LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

(Identifikasi dan Determinasi Sel Bakteri : Uji Biokimiawi )

Disusun Oleh :

Nama : Indah Kertawati

NIM : 098114039

Kelompok : B3

Tgl. Praktikum: 24 Maret 2010

Pj Laporan :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKUTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

2010

ACARA V

IDENTIFIKASI DAN DETERMINASI SEL BAKTERI: UJI BIOKIMIAWI

I. UJI BIOKIMIAWI

A. Tujuan :

Mengidentifikasi dan mendeterminasi bakteri berdasarkan sifat – sifat

biokimianya.

B. Dasar Teori:

Aktivitas – aktivitas enzimatis pada mikroba sangat berguna untuk

membedakan mikroba yng satu dengan mikroba yang lain. Atas dasar ini dapat

diketahui bahwa beberapa bakteri yang sangat erat kekerabatannya sering

dipisahkan dalam golongan yang berlainan dengan menguji kemampuan mirobia

tersebut untuk dapat mengadakan fermentasi sejenis hidrat arang. ( Tarigan, 1988)

Untuk mengidentifikasi bakteri dengan pengujian biokimia, diambil dari

koloni yang terpisah. Pengujian berdasarkan kerja hasil metabolisme yang

disebabkan oleh daya kerja enzim. Pengujian biokimia memerlukan berbagai

media untuk mendapatkan berbagai sifat mikroorganisme.

Tes Oksidasi, uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidasi sitokrom

pada mikroorganisme tertentu. ( Brock, 1979)

Test Katalase, Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian

hidrigen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen hidrogen peroksida yang

bersifat toksis terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel.

Pengujian katalase berguna dalam identifikasi kelompok bakteri tertentu. ( Lay,

1994)

Test O-F ( Oksidasi- Fermentasi ), Untuk menguji metabolism bakteri

oksidatif atau fermentatif. Oksidasi terjadi dalam tabung oleh organism aerob dan

fermentasi oleh organism anaerob. Pada fermentasi Glikosa akan diubah menjadi

glukosa G- Phospat yang kemudian dirombak menjadi asam piruvat. Begitu juga

oksidase akan merubah glukosa menjadi asam pirufat. ( Lay, 1994 )

Test penggunaan sitrat, uji ini digunakan untuk melihat kemampuan

mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon dan

energi. Untuk uji ini digunakan medium sitrat, koser, berupa medium cair atau

medium sitrat simon berupa medium padat. Bila organism mampu menghaasilkan

sitrat maka asam sitrat akan dihilangkan dari lingkungan sehingga Ph naik dan

suasana basa ( indikator beruah menjadi biru ) ( Lay, 1994)

Test Dekarboksilase lisin, Beerapa asma amino dapat didekarboksilase oleh

mikroorganisme. Dekarboksilase paling banyak terdeteksi adalah lisin, ornithin,

dan arginin. Dekarboksilasi melepaskan produk – produk yang netral, dan proses

ini dapat dideteksi secara langsung dengan menggunakan indicator PH seperti

bromocresol ungu yang berwarna kuning pada kondisi asam dan berwarna ungu

pada kondisi alkalis. ( Lay, 1994 )

Hidrolisis Gelatin, gelatin adalah suatu protein hewani bila digunakan

membentuk gel. Beberapa mikroorganisme dapat menguraikan gelatin sehingga

asam amino yang dihasilkan dapat digunakan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin

oleh mikroba dilakukan oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang

telah dicerna tidak mampu membentuk gel dan sifatnya cair. Uji glikolisis gelatin

dilakukan untuk mengidentifikasi Pseudomonas Flavobacterium, Serrana ( Lay,

1994 )

Pembentukan H2S, sulfur ditemukan pada berbagai senyawa seperti asam

amino sistein dan tiosulfat inorganik dapat direduksi menjadi gas H2S oleh

beberapa mikroorganisme. Gas tersebut dapat dideteksi karena kemampuannya

dalam bereaksi dengan garam ferro untuk menghasilkan ferrous sulfida, suatu

endapan berwarna hitam. Biasanya digunakan untuk bakteri seperti salmonella,

Arizona, Edwardsiella, dan proteus.( Lay, 1994 )

Pembentukan Indol, indol adalah produk yang dilepaskan dari oksidasi

asam amino ripofan. Indol dideteksi pada medium kultur dengan menggunakan

dimetilaminobenzaldehid (warna keruh) digunakan untuk membedakan Eszhericia

( + ), dari eschericia ( - ) untuk mengkarakterisasi anggota genus bacillus ( Lay,

1994 )

Test Voges- Proskaver, pengujian ini digunakan untuk mengidentifikasi

mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi 2,3-butadianol. Bila bakteri

memfermentasikan karbihidrat menjadi 2,3-butadianol sebagai produk utama akan

terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Perubahan warna

diperjelas dengan menggunakan larutan alfa-naftol. Digunakan untuk memisahkan

klebsiella dan enterobacter (+), dari eschericia (-) untuk mengkarakterisasi anggota

genus bacillus ( Lay, 1994 )

C. Prosedur Kerja :

Akat dan Bahan :

1. Isolat murni bakteri tanah sludge ( hasil percobaan acara III ) dalam NA

miring dan NB ( Nutrien cair )

2. Reagen untuk tes oksidase : Tetramethyl-paraphenyldiamine

3. Reagen untuk tes katalase : 10 % atau 30 % H2O2

4. Bahan untuk O- F yang mengandunng 0,5 – 1 % karbohidrat, paraffin cair

5. Bahan untuk test sitrat : simmons Citrate agar yang mengandung indicator

Brom Thymol Blue-BTB

6. Bahan untuk dekarboksilase Lisin : Media lysine iron agar ( LIA ) yang

mengandung Lysin dan indicator Brom Cresol Purple-BCP, media tanpa

Lysin

7. Media nutrient agar ( NA )

8. Gelatin

9. Media TSIA ( Triple Sugar Iron Agar )

10. Bahan untuk tes pembentukan indol : media Trypton Water, reagen

konvacs

11. Bahan untuk pembentukan : MR – VP, larutan 40 % KOH, larutan 5 %

alpha-naphthol

12. Buku Panduan Determinasi Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology ( Holt et al., 2000 )

13. Jarum Ose

14. Pipet volum steril

Cara Kerja :

1. Test Oksidase

Meletakan 2 – 3 tetes larutan tetrametyl – paraphenyldiamine pada kertas

saring

↓

Mengambil isolate murni bakteri dalam nutien cair dan inokulasikan pada

kertas saring yang telah ditetesi reagen.

↓

Mengamatii dan laporkan hasil pengujian

↓

Terjadi reaksi positif jika timbul endapan berwarna ungu tua atau hitam

setelah didiamkan selama beberapa lama. Kadang kala perubahan warna

memakan waktu lebih lama sampai 10 – 30 menit. Membandingkan dengan

kontrol (tanpa inokulasi bakteri).

2. Test Katalase

Meletakan 1 – 2 tetes larutan 10 % atau 30 % larutