 7 - 9 t i m e s a n d i m m e d i a t e l y s p u n f o r 6m i n a t f u l l s p e e d i n t h e m i c r o f u g e a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h es u p e m a t a n t w a s p o u r e d i n t o a n e w t u b e a n d t h e n u c l e i c a c i dp r e c i p i t a t e d b y a d d i t i o n o f 1 m l r o o m t e m p e r a t u r e e t h a n o l . A f t e rm i x i n g b y i n v e r s i o n , s a m p l e s w e r e i m m e d i a t e l y s p u n f o r 6 m i n a tf u l l s p e e d i n t h e m i c r o f u g e a t r o o m t e m p e r a t u r e . P r e c i p i t a t e d DNAp e l l e t s w e r e w a s h e d w i t h 1 m l 70% e t h a n o l , a i r d r i e d a n dr e s u s p e n d e d i n 2 0 p i TE ( 1 0 m M T r i s , 1 mME D T A , pH 8 . 0 ) . DNAp e l l e t s f r o m t h e A u t o g e n p r e p s w e r e r e s u s p e n d e d i n 5 0 p 1 . F o rq u a n t i t a t i o n o f BAC D N A , 2 , l m i n i - p r e p p e d DNA w a s d i g e s t e dw i t h N o t I ( w h i c h e x c i s e s t h e i n s e r t f r o m t h e v e c t o r ) a n d r u n o n am i n i g e l o f 0 . 7 % a g a r o s e , a l o n g w i t h s e r i a l d i l u t i o n s o f f u l l - l e n g t h ,l i n e a r X DNA a n d Hindm d i g e s t s o f X DNA. G e l s w e r e s t a i n e d i n1 j i g / m l e t h i d i u m b r o m i d e f o r 2 0 m i n . A f t e r p h o t o g r a p h y , t h ei n t e n s i t i e s o f t h e BAC s a m p l e s w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e o f t h es t a n d a r d s . S a m p l e DNA w a s a l w a y s b r a c k e t e d b y a r a n g e o f b o t hh i g h e r a n d l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s t a n d a r d s a n d p h o t o g r a p h i ce x p o s u r e t i m e s w e r e s e l e c t e d t o a v o i d s a t u r a t i o n . F o r e l e c t r o p o r a -t i o n , s a m p l e s w e r e d i l u t e d i n w a t e r a n d s t o r e d a t 4 C .P r e p a r a t i o n o f c o m p e t e n t c e l l sC o m p e t e n t c e l l s w e r e p r e p a r e d b y t h e p r o c e d u r e s u p p l i e d w i t h t h ee l e c t r o p o r a t i o n d e v i c e ( L i f e T e c h n o l o g i e s , G a i t h e r s b u r g , M D ) , w i t hm i n o r m o d i f i c a t i o n s t o t h e p r o t o c o l . A f r e s h o v e r n i g h t c u l t u r e w a sd i l u t e d - 1 : 1 0 0 0 f o r g r o w t h i n SOB ( w i t h o u t M g 2 + ) ( 2 1 ) . C e l l s w e r eg r o w n a t 3 7 C w i t h s h a k i n g a t 2 0 0 r . p . m . t o a n O D 5 5 0 o f 0 . 7 ( n e v e rh i g h e r t h a n 0 . 8 , e x c e p t w h e r e n o t e d ) . C e l l s w e r e h a r v e s t e d b ys p i n n i n g i n a GSA r o t o r f o r 1 0 m i n a t 5 0 0 0 r . p . m . a n d r e s u s p e n d e di n a v o l u m e o f c o l d 1 0 % s t e r i l e g l y c e r o l e q u a l t o t h e o r i g i n a l c u l t u r ev o l u m e . C e l l s w e r e c o l l e c t e d b y s p i n n i n g f o r 1 0 m i n a t 5 0 0 0 r . p . m .a t 4 C . T h i s w a s h i n g a n d s p i n n i n g p r o c e d u r e w a s t h e n r e p e a t e d ,a g a i n u s i n g a v o l u m e o f 1 0 % g l y c e r o l e q u a l t o t h e o r i g i n a l c u l t u r ev o l u m e . A f t e r d e c a n t i n g t h e s u p e m a t a n t , c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i nt h e v o l u m e o f g l y c e r o l r e m a i n i n g i n t h e c e n t r i f i u g e b o t t l e s (40 m l )a n d s p u n f o r 1 0 m i n a t 7 0 0 0 r . p . m . i n a n S S 3 4 r o t o r . A f t e r d e c a n t i n gt h e s u p e m a t a n t , c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 % g l y c e r o l , u s i n g av o l u m e o f b e t w e e n 2 a n d 2 . 2 5 m / l l i n i t i a l c u l t u r e . C e l l s w e r ea l i q u o t e d t o m i c r o f u g e t u b e s ( 1 0 0 - 2 0 0 p 1 / t u b e ) a n d f r o z e n q u i c k l yi n a d r y i c e - e t h a n o l b a t h . C e l l s w e r e s t o r e d u n t i l u s e a t - 7 0 0 C .E l e c t r o c o m p e t e n t c e l l s w e r e p u r c h a s e d i n t h e c a s e o f DHSa ( L i f eT e c h n o l o g i e s , G a i t h e r s b u r g , M D) a n d J S 4 ( B i o R a d L a b o r a t o r i e s ,R i c h m o n d , C A ) .E l e c t r o p o r a t i o nE l e c t r o p o r a t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g e i t h e r a B i o R a d G e n eP u l s e r o r G e n e P u l s e r I I . C u v e t t e s w i t h a 0 . 1 c m g a p ( B i o R a dL a b o r a t o r i e s ) w e r e p l a c e d o n i c e t o c h i l l . E l e c t r o c o m p e t e n t c e l l sw e r e t h a w e d a n d 3 0 p l a d d e d t o m i c r o f u g e t u b e s p l a c e d o n i c e .Two p l DNA w a s a d d e d a n d , a f t e r m i x i n g , t h e DNA a n d c e l l sw e r e t r a n s f e r r e d t o t h e c u v e t t e . E l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n s w e r eo 0 0 Q n 1 . 8 kV a n d 2 5 R F , e x c e p t w h e r e o t h e r w i s e n o t e d .E l e c t r o p o r a t i o n s w e r e p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e . A f t e r e l e c t r o p o r a -t i o n , 0 . 5 m l SOC w a s i m m e d i a t e l y a d d e d t o t h e c u v e t t e a n d t h ec o n t e n t s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o s t e r i l e g l a s s c u l t u r e t u b e s f o r 4 5

2 5 a n d 2 5 0 p l o f c e l l s , e a c h i n d u p l i c a t e , were s p r e a d o n L B p l a t e sc o n t a i n i n g 1 2 . 5 g g / m l c h l o r a m p h e n i c o l . F o r t r a n s f o r m a t i o n s o fl i g a t i o n s w i t h t h e BeloBAC v e c t o r , p l a t e s c o n t a i n e d 5 0 j g / m lX - g a l a n d 2 5 j g / m l I P T G . A t l e a s t 2 4 h g r o w t h a t 3 7 C werep e r m i t t e d p r i o r t o s c o r i n g c o l o n i e s a r i s i n g f r o m l i g a t i o n s t op e r m i t t h e b l u e c o l o r t o d e v e l o p s u f f i c i e n t l y .L i g a t i o n s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t DNAL i g a t i o n s o f s i z e - s e l e c t e d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t m o u s e DNA t ot h e H i n d I - c u t a n d d e p h o s p h o r y l a t e d p B e l o B A C v e c t o r ( S h i z u y ae t a l . , m a n u s c r i p t i n p r e p a r a t i o n ) were c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d b yS h i z u y a ( 1 9 ) . T h e 7 . 3 k b BeloBAC v e c t o r i s d e r i v e d f r o mpBAC108L ( 1 9 ) b y i n c o r p o r a t i o n o f a b l u e / w h i t e c o l o r s c r e e n t oi n d i c a t e t h e presence o f i n s e r t e d DNA. T y p i c a l l y , l i g a t i o n s werec a r r i e d o u t i n v o l u m e s o f 9 0 p1 a n d c o n t a i n e d 1 6 - 2 0 n g v e c t o r a n dm a i n t a i n e d a m o l a r r a t i o o f v e c t o r t o i n s e r t DNA o f 1 0 : 1 . P r i o r t oe l e c t r o p o r a t i o n , l i g a t i o n m i x e s were d i a l y z e d f o r > 2 h a g a i n s t 0 . 5x T E , c o n t a i n i n g 1 x p o l y a m i n e s ( 1 x p o l y a m i n e s i s a m i xt u r e o fs p e r m i n e a t 0 . 7 5 mM a n d s p e r m i d i n e a t 0 . 2 5 m M ) .A n a l y s i s o f c l o n e s i z e sM i n i - p r e p p e d DNA ( 5 j l ) w a s d i g e s t e d i n a v o l u m e o f 2 0 j i l f o r1 - 2 h u s i n g 3 U N o t I ( N e w E n g l a n d B i o L a b s , B e v e r l y , M A ) .S a m p l e s we r e ru n f o r 1 8 h i n 1 % agarose g e l s ( S e a K e m L E ; FMCB i o P r o d u c t s , R o c k l a n d , M E ) i n a CHEF M a p p e r or CHEF D R I l lp u l s e d f i e l d g e l b o x ( B i o R a d L a b o r a t o r i e s ) i n 0 . 5 x TBE ( 2 1 ) a t1 4 W C w i t h a v o l t a g e g r a d i e n t o f 6 V / c m a n d t h e s w i t c h i n t e r v a lr a m p e d f r o m 5 t o 1 5 s . S i z e s we r e d e t e n r n i n e d b y c o m p a r i s o n w i t ht h e L o w r a n g e , M i d r a n g e I , M i d r a n g e Hn d Xl a d d e r s i z e m a r k e r so f New E n g l a n d B i o L a b s .RESULTST r a n s f o r m a t i o n o f d i f f e r e n t b a c t e r i a l s t r a i n s w i t h l a r g e DNAB a c t e r i a l c e l l s w h i c h ar e d e f i c i e n t i n a n u m b e r o f r e c o m bi n a t i o nf u n c t i o n s i n c r e a s e t h e s t a b i l i t y o f c l o n e d DNA w h i c h c o n t a i n sr e p e a t e d sequences. T h e s e s t r a i n s e x h i b i t a w i d e ran ge i n t h e i ra b i l i t y t o t a k e u p s m a l l DNA b y e l e c t r o p o r a t i o n ( 2 ) . T o t e s t t h ee f f i c i e n c y o f d i f f e r e n t E . c o l i s t r a i n t r a n s f o r m a t i o n s w i t h l a r g eDNA m o l e c u l e s weu s e d BAC DNA f r o m c l o n e s o f k n o w n s i z e s .T a b l e 1 p r e s e n t s a c o m p a r i s o n o f t r a n s f o n n a t i o n s o f DH1OB,D H 5 a , X L - 1 B l u e MR, J S 4 a n d H B 1 0 1 p e r f o r m e d w i t h 7 . 3 a n d2 4 0 k b m o l e c u l e s a n d d e m o n s t r a t e s t h a t t h e a b i l i t y t o t a k e u pl a r g e DNA i s i n d e p e n d e n t o f t h e u p t a k e o f s m a l l e r m o l e c u l e s .R e s t r i c t i o n a n a l y s i s a n d p u l s e d f i e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s con-f i r m e d t h a t t h e s i z e o f t h e BACs i n t h e t r a n s f o r m a n t s corre-s p o n d e d t o t h e s i z e o f t h e i n t a c t B AC DNA u s e d f o r t h et r a n s f o r m a t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) . D H 1 O B , DHSa, X L - 1 B l u e MRa n d J S 4 e x h i b i t s i m i l a r t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c i e s w i t h t h e 7 . 3 k bp l a s m i d , w h i l e H B 1 I 1 t r a n s f o r m s a b o u t 5 - f o l d l e s s w e l l t h a nt h e s e o t h e r s t r a i n s w i t h 7 . 3 k b DNA. I n c o n t r a s t , u p t a k e o f t h e 2 4 0k b BAC DNA s h o w s much g r e a t e r v a r i a b i l i t y among t h e s e s a m ef i v e s t r a i n s . F o r e x a m p l e , c o m p a r e d w i t h D H 1 O B , w h i c h i s t h emost e f f i c i e n t l y t r an s f o r m e d o f a n y o f t h e s e s t r a i n s w i t h t h e l a r g eDNA, t h e o t h e r s t r a i n s s h o w e f f i c i e n c i e s w h i c h vary > 2 0 0 - f o l d .T h e s t r a i n s DHSa, X L - 1 B l u e MR a n d J S 4 , w h i c h we r ec o m p a r a b l e w i t h DH1OB i n t r a n s f o r m a t i o n w i t h t h e 7 . 3 k b DNA,s h o w a 3 . 8 - , a 2 9 - a n d a 2 4 - f o l d r e d u c t i o n , r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dw i t h DH1OB i n t r a n s f o r m a t i o n w i t h t h e l a r g e r DNA. Among a l lm i n g r o w t h w i t h s h a k i n g a t 3 7 C . F o r e a c h e l e c t r o p o r a t i o n , 2 . 5 , t h e E c o l i s t r a i n s t e s t e d , t h e s t r a i n b e s t t r a n s f o r m e d b y l a r g e DNA

7/27/2019 Large DNA transformation.pdf

3/7

1 9 9 2 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 5 , V o l . 2 3 , N o . 1 1i s DH1OB ( d a t a on a d d i t i o n a l s t r a i n s n o t s h o w n ) . T h e a b i l i t y o fDH1OB t o t a k e up 6 0 k b DNA h a s b e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 ) .T a b l e 1 . T r a ns f o r ma t i o n o f d i f f e r e n t E . c o l i s t r a i n s w i t h s m a l l a n d l a r g e DNAm o l e c u l e s a

DHIOB H B 1 O I DH5a X L - 1 B l u e MR J S 47 . 3 k b DNA 1 7 4 0 3 3 0 1 3 9 0 1 3 7 0 1 3 5 02 4 0 k b DN A 1 2 2 0 6 3 0 2 4 2 5 0

a T h e n u m b e r o f c o l o n i e s o b t a i n e d o n t r a n s f o n n a t i o n o f d i f f e r e n t b a c t e r i a l s t r a i n sw i t h t w o d i f f e r e n t s i z e d DNA s a m p l e s i s s h o w n ( c o l o n y n u m b e r s r e f l e c t t h e a v e r -a g e s f r o m d u p l i c a t e p l a t i n g s ) . DNA c o n c e n t r a t i o n s w e r e n o t d e t e r m i n e d a n d t h u so n l y t h e r e l a t i v e n u m b e r o f t r a n s f o r m a n t s o b t a i n e d f r o m a s i n g l e DNA s a m p l e m a yb e c o m p a r e d . E l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n s w e r e 2 5 p f , 2 0 0 S " 1 3 k V c m . T r a n s f o r m -a t i o n s w e r e p e r f o r m e d w i t h a r a n g e o f d i f f e r e n t a m o u n t s o f DNA t o e n s u r e t h a t t h en u m b e r o f t r a n s f o n r a n t s o b t a i n e d w a s a l i n e a r f u n c t i o n o f i n p u t D N A .

T a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y a n d i n c r e a s i n g DNA s i z eT o q u a n t i t a t e t h e r e l a t i v e e f f i c i e n c y o f t r a n s f o n a t i o n o f DH1OBw i t h v a r i o u s s i z e d m o l e c u l e s we c a r r i e d o u t t r a n s f o n n a t i o n s w i t hd i f f e r e n t BACs o f k n o w n s i z e s . T h e e f f i c i e n c y o f t r a n s f o r m a t i o nw i t h t h e 7 . 3 k b BAC v e c t o r a n d BACs ( c o n t a i n i n g h u m a ns e q u e n c e s ) o f 8 0 , 1 5 0 a n d 2 4 0 k b i s s h o w n i n T a b l e 2 . T h e 1 0 - f o l dd e c r e a s e i n e f f i c i e n c y , o n a m a s s b a s i s , o b s e r v e d f o r t h e m o l e c u l e so f 7 . 3 a n d 8 0 k b i n d i c a t e s i a t t h e s e t w o d i f f e r e n t s i z e d m o l e c u l e st r a n s f o r m , o n a m o l a r b a s i s , w i t h n e a r l y i d e n t i c a l e f f i c i e n c y .H o w e v e r , w h e n t h e s i z e o f t h e DNA i s a l m o s t d o u b l e d f r o m 8 0 t o1 5 0 k b , t h e e f f i c i e n c y i s r e d u c e d > 6 - f o l d . A f u r t r i n c r e a s e i n s i z eo f t h e DNA b y a f a c t o r o f 1 . 6 ( f r o m 1 5 0 t o 2 4 0 k b ) a g a i n l o w e r s t h ee f f i c i e n c y b y > 1 0 - f o l d . T h u s t h e r e i s a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i nt r a n s f o r n a t i o n e f f i c i e n c y w i t h i n c r e a s e s i n s i z e , d r o p p i n g f r o m- 1 0 9 c o l o n i e s / p g f o r t h e 7 . 3 k b m o l e c u l e s , t o j u s t 1 0 6 c o l o n i e s / p gf o r 2 4 0 k b DNA. T o c o n f i n n t h e r e l a t i v e t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c i e sr e p o r t e d i n T a b l e 2 we c a r i e d o u t m i x i n g e x p e r i m e n t s i n w h i c hBAC DNAs o f t h e s e f o u r d i f f e r e n t s i z e s w e r e c o m b i n e d i n v a r i o u sp r o p o r t o n s p r i o r t o u s e f o r t r a n s f o r m a t i o n . A f t e r t r a n s f o r m a t i o n , t h es i z e s o f BACs i n i n d i v i d u a l c o l o n i e s w e r e a n a l y z e d t o e s t a b l i s h t h ef r e q u e n c y o f t r a n s f o r m a t o n w i t h e a c h o f t h e d i f f e r e n t s i z e c l a s s e so f D N A . T h e f i e q u e n c y o f t a a n s f o r n a t i o n f o r a n y i n d i v i d u a l BACw h e n m i x e d w i t h BACs o f d i f f e r e n t s i z e s r e f l e c t e d t h e t r a n s f o r n -a t i o n e f f i c i e n c i e s s h o w n i n T a b l e 2 ( d a t a n o t s h o w n ) . T h u s t h e s i z ed e p e n d e n c e o f b a c t e r i a l t r a n s f o r m a t i o n s h o w n i n T a b l e 2 r e s u l t s i na n e x t r e m e l y s t r o n g b i a s w h i c h f a v o r s r e c o v e r y o f s m a l l e r c l o n e sw h e n t r a n s f o a t i o n i s p e r f o r n e d u s i n g m i x t u r e s o f d i f f e r e n t s i z e dD N A s .T a b l e 2 . E f f i c i e n c y o f e l e c t r o p o r a t i o n f o r B AC DNA o f d i f f e r e n t s i z e s aS i z e ( k b ) E f f i c i e n c y

7 . 3 2 . 3 x 1 0 98 0 1 . 9 x 1 0 8

1 5 0 3 . 2 x 1 0 72 4 0 1 . 2 x 1 0 6

a E f f i c i e n c i e s ( c o l o n i e s / j g ) were c a l c u l a t e d f r o m d u p l i c a t e p l a t i n g s . E l e c t r o -p o r a t i o n c o n d i t i o n s we re 2 5 IF , 2 0 0 a 1 7 k V / c m . T r a n s f o r m a t i o n s were p e r -f o r m e d w i t h a range o f d i f f e r e n t amounts o f DNA t o ensure t h a t t h e number o ft r a n s f o r m a n t s o b t a i n e d w a s a l i n e a r f u n c t i o n o f i n p u t DNA.

E l e c t r i c f i e l d s t r e n g t h e f f e c t s on l a r g e DNA t r a n s f o r m a t i o nA b i a s i n t h e t r a n s f o n n a t i o n a g a i n s t l a r g e DNA m o l e c u l e s w o u l do b v i o u s l y h a v e u n d e s i r a b l e consequences f o r g e n e r a t i n g BACl i b r a r i e s f r o m a l i g a t i o n m i x c o n t a i n i n g a h e t e r o g e n e o u s p o p l a t i o no f D N A s . We t h e r e f o r e e x a m i n e d s o m e o f t h e e l e c t r o p o r a t i o np a r a m e t e r s t o d e t e r m i n e i f c o n d i t i o n s e x i s t e d w h i c h w o u l d improvet r a n s f o r m a t i o n b y l a r g e DNA. T r a n s f o r m a t i o n s were p e r f o r m e dw i t h d i f f e r e n t s i z e d BACs u s i n g a v a r i e t y o f e l e c t r i c f i e l d s t r e n g t h s .T h e e f f i c i e n c i e s r e s u l t i n g f i o m t r a n s f o r m a t i o n w i t h BACs a t f i e l ds t r e n g t h s r a n g i n g f i r o m 5 t o 2 5 kVcm a r e s h o w n i n T a b l e 3 .T r a n s f o r m a t i o n o f E . c o l i w i t h s m a l l p l a s m i d s h a s b e e n s h o w n t o b eo p t i m a l a t f i e l d s t r e n g t h s o f - 1 6 - 1 8 k V / c m ( 1 2 ) . We s e e t h em a x i m u m e f f i c i e n c y f o r t h e 7 . 3 k b m o l e c u l e o c c u r r i n g a t 1 7 ky/cm.A t 1 7 kV/cm, 1 . 4 - f o l d a n d n e a r l y 2 - f o l d m o r e c o l o n i e s a r e o b t a i n e dt h a n a t e i t h e r 1 3 k V / c m o r 2 1 k V / c m r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , a l l t h el a r g e r m o l e c u l e s t e s t e d , t h e 8 0 , 150 a n d 2 4 0 k b B A C s , s h o wmaximum t r a n s f o r m a t i o n a t a l o w e r f i e l d s t r e n g t h , n a m e l y1 3 k V / c m . T r a n s f o r m a t i o n o f t h e 1 5 0 a n d 2 4 0 k b m o l e c u l e s w a sthree t i m e s m o r e e f f e c t i v e a t 1 3 k V / c m t h a n a t 1 7 kWcm, w h i l e t h e8 0 k b DNA w a s 2 . 3 - f o l d m o r e e f f e c t i v e a t 1 3 ky/cm.T h e r e s u l t s o f t h e t r a n s f o r m a t i o n s a t e a c h f i e l d s t r e n g t h s h o w ni n T a b l e 3 a r e p l o t t e d a s a p e r c e n t o f t h e maximum e f f i c i e n c yo b t a i n e d f o r e a c h s i z e o f DNA i n F i g u r e 1 . C o m p a r e d w i t ht r a n s f o r m a t i o n o f t h e 7 . 3 k b DNA, a l l p o i n t s o n t h e s e curves f o r t h e8 0 , 150 a n d 2 4 0 k b DNA a r e s h i f t e d t o w a r d l o w e r v o l t a g e s . A t 1 8kV/cm, w h i c h p r o d u c e s t h e peak e f f i c i e n c y f o r t r a n s f o r m a t i o n o fs m a l l DNA, t h e l a r g e DNAs a r e t r a n s f o r m e d a t o n l y -30% o f t h e i rm a x i m u m . T h e i m p o r t a n t i m p l i c a t i o n f o r BAC c l o n i n g f r o m T a b l e3 a n d F i g u r e 1 i s t h a t l o w e r f i e l d s t r e n g t h s o f f e r n o t o n l y t h e h i g h e s ta b s o l u t e e f f i c i e n c y f o r t r a n s f o r m a t i o n o f l a r g e DNA, b u t a l s oi n c r e a s e t h e e f f i c i e n c y o f l a r g e DNA t r a n s f o r m a t i o n r e l a t i v e t os m a l l e r DNA. N o t e t h a t a t 9 k V / c m t h e 2 4 0 k b DNA t r a n s f o r e da t 73% o f i t s maximum l e v e l , b u t t r a n s f o r m a t i o n w i t h t h e 7 . 3 k bDNA p r o d u c e d o n l y 7 % o f i t s m a x i m u m . T h u s f o r B AC c l o n i n g ,w h e r e t h e r e l a t i v e t r a n s f o n n a t i o n e f f i c i e n c y o f l a r g e a n d s m a l lm o l e c u l e s d e t e r m i n e s t h e c o m p o s i t i o n o f t h e l i b r a r y , c o n d i t i o n s o fl o w f i e l d s t r e n g t h may p rove u s e f u l .T a b l e 3 . T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o f d i f f e r e n t s i z e d DNA b y e l e c t r o p o r a t i o na t d i f f e r e n t v o l t a g e s a

V o l t a g e g r a d i e n t E f f i c i e n c y( k V / c m ) 7 . 3 k b 8 0 k b 1 5 0 k b 2 4 0 k b2 1 1 . 2 x 1 0 9 3 . 2 x 1 0 7 2 . 1 x 1 0 6 2 . 0 x 1 0 51 7 2 . 3 x 1 0 9 l . 9 x 1 0 8 3 . 2 x 1 0 7 1 . 2 x 1 0 61 3 1 . 6 x 1 0 9 4 . 4 x 1 0 8 1 . 0 x 1 0 8 3 . 7 x 1 0 69 1 . 6 x 1 0 8 l . 5 x 1 0 8 3 . 6 x 1 0 7 2 . 7 x 1 0 65 < 1 0 6 8 . 4 x 1 0 5 7 . 0 x 1 0 5 5 . 0 x 1 0 4

a E f f i c i e n c i e s ( c o l o n i e s / j g ) w e r e c a l c u l a t e d f r o m d u p l i c a t e p l a t i n g s o f d i f f e r e n ta m o u n t s o f t r a n s f o r m e d c e l l s . E l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n s w e r e 2 5 g i F , 2 0 0 Q 4w i t h t h e i n d i c a t e d v o l t a g e g r a d i e n t s .T r n s f o r m a t i o n o f l a r g e DNA u s i n g d i f f e r e n t r e s i s t a n c e sN e x t we e x a m i n e d w h e t h e r r e s i s t a n c e s w h i c h r e s u l t i n o p t i m a le l e c t r o p o r a t i o n w o u l d d i f f e r f o r l a r g e a n d s m a l l DNA w h e n u s i n gc a p a c i t o r d i s c h a r g e . C h a n g e s i n r e s i s t a n c e a l t e r t h e l e n g t h o f t i m eo v e r w h i c h t h e e l e c t r i c p u l s e i s d e l i v e r e d . T h i s t i m e p e r i o d , r e f e r r e dt o a s t h e t i m e c o n s t a n t ( t ) , i s a f u n c t i o n o f t h e r e s i s t a n c e a n dc a p a c i t a n c e s e l e c t e d [ t ( s ) = R ( o h m s ) x C ( f a r a d s ) ] . T h e r e s u l t s o f

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 5 , V o l . 2 3 , N o . 1 1 1 9 9 3T r a n s f o r m a t i o n w i t h BAC l i g a t i o n m i x e s u s i n gd i f f e r e n t e l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n s

75 -i.5025-

0n.6i 0 4V o l t a g e G r a d i e n t ( k Y / c m )

F i g u r e 1 . T r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y a s a f u n c t i o n o f v o l t a g e g r a d i e n t f o r DNAo f d i f f e r e n t s i z e s . D a t a f r o m T a b l e 1 i s p i o t t e d a s t h e p e r c e n t o f t h e maximume f f i c i e n c y a t t a i n e d f o r e a c h o f t h e d i f f e r e n t s i z e d m o l e c u l e s u s e d : 7 . 3 ( + ) , 8 0( 0 ) , 1 5 0 ( 0 ) a n d 2 4 0 k b ( A ) .

t r a n s f o r m a t i o n s w i t h t h e 7 . 3 a n d 2 4 0 k b BAC c l o n e s c a r n i e d o u t a t1 0 0 , 2 0 0 a n d 4 0 0 Q u s i n g v o l t a g e g r a d i e n t s o f 1 3 kVcm a r e s h o w ni n T a b l e 4 . T h e s e two d i f f e r e n t s i z e d DNAs s h o w p e a k t r a n s f o r m -a t i o n e f f i c i e n c i e s a t d i f f e r e n t r e s i s t a n c e s ; t h e s m a l l e r DNAt r a n s f o r m s b e s t u s i n g 2 0 0 Q h i l e t h e l a r g e DNA t r a n s f o r m s b e s ta t 1 0 0 n S p e c i f i c a l l y , a t a v o l t a g e g r a d i e n t o f 1 3 kVcm, t h et r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o f t h e 2 4 0 k b DNA a t 1 0 0Qt = 2 . 4 m s )i s - 3 - a n d 7 - f o l d h i g h e r r e s p e c t i v e l y t h a n t h a t o b t a i n e d a t 2 0 0 ( t =4 . 6 m s ) or 4 0 0 Q ( t = 8 . 8 m s ) . I n c o n t r a s t , t h e 7 k b DNA a t 2 0 0 Qgave r i s e t o n e a r l y 3 - f o l d m o r e c o l o n i e s t h a n a t 1 0 0 Q , a n d 2 - f o l dm o r e c o l o n i e s t h a n t r a n s f o r m a t i o n a t 4 0 0 Q T r a n s f o r m a t i o n sp e r f o r m e d u s i n g 5 0 Q p r o d u c e d l o w e r e f f i c i e n c i e s f o r e a c h o f t h e s eDNAs ( d a t a n o t s h o w n ) . When a h i g h e r v o l t a g e g r a d i e n t o f 1 8kVcm w a s u s e d , t h e two d i f f e r e n t s i z e d DNAs a l s o e x h i b i t e dm a x i m u m t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y a t t h e d i f f e r e n t r e s i s t a n c e s ,t h o u g h a s e x p e c t e d , t h e a b s o l u t e n u m b e r o f c o l o n i e s o b t a i n e d w i t ht h e 2 4 0 k b DNA w a s l o w e r ( d a t a n o t s h o w n ) .T a b l e 4 . E l e c t r o p o r a t i o n o f s m a l l a n d l a r g e DNA u s i n g d i f f e r e n t r e s i s t a n c e s a

S i z e ( k b ) l O O Q 2 0 0 Q l 4 0 0 Q7 . 3 1 7 3 5 0 8 2 6 72 4 0 9 4 5 3 1 8 1 2 7

a C o l o n y n u m b e r s s h o w n ar e t h e average o f two s e p a r a t e e l e c t r o p o r a t i o n s . DNA( 2 g l ) w a s e l e c t r o p o r a t e d w i t h 2 5 g t l c e l l s u s i n g s e t t i n g s o f 2 5 m F a n d 1 3 k V / c m .T i m e c o n s t a n t s ( t ) o b t a i n e d were: 1 0 0 a 2 . 4 m s ; 2 0 0 a , 4 . 6 m s ; 4 0 0 S " 9 . 0 m s .DNA c o n c e n t r a t i o n s were n o t d e t e r m i n e d a n d t h u s o n l y t h e r e l a t i v e n u m b e r o ft r an s f or m an t s o b t a i ne d f r o m a s i n g l e DNA s a m p l e may b e c o m p a r e d . T r a n s -f o r m a t i o n s were p e r f o r m e d w i t h a range o f d i f f e r e n t amounts o f DNA t o ensuret h a t t h e n u m b e r o f t r a n s f o r m a n t s o b t a i n e d w a s a l i n e a r f u n c t i o n o f i n p u t DNA.

T h e a b o v e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t o p t i m a l e l e c t r o p o r a t i o n w i t h l a r g eBAC DNA occurs u n d e r s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t c o n d i t i o n s t h a nt h o s e t r a d i t i o n a l l y u s e d f o r s m a l l e r DNA. H o w e v e r , t h e s e r e s u l t swe r e o b t a i n e d w i t h DNA p u r i f i e d b y m i n i - p r e p s o f e x i s t i n g B ACc l o n e s . T h e r e l e v a n c e o f s u c h e x p e r i m e n t s t o t h e p r o c e s s o f c l o n ec o n s t r u c t i o n c a n n o t b e a s s u m e d , g i v e n t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e nm i n i - p r e p p e d DNA a n d a l i g a t i o n m i x . We t h e r e f o r e u s e d l i g a t i o nm i x e s o f t h e BeloBAC v e c t o r w i t h l a r g e ( . 1 0 0 k b ) m o u s e DNAt o t e s t c o n d i t i o n s f o r e l e c t r o p o r a t i o n . D a t a f r o m t h r e e s e p a r a t ee x p e r i m e n t s i n w h i c h a l i q u o t s f r o m l i g a t i o n r e a c t i o n s weret r a n s f o r m e d u s i n g d i f f e r e n t f i e l d s t r e n g t h s a r e s h o w n i n T a b l e 5 .T h e e f f i c i e n c y o f c l o n i n g , i . e . t h e y i e l d o f c l o n e s / 4 g i n s e r t DNA,i s i n f l u e n c e d b y p r o p e r t i e s a s s o c i a t e d w i t h e a c h p r e p a r a t i o n o fh i g h m o l e c u l a r w e i g h t DNA a n d v a r i e d c o n s i d e r a b l y b e t w e e nt h e s e t h r e e e x p e r i m e n t s . H o w e v e r , t h e BeloBAC v e c t o r m a k e suse o f t h e a c o m p l e m e n t a t i o n o f , 3 - g a l a c t o s i d a s e t o i n d i c a t ed i s r u p t i o n o f t h e c l o n i n g s i t e b y c o n v e r s i o n o f b l u e c o l o n y c o l o rt o w h i t e ( 2 2 ) . I n t r a n s f o r m a t i o n s w i t h a l i g a t i o n m i x , b l u ec o l o n i e s a r i s e f r o m u p t a k e o f t h e 7 . 3 k b v e c t o r , w h i l e w h i t ec o l o n i e s i n d i c a t e t h e presence o f i n s e r t e d DNA or o t h e r c h a n g e st o t h e c l o n i n g s i t e . T h e r a t i o o f w h i t e t o b l u e c o l o n i e s t h u sr e p r e s e n t s a f i r s t a p p r o x i m a t i o n o f t h e c l o n i n g e f f i c i e n c y , s i n c eb l u e c o l o n i e s i n d i c a t e t h e b a c k g r o u n d o f v e c t o r w i t h o u t i n s e r t s .I n e x p e r i m e n t 1 a s i n g l e l i g a t i o n w a s e l e c t r o p o r a t e d w i t h f i e l ds t r e n g t h s o f e i t h e r 9 , 1 3 , 1 7 or 2 1 k V c m . C o n s i s t e n t w i t h t h er e s u l t s o b t a i n e d u s i n g m i n i - p r e p p e d DNA, t h e h i g h e s t t o t a ln u m b e r o f c o l o n i e s w a s o b t a i n e d a t 1 3 k V /c m , w h i l e t h e m o s te x t r e m e f i e l d s t r e n g t h s , i . e . 9 a n d 2 1 k V /c m , p r o d u c e d t h e l o w e s tn u m b e r o f t o t a l c o l o n i e s ( T a b l e 5 ) . H o w e v e r , t h e f r a c t i o n o f w h i tec o l o n i e s p r o g r e s s i v e l y r o s e a s t h e f i e l d s t r e n g t h w a s d e c r e a s e d ,s u c h t h a t a l t h o u g h l e s s t h a n h a l f t h e t o t a l c o l o n i e s were o b t a i n e da t 9 c o m p a r e d w i t h 1 3 k V c m , t h e f r a c t i o n o f w h i te c o l o n i e sd o u b l e d a t t h e l o w e r f i e l d s t r e n g t h . S i n c e w h i te c o l o n y c o l o r d o e sn o t i n d i c a t e t h e s i z e o f i n s e r t e d DNA, we a n a l y z e d m i n i - p r e p p e dB AC DNA f r o m i n d i v i d u a l w h i t e c o l o n i e s o b t a i n e d u n d e r e a c h o ft h e s e c o n d i t i o n s t o d e t e r m i n e w h e t h e r e l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n sc o u l d a f f e c t t h e s i z e o f t h e p o p u l a t i o n o f BACs a r i s i n g f r o m t h et r a n s f o r m a t i o n . T h e r e s t r i c t i o n enzyme N o t I c u t s o n e a c h s i d e o ft h e c l o n i n g s i t e , e x c i s i n g t h e i n s e r t s f r o m t h e B AC v e c t o r a n dp e r m i t t i n g d e t e r m i n a t i o n o f i n s e r t s i z e s v i a p u l s e d f i e l d g e le l e c t r o p h o r e s i s . T h e N o t I d i g e s t i o n s o f t h e s e c l o n e s ( F i g . 2 ) r e v e a lt h a t t h e p r o p o r t i o n o f w h i t e c o l o n i e s w h i c h c o n t a i n l a r g e i n s e r t si n c r e a s e s a s t h e f i e l d s t r e n g t h i s r e d u c e d . O n l y t h r e e o f t h e 1 6 w h i t ec o l o n i e s o b t a i n e d b y e l e c t r o p o r a t i o n a t 1 7 kVcm c o n t a i n e d i n s e r t sl a r g e r t h a n t h e v e c t o r i t s e l f , b u t t h i s f r a c t i o n n e a r l y d o u b l e d w h e nt h e f i e l d s t r e n g t h w a s l o w e r e d t o 1 3 k V c m , a n d n e a r l y d o u b l e da g a i n a t 9 k V c m . T h i s i s n o t s u r p r i s i n g , s i n c e t h e w h i t e c o l o n i e sw i t h n o or very s m a l l i n s e r t s s h o u l d , j u s t l i k e t h e b l u e c o l o n i e s , b et r a n s f o r m e d r e l a t i v e l y l e s s w e l l t h a n c l o n e s w i t h l a r g e r i n s e r t s a tt h e l o w e r f i e l d s t r e n g t h s . I n t h e s e g e l s , l a n e s w i t h o u t v i s i b l e i n s e r tb a n d s a r e p r e s u m e d t o c o n t a i n very small f r a g m e n t s w h i c h a r e n o td e t e c t e d a n d l a n e s w i t h o u t a b a n d c o r r e s p o n d i n g t o t h e v e c t o rc o n t a i n very s m a l l d e l e t e d f o r m s o f t h e v e c t o r w i t h o u t i n s e r t .A l t h o u g h t h e n u m b e r o f c l o n e s a n a l y z e d w a s s m a l l , i t i s i n t r i g u i n gt h a t t h e average s i z e o f t h e c l o n e s g e n e r a t e d f r o m t h e l i g a t i o n m i xappears t o i n c r e a s e a s t h e f i e l d s t r e n g t h i s r e d u c e d ( T a b l e 5 ) . T h ei n c r e a s e in average s i z e o f t h e c l o n e s o b t a i n e d w i t h 1 3 k V c m ( 1 1 1 1 7 . 5 k b , average SEM) c o m p a r e d w i t h t h o s e p r o d u c e d a t 1 7

- 7kb0 8 0 k b

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1 9 9 4 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 5 , V o l . 2 3 , N o . 1 1k V / c m ( 9 3 2 3 . 1 k b ) i s i n k e e p i n g w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t f o rt h e l a r g e r m i n i - p r e p p e d BAC DNA; 1 3 k V / c m p r o d u c e d o p t i m u me f f i c i e n c y ( F i g . 1 ) . H o w e v e r , t h e a v e r a g e s i z e o f c l o n e s g e n e r a t e da t 9 k V / c m ( 1 3 9 1 5 . 0 k b ) w a s e v e n h i g h e r t h a n t h a t f o r t h e c l o n e sp r o d u c e d w i t h 1 3 k V c m . T h i s w a s a s u r p r i s e , g i v e n t h a tm i n i - p r e p p e d DNA f r o m l a r g e BAC c l o n e s t r a n s f o r m e d l e s s w e l la t 9 t h a n a t 1 3 kcm.We t h e r e f o r e r e p e a t e d t h i s e x p e r i m e n t w i t h d i f f e r e n t l i g a t i o nm i x t u r e s t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e i n c r e a s e i n t h e f r a c t i o n o fw h i t e c l o n e s , a s w e l l t h e i n c r e a s e i n t h e a v e r a g e s i z e o f t h e c l o n e s ,p r o d u c e d a t 9 c o m p a r e d w i t h 1 3 kVcm w a s r e p r o d u c i b l e .E x p e r i m e n t s 2 a n d 3 u s e d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t DNA w h i c h w a sc l o n e d w i t h m u c h h i g h e r e f f i c i e n c y t h a n t h a t u s e d i n e x p e r i m e n t1 . We p r e s u m e t h a t l e s s d a m a g e w a s i n c u r r e d d u r i n g t h ep r e p a r a t i o n a n d i s o l a t i o n o f t h e DNA u s e d i n e x p e r i m e n t s 2 a n d3 , r e s u l t i n g i n h i g h e r c l o n i n g e f f i c i e n c i e s . C o n s e q u e n t l y , t h e r ew a s a m u c h h i g h e r p r o p o r t i o n o f w h i t e c o l o n i e s f r o m t h e l i g a t i o n si n e x p e r i m e n t s 2 a n d 3 a n d v i r t u a l l y a l l w h i t e c o l o n i e s c o n t a i n e dl a r g e i n s e r t s . H o w e v e r , t h e s a m e p h e n o m e n o n w a s o b s e r v e d i nb o t h c a s e s , n a m e l y w h e n t h e f i e l d s t r e n g t h w a s l o w e r e d , t h ef r a c t i o n o f w h i t e c o l o n i e s r o s e . I n e x p e r i m e n t 2 a r e d u c t i o n o f t h ef i e l d s t r e n g t h f r o m 1 3 t o 9 k V / c m i n c r e a s e d t h e p r o p o r t i o n o fw h i t e c o l o n i e s f r o m 7 9 t o 85% a n d i n e x p e r i m e n t 3 a r e d u c t i o ni n f i e l d s t r e n g t h f r o m 1 2 . 5 t o 9 k V / c m r a i s e d t h e f r a c t i o n o f w h i t ec o l o n i e s f r o m 4 5 t o 6 7 % . I n b o t h t h e s e e x p e r i m e n t s t h e a v e r a g es i z e o f t h e c l o n e d DNA w a s a l s o h i g h e r w h e n t h e l o w e r o f t h e t w of i e l d s t r e n g t h s w a s u s e d f o r t h e e l e c t r o p o r a t i o n . I n e x p e r i m e n t 2t h e a v e r a g e s i z e i n c r e a s e d f r o m 9 8 5 . 8 t o 1 2 7 8 . 9 k b a n d i ne x p e r i m e n t 3 f r o m 1 1 6 8 . 6 t o 1 3 2 8 . 2 k b .A b s o l u t e c l o n i n g e f f i c i e n c y r e s u l t i n g f r o m d i f f e r e n te l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n s

i n t h e e l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n s c a n a l t e r t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f al i b r a r y r e s u l t i n g f r o m a s i n g l e l i g a t i o n , i n c l u d i n g t h e f r e q u e n c y o f' e m p t y ' c l o n e s l a c k i n g i n s e r t s a n d t h e a v e r a g e s i z e o f t h e c l o n e s .U s e o f t h e h i g h e r v o l t a g e g r a d i e n t s r o u t i n e l y e m p l o y e d f o r s m a l lp l a s m i d s ( e . g . 1 8 k V / c m ) w i l l s e v e r e l y i m p a i r e f f o r t s t o g e n e r a t el a r g e f r a g m e n t l i b r a r i e s b y e l e c t r o p o r a t i o n . H o w e v e r , t h e c h o i c eo f w h e t h e r t o e l e c t r o p o r a t e a t 1 3 o r 9 k V / c m c a l l s f o r a n i m p o r t a n td i s t i n c t i o n t o b e m a d e b e t w e e n t h e a v e r a g e s i z e o f t h e c l o n e s a n dt h e a b s o l u t e c l o n i n g e f f i c i e n c y p r o v i d e d b y s p e c i f i c e l e c t r o p o r a -t i o n c o n d i t i o n s . T a b l e 5 a l s o s h o w s t h e g e n o m i c c o v e r a g er e p r e s e n t e d b y t h e c l o n e s g e n e r a t e d i n t h e d i f f e r e n t t r a n s f o r m -a t i o n s . T h e t e r m c o v e r a g e r e f e r s t o t h e p r o d u c t o f t h e n u m b e r o fc l o n e s w i t h i n s e r t s a n d t h e a v e r a g e s i z e o f t h o s e i n s e r t s . D e s p i t et h e i n c r e a s e i n t h e a v e r a g e s i z e o f t h e c l o n e s p r o d u c e d a t l o w e rf i e l d s t r e n g t h s , t h e r e s u l t i n g d e c l i n e i n a b s o l u t e e f f i c i e n c y m e a n st h a t t h e a m o u n t o f DNA t h a t c a n b e c l o n e d u s i n g t h o s e c o n d i t i o n si s r e d u c e d a t t h e l o w e r f i e l d s t r e n g t h . F o r e x a m p l e , i n e x p e r i m e n t2 , a l t h o u g h t h e a v e r a g e c l o n e s i z e r o s e f r o m 9 8 t o 1 2 7 k b , t h ec o v e r a g e p r o v i d e d b y t h e c l o n e s g e n e r a t e d w a s r e d u c e d n e a r l y4 - f o l d , b e c a u s e o f t h e 5 . 6 - f o l d d r o p i n t h e n u m b e r o f c l o n e sr e c o v e r e d a t t h e l o w e r v o l t a g e . I n e x p e r i m e n t 3 , w h i l e t h e a v e r a g es i z e r o s e f r o m 1 1 6 t o 1 3 2 k b , 2 - f o l d f e w e r c l o n e s w e r e p r o d u c e d ,r e d u c i n g t h e o v e r a l l c o v e r a g e 1 . 7 - f o l d . T h u s t h e t r a d e - o f f f o r t h ei n c r e a s e d a v e r a g e c l o n e s i z e t h a t a c c o m p a n i e s e l e c t r o p o r a t i o n a tt h e v e r y l o w f i e l d s t r e n g t h - o f 9 k V / c m i s a r e d u c t i o n i n o v e r a l lc l o n i n g e f f i c i e n c y . I n o u r r e c e n t c o n s t r u c t i o n o f a m o u s e BACl i b r a r y a h i g h c l o n i n g e f f i c i e n c y p e r m i t t e d u s t o r o u t i n e l y u s e 9k V / c m f o r a l l e l e c t r o p o r a t i o n s ( M a n c i n o e t a l . , n o t s h o w n ) , w h i c hi s a p p r o x i m a t e l y h a l f t h e f i e l d s t r e n g t h p r e v i o u s l y r e c o m m e n d e df o r t r a n s f o r m a t i o n o f s m a l l e r DNA ( 1 2 ) .

T h e e x p e r i m e n t s p r e s e n t e d i n T a b l e 5 d e m o n s t r a t e t h a t c h a n g e sT a b l e 5 . T r a n s f o r m a t i o n o f BAC l i g a t i o n m i x t u r e s b y e l e c t r o p o r a t i o n a t d i f f e r e n t f i e l d s t r e n g t h s

F i e l d s t r e n g t h T o t a l n o . o f N o . o f w h i t e c o l o n i e s / W h i t e c o l o n i e s w i t h i n s e r t s / I n s e r t s i z e ( k b ) C o v e r a g e( k V / c m ) c o l o n i e s n o . o f b l u e c o l o n i e s ( % w h i t e ) w h i t e c o l o n i e s a n a l y z e d ( n S E M ) ( M b )E x p e r i m e n t 12 1 4 7 4 6 7 / 4 7 3 9 ( 1 . 5 % ) 4 / 7 ( 5 7 % ) 2 2 ( 4 . 5 ) 0 . 0 9

1 7 5 2 1 3 1 6 / 5 1 9 7 ( 3 . 1 % ) 3 / 1 6 ( 1 9 % ) 9 3 ( 2 3 . 1 ) 0 . 2 81 3 8 5 5 8 2 9 / 8 5 2 9 ( 3 . 4 % ) 7 / 2 0 ( 3 5 % ) 1 1 ( 1 7 . 5 ) 1 . 19 3 2 3 8 2 2 / 3 2 1 6 ( 6 . 8 % ) 1 2 / 2 0 ( 6 0 % ) 1 3 9 ( 1 5 . 0 ) 1 . 8E x p e r i m e n t 21 3 1 0 0 2 9 7 9 0 4 / 2 1 2 5 ( 7 9 % ) 1 9 / 2 0 ( 9 5 % ) 9 8 ( 5 . 8 ) 7 3 69 1 7 5 5 1 4 8 5 / 2 7 0 ( 8 5 % ) 2 0 / 2 0 ( 1 0 0 % ) 1 2 7 ( 8 . 9 ) 1 8 9

E x p e r i m e n t 31 2 . 5 1 4 9 0 0 6 7 0 0 / 8 2 0 0 ( 4 5 % ) 1 9 / 1 9 ( 1 0 0 % ) 1 1 6 ( 8 . 6 ) 7 7 79 8 3 9 6 3 3 7 3 / 5 0 2 3 ( 6 7 % ) 2 0 / 2 0 ( 1 0 0 % ) 1 3 2 ( 8 . 2 ) 4 4 5

T h r e e d i f f e r e n t l i g a t i o n m i x t u r e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f s i z e - s e l e c t e d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t m o u s e DNA a n d t h e BeloBAC v e c t o r were t r a n s f o r m e du s i n g d i f f e r e n t f i e l d s t r e n g t h s . M u l t i p l e a l i q u o t s w e r e e l e c t r o p o r a t e d f r o m e a c h l i g a t i o n u n d e r t h e d i f f e r e n t c o n d i t i o n s a n d t h e e n t i r e q u a n t i t y o f t r a ns f o r me d c e l l sw e r e p l a t e d f r o m e a c h e l e c t r o p o r a t i o n . A f t e r e l e c t r o p o r a t i o n , a l i q u o t s w e r e s p r e a d o n 1 5 0 mm d i s h e s , w i t h t h e t o t a l n u m b e r o f c o l o n i e s ( w h i t e + b l u e ) r a n g i n g u pt o 1 0 0 0 o n a n y d i s h . T h e p e r c e n t a g e o f w h i t e c o l o n i e s o f t h e t o t a l n u m b e r o f c o l o n i e s p r o d u c e d i s s h o w n . Random w h i t e c o l o n i e s f r o m e a c h e l e c t r o p o r a t i o n w e r ea n a l y z e d f o r t h e p r e s e n c e a n d s i z e o f i n s e r t D N A , b y d i g e s t i o n o f m i n i - p r e p DNA w i t h No d a n d PFGE a n a l y s i s , a s i n F i g u r e 2 . T h e n u m b e r o f w h i t e c o l o n i e s w i t hi n s e r t s r e f l e c t s o n l y t h o s e c l o n e s w h i c h c o n t a i n e d i n s e r t s > 4 k b . T h e p e r c e n t a g e s h o w n f o r w h i t e c o l o n i e s w h i c h w e r e f o u n d t o c o n t a i n i n s e r t s i s a l s o s h o w n f o r e a c hc o n d i t i o n . T h e a v e r a g e s i z e a n d t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e mean ( S E M ) f o r t h e s e s i z e s i s s h o w n f o r e a c h e l e c t r o p o r a t i o n . C a l c u l a t i o n s o f a v e r a g e s i z e , w h i c h i n c l u d ec l o n e s c o n t a i n i n g i n s e r t s s m a l l e r t h a n 4 k b , y i e l d t h e s a m e t r e n d o f v o l t a g e d e p e n d e n c e , t h o u g h w i t h s m a l l e r a v e r a g e s i z e s . C o v e r a g e r e f e r s t o t h e t o t a l amount o fg e n o m i c DNA c l o n e d u n d e r e a c h c o n d i t i o n a n d i s c a l c u l a t e d f r o m t h e t o t a l n u m b e r o f w h i t e c o l o n i e s , t h e p r o p o r t i o n o f w h i t e c o l o n i e s w i t h i n s e r t s a n d t h e a v e r a g es i z e o f t h o s e i n s e r t s . E x p e r i m e n t 1 w a s p e r f o r m e d u s i n g a r e s i s t a n c e o f 2 0 0 Q w h i l e e x p e r i m e n t s 2 a n d 3 were p e r f o r m e d u s i n g 1 0 0 L I

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 5 , V o l . 2 3 , N o . 1 1 1 9 9 52 1 k V / c m 1 7 kV/cm 1 3 k V / c m 9 kV/cm

2 0 0 -1 5 0 -1 0 0 -

5 0 -

v e c t o r -

F i g u r e 2 . T r a n s f o r m a n t s a r i s i n g f r o m e l e c t r o p o r a t i o n o f a l i g a t i o n m i x a t d i f f e r e n t v o l t a g e g r a d i e n t s . A s i n g l e l i g a t i o n m i x w a s u s e d f o r m u l t i p l e e l e c t r o p o r a t i o n s w i t ha v o l t a g e g r a d i e n t o f 9 , 1 3 , 1 7 o r 2 1 k V / c m . M i n i - p r e p p e d DNA f r o m r e s u l t i n g w h i t e c o l o n i e s w a s d i g e s t e d w i t h N o t I a n d a n a l y z e d b y p u l s e d f i e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s .T h e s i z e s a s s o c i a t e d w i t h t h e l a m b d a l a d d e r s i z e m a r k e r s ( t h e f a r l e f t l a n e o f e a c h g e l ) a r e i n d i c a t e d i n k b . I n a d d i t i o n , e a c h g e l c o n t a i n e d t h e M i d r a n g e I , M i d r a n g eII a n d L o w r a n g e s i z e m a r k e r o f New E n g l a n d B i o l a b s . T h e common b a n d o f 7 . 3 k b i s t h a t o f t h e B e l o B A C v e c t o r .

DISCUSSIONR o l e o f t h e h o s t c e l lT h e e f f i c i e n c y o f b a c t e r i a l t r a n s f o r m a t i o n u s i n g t h e m o s tcommon m e t h o d o f e l e c t r o p o r a t i o n i s s t r o n g l y s i z e r e l a t e d . Weh a v e s h o w n a n - 2 0 - f o l d r e d u c t i o n i n t h e t r a n s f o r m a t i o n e f f i -c i e n c y , o n a m o l a r b a s i s , when t h e s i z e o f t r a n s f o r m e d BACs i si n c r e a s e d f r o m 1 5 0 t o 2 4 0 k b . F o r s t r a i n DH1OB d i m i n i s h e dt r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y i s n o t a p p a r e n t u n t i l DNA s i z e i s > 8 0k b . A s ou r a b i l i t y t o prepare a n d h a n d l e DNA o f d e f i n e d s i z e s i nt h i s ran ge i s a r e c e n t d e v e l o p m e n t , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t t h e s i z ed e p e n d e n c e o f t r a n s f o r m a t i o n f o r m o l e c u l e s i n t h i s s i z e range i sn o t w e l l u n d e r s t o o d . F o r e x a m p l e , a l t h o u g h i t h a s b e e n r e p o r t e dt h a t s t r a i n s s u c h a s D H 1 O B , w h i c h c o n t a i n a m u t a t i o n i n t h e d e o Rg e n e , e x h i b i t h i g h e r t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c i e s w i t h 6 0 k b DNA( 2 ) , t h e b a s i s f o r t h i s i s n o t k n o w n . T h i s m u t a n t w a s o r i g i n a l l ys e l e c t e d f o r i t s a b i l i t y t o g r o w w i t h i n o s i n e a s t h e s o l e c a r b o ns o u r c e ; t h e r e l a t i o n s h i p o f t h i s p h e n o t y p e t o p r o p e r t i e s o fe l e c t r o p o r a t i o n h a s n o t b e e n e s t a b l i s h e d . T h e f a c t t h a t u p t a k e o fl a r g e DNA i s so s t r o n g l y g o v e r n e d b y t h e g e n e t i c b a c k g r o u n d o ft h e h o s t s u g g e s t s t h a t t h e r e may b e o t h e r m u t a t i o n s w h i c h c o u l ds i m i l a r l y i n f l u e n c e l a r g e DNA u p t a k e . A t t h e p r e s e n t , o n l y d e o Rm u t a n t s ar e k n o w n t o t a k e u p l a r g e DNA s u f f i c i e n t l y w e l l t oc o n s i d e r t h e m as h o s t s f o r l a r g e i n s e r t l i b r a r y c o n s t r u c t i o n .R e m a r k a b l y , t h e t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o f DH1OB w i t hm o l e c u l e s a s l a r g e as 8 0 k b w a s c o m p a r a b l e , o n a m o l a r b a s i s ,w i t h t h a t f o r 7 . 3 k b m o l e c u l e s . T h i s i s n o t t h e case w i t h o t h e rs t r a i n s t e s t e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e f a c t t h a t s u c h h i g ht r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c i e s c an b e o b t a i n e d f o r m o l e c u l e s u p t o a tl e a s t 8 0 k b i n d i c a t e s t h a t f o r DH1OB e l e c t r o p o r a t i o n c an e q u a l ore x c e e d t h e e f f i c i e n c y o f t r a n s f o r m a t i o n p r o d u c e d b y i n v i t r op a c k a g i n g t o p r o d u c e i n f e c t i o u s P 1 p h a g e p a r t i c l e s ( 2 3 ) .D i f f e r e n t o p t i m a l c o n d i t i o n s f o r e l e c t r o p o r a t i o n o fl a r g e a n d s m a l l DNAW i t h i n t h e l i m i t e d n u m b e r o f p a r a m e t e r s we h a v e e x a m i n e d ,d i f f e r e n c e s e x i s t i n t h e o p t i m u m c o n d i t i o n s f o r t r a n s f o r m a t i o n b yl a r g e , as o p p o s e d t o s m a l l , DNA m o l e c u l e s . E l e c t r o p o r a t i o nc o n s i s t s o f a t l e a s t t h r e e d i s t i n c t p r o c e s s e s : f o r m a t i o n o f p o r e s ,e n t r y o f t h e DNA i n t o t h e c e l l a n d recovery o f t h e c e l l s . E a c h o ft h e s e s t e p s may b e s i z e s e n s i t i v e . T h e m o l e c u l e s u n d e r c o n s i d e r -a t i o n h a v e very l o n g c o n t o u r l e n g t h s r e l a t i v e t o t h e s i z e o f t h ec e l l s . I f open c i r c u l a r DNA i s f e d t h r o u g h t h e pore d o u b l e d b a c k

o n i t s e l f , t h e n DNA m o l e c u l e s o f v a s t l y d i f f e r e n t s i z e s w o u l dh a v e t h e s a m e d i m e n s i o n s i n t h e p o r e , b u t w o u l d r e q u i r e d i f f e r e n tl e n g t h s o f t i m e t o c o m p l e t e t h e i r e n t r y . P u l s e r e g i m e n s t h a te m p l o y a b r i e f i n i t i a l h i g h v o l t a g e p u l s e t o open t h e p o r e ,f o l l o w e d b y a l o n g e r p e r i o d o f l o w e r v o l t a g e t o a l l o w l o n g e rm o l e c u l e s m o r e t i m e f o r e n t r y ( 6 ) may prove even m o r e e f f e c t i v ef o r t r a n s f o r m a t i o n o f l a r g e DNA t h a n t h e s i n g l e - p u l s e r e g i m e nweh a v e u s e d . T h e d i f f e r e n c e i n o p t i m u m f i e l d s t r e n g t h f o r l a r g ea n d s m a l l DNA c o u l d r e f l e c t d a m a g e t o t h e l a r g e DNA a t t h eh i g h e r f i e l d s t r e n g t h s . I t h a s b e e n s h o w n t h a t X DNA c a n b ed e n a t u r e d b y exposure t o t h e h i g h f i e l d s t r e n g t h s u s e d f o re l e c t r o p o r a t i o n ( 2 4 ) a n d t h a t a l t h o u g h t h e use o f h i g h e r f i e l ds t r e n g t h s r e s u l t s i n l a r g e r a m o u n t s o f DNA b e i n g t r a n s f e r r e d i n t oc e l l s , t h e a b i l i t y o f t h i s DNA t o f u n c t i o n , a s m e a s u r e d b yt r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y , s h o w s a maximum a t l o w e r f i e l ds t r e n g t h s ( 1 7 ) . T h e c o n d i t i o n s wenow e m p l o y f o r t r a n s f o r m a t i o no f m o l e c u l e s > 5 0 k b a r e : 9 or 1 2 . 5 kVcm, 1 0 0 Q 2 5 R F .E l u c i d a t i o n o f t h e a c t u a l process b y w h i c h l a r g e DNA e n t e r s t h ec e l l s h o u l d s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e o ur a b i l i t y t o f u r t h e r i n c r e a s et r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c i e s .E l e c t r o p o r a t i o n c o n d i t i o n s a n d l i b r a r y c o n s t r u c t i o nT h e s t r o n g s i z e d e p e n d e n c e o f e l e c t r o p o r a t i o n h a s s e v e r a li m p l i c a t i o n s f o r t h e process o f l a r g e i n s e r t l i b r a r y c o n s t r u c t i o na n d m a n i p u l a t i o n . S i n c e l i b r a r y c o n s t r u c t i o n i n v o l v e s t r a n s f o r m -a t i o n w i t h a m i xt u r e o f d i f f e r e n t s i z e d m o l e c u l e s , e l e c t r o p o r a t i o ni n t r o d u c e s b i a s t o w a r d s recovery o f c l o n e s o r i g i n a t i n g f r o m t h es m a l l e s t m o l e c u l e s i n t h e m i x t u r e . I n s e r t DNA i s o f t e n p r e p a r e du s i n g p u l s e d f i e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s , b u t t h e s e g e l s a r e e x t r e m e l ys e n s i t i v e t o o v e r l o a d i n g , w h i c h p r o m o t e s c o - m i g r a t i o n o f s m a l lDNA w i t h m o l e c u l e s t h a t a r e much l a r g e r . T h u s c a r e f u l s i z es e l e c t i o n o f DNA w h i c h i s p r e p a r e d a t a n a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a -t i o n i s n e e d e d t o ensure t h a t o n l y a n a r r o w s i z e range o f m o l e c u l e sw i l l b e p r e s e n t f o r t h e t r a n s f o r m a t i o n s t e p . I f l a r g e DNAm o l e c u l e s h a v e b e e n p u r i f i e d w i t h t h e i n t e n t o f g e n e r a t i n g l a r g ec l o n e s , t h e s e m o l e c u l e s w i l l t r a n s f o r m w i t h t h e d e c r e a s e de f f i c i e n c y a s s o c i a t e d w i t h t h e i r l a r g e i n s e r t s i z e . We r o u t i n e l y seea d r a m a t i c d e c r e a s e i n c l o n i n g e f f i c i e n c y when DNAs w h i c hd i f f e r b y r a t h e r m o d e s t i n c r e m e n t s o f s i z e a b o v e 8 0 k b are u s e d( M a n c i n o a n d B i r r e n , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) .W h i l e t h e o v e r a l l B AC c l o n i n g e f f i c i e n c y i s t h e r e s u l t o f as e r i e s o f c o m p l e x e v e n t s , t h e s i z e d e p e n d e n c e o f t h e BAC c l o n i n ge f f i c i e n c y t h a t we see s t r o n g l y p a r a l l e l s t h e s i z e d e p e n d e n c e o f

2 0 0 -15 0 -1 0 0 -50-

vec t o r -

7/27/2019 Large DNA transformation.pdf

7/7

1 9 9 6 N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h , 1 9 9 5 , V o l . 2 3 , N o . 1 1t r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c i e s o b t a i n e d w i t h p u r i f i e d BACs o fk n o w n s i z e s . F u r t h e r , w e h a v e d e m o n s t r a t e d t h e a b i l i t y t o a l t e r t h em a k e - u p o f l i b r a r i e s s i m p l y b y m o d u l a t i n g t h e e l e c t r o p o r a t i o nc o n d i t i o n s . F o r e x a m p l e , w i t h t h e s a m e l i g a t i o n w e w e r e a b l e t oi n c r e a s e t h e a v e r a g e s i z e o f t h e c l o n e s p r o d u c e d f r o m 9 3 t o 1 3 9k b a n d d o u b l e t h e n u m b e r o f c l o n e s w h i c h c o n t a i n e d i n s e r t s( T a b l e 5 , e x p e r i m e n t 1 ) . C o n d e n s i n g t h e l i g a t e d DNA p r i o r t ot r a n s f o r m a t i o n b y i n t r o d u c t i o n o f s u p e r c o i l i n g m a y a l s o i n c r e a s et r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y . T h e d i f f i c u l t y o f q u a n t i t a t i n g p u r ep o p u l a t i o n s o f s u p e r c o i l e d a n d o p e n c i r c u l a r l a r g e DNA m o l -e c u l e s h a s s o f a r p r e v e n t e d a p r e c i s e e v a l u a t i o n o f t h e r e l a t i v et r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y o f t h e s e t w o s p e c i e s .F i n a l l y , i t i s i m p o r t a n t t h a t l a r g e i n s e r t l i b r a r i e s b e m a i n t a i n e da s f r o z e n b a c t e r i a a n d n o t a s DNA s t o c k s . F i r s t , we o b s e r v e ar a p i d d e c r e a s e i n t h e t r a n s f o r m i n g a b i l i t y o f m i n i - p r e p p e d BACDNA u p o n s t o r a g e a t 4 C , w h i c h i s m u c h m o r e p r o n o u n c e d t h a nf o r s m a l l e r m o l e c u l e s . T h i s d e c r e a s e o c c u r s e v e n m o r e r a p i d l yw i t h c y c l e s o f f r e e z i n g a n d t h a w i n g o f t h e BAC s a m p l e s , w h i l es m a l l m o l e c u l e s a r e r e l a t i v e l y u n a f f e c t e d b y t h i s p r o c e s s ( d a t a n o ts h o w n ) . M o r e s e r i o u s l y , i f e v e n a s m a l l p r o p o r t i o n o f t h e DNAi n a s a m p l e c o n s i s t s o f d e l e t e d m o l e c u l e s , t h e s e w i l l t r a n s f o r mm o r e e f f i c i e n t l y t h a n t h e o r i g i n a l l a r g e r DNA a n d t h u s w i l l b ep r e f e r e n t i a l l y r e c o v e r e d . T r a n s f o r m a t i o n i t s e l f d o e s n o t a p p e a r t oi n d u c e r e a r r a n g e m e n t s o r d e l e t i o n s f o r t h e s e c l o n e s ( 2 5 ; S h i z u y a ,u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) , h o w e v e r , i t i n t r o d u c e s a s t r o n g s e l e c t i o n f o rt h e r a r e d e l e t i o n s t h a t d o o c c u r .

ACKNOWLEDGEMENTSWe t h a n k E r i c L a i a n d A l e x a n d e r B o i t s o v f o r v a l u a b l e d i s -c u s s i o n s t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s w o r k , N a n c y S h e p h e r d ,J e f f S t e i n a n d J e n n i f e r L e e f o r h e l p f u l s u g g e s t i o n s r e g a r d i n g t h em a n u s c r i p t a n d M a r y S c h r a m k e a n d B i o R a d L a b o r a t o r i e s f o r u s eo f t h e G e n e P u l s e r H I . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t t o BWBf r o m t h e NCHGR ( l R O l H G 0 0 9 3 4 ) .

REF ERENCES1 A v e r y , O . T . , M a c C l e o d , C . M . a n d M c C a r t , M . ( 1 9 4 4 ) J . E x p . M e d . , 7 9 ,1 3 7 - 1 5 8 .2 H a n a h a n , D . , J e s s e e , J . a n d B l o o n , F . R . ( 1 9 9 1 ) M e t h o d s E n z y m o l . , 2 0 4 ,6 3 - 1 1 3 .3 N e u m a n , E . , S o w e r s , A . E . , a n d J o r d a n , C . A . ( e d s ) ( 1 9 8 9 ) E l e c t r o p o r a t i o n

a n d E l e c t r o f u s i o n i n C e l l B i o l o g y . P l e n u m , New Y o r k , NY4 C h a n g , D . C . , C h a s s y , B . M . , S a u n d e r s , J . A . a n d S o w e r s , A . E . ( e d s ) ( 1 9 9 2 )G u i d e t o E l e c t r o p o r a t i o n a n d E l e c t r o f u s i o n . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o ,C A .5 K l e n c h i n , V . A . , S u k h a r e v , S . I . , S e r o v , S . M . , C h e r n o m o r d i k , L . V . a n dC h i z m a d z h e v , Y u . A . ( 1 9 9 1 ) B i o p h y s . J . , 6 0 , 8 0 4 - 8 1 1 .6 S u k h a r e v , S . I . , K l e n c h i n , V . A , S e r o v , S . M . , C h e r n m o r d i k , L . V . a n dC h i z m a d z h e v , Y u . A . ( 1 9 9 2 ) B i o p h y s . J . , 6 3 , 1 3 2 0 - 1 3 2 7 .7 W o n g , T . - K . a n d N e u m a n n , E . ( 1 9 8 2 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . ,1 0 7 , 5 8 4 - 5 8 7 .8 C h a n g , D . ( 1 9 8 9 ) B i o p h y s . J . , 5 6 , 1 0 5 3 - 1 0 5 8 .9 E l v i n , S . a n d B i n g h a m , A . H . A . ( 1 9 9 1 ) L e t t . A p p l . M i c r o b i o l . , 1 2 , 3 9 - 4 2 .1 0 T e k l e , E . , A s t u m i a n , R . D . a n d C h o c k , P . B . ( 1 9 9 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U S A , 8 8 , 4 2 3 0 - 4 2 3 4 .1 1 G i m s a , J . , M a r s z a l e k , P . , L o e w e , U . a n d T s o n g , T . Y ( 1 9 9 1 ) B i o e l e c t .B i o e n e r g . , 2 9 , 8 1 - 8 9 .1 2 D o w e r , W . J . , M i l l e r , J . F . a n d R a g s d a l e , C . W . ( 1 9 8 8 ) N u c l e i c A c i d s R e s . , 1 6 ,6 1 2 7 - 6 1 4 5 .1 3 A n t o n o v , P . A . , M a x i m o v a , V . A . a n d P a n c h e v a , R . P . ( 1 9 9 3 ) B i o c h i m .B i o p h y s . A c t a , 1 2 1 6 , 2 8 6 - 2 8 8 .1 4 X i e , T . D . a n d T s o n g , T . Y ( 1 9 9 2 ) B i o p h y s . J . , 6 3 , 2 8 - 3 4 .1 5 E y n a r d , N , S i x o u , S . , D r a n , N . a n d T e i s s i e J . ( 1 9 9 2 ) E u r : J . B i o c h e m . , 2 0 9 ,4 3 1 - 4 3 6 .1 6 M i l l e r , J . F . , D ow e r ,W . J . a n d T o m p k i n s , L . S . ( 1 9 8 8 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U S A , 8 5 , 8 5 6 - 8 6 0 .1 7 X i e , T . D . , S u n , L . , Z h a o , H . G . , F u c h s , J . A . a n d T s o n g , T . Y ( 1 9 9 2 ) B i o p h y s .J . , 6 3 , 1 0 2 6 - 1 0 3 1 .1 8 K o b o r i , M . a n d N o j i m a , H . ( 1 9 9 3 ) N u c l e i c A c i d s R e s . , 2 1 , 2 7 8 2 .1 9 S h i z u y a , H . , B i r r e n , B . , M a n c i n o , V . , S l e p a k , T . , T a c h i i r i , Y , K i m , U . - J . a n dS i m o n , M . ( 1 9 9 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 9 , 8 7 9 4 - 8 7 9 7 .2 0 B i m b o i m , H . C . a n d D o l y , J . ( 1 9 7 9 ) N u c l e i c A c i d s R e s . , 7 , 1 5 1 3 - 1 5 2 3 .2 1 S a m b r o o k , J . , F r i t s c h , E . a n d M a n i a t i s , T . ( 1 9 8 9 ) M o l e c u l a r C l o n i n g : AL a b o r a t o r y M a n u a l . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , C o l d S p r i n gH a r b o r , N Y .2 2 M e s s i n g , J . , G r o n e n b o m , B . , M i i l l e r - H i l l , B . a n d H o f s c h n e i d e r , P . H . ( 1 9 7 7 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 4 , 3 6 4 2 - 3 6 4 6 .2 3 S t e r n b e r g , N . ( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 8 7 , 1 0 3 - 1 0 7 .2 4 S a b e l n i k o v , A . G . a n d C y m b a l y u k , E . S . ( 1 9 9 0 ) B i o e l e c t . B i o e n e r g . , 2 4 ,3 1 3 - 3 2 1 .

2 5 I o a n n o u , P . A . , A m e m i y a , C . T . , G a m e s , J . K r o i s e l , P . M . , S h i z u y a , H . , C h e n , C . ,B a t z e r , M . A . a n d d e J o n g , P . ( 1 9 9 4 ) N a t u r e G e n e t . , 6 , 8 4 - 8 9 .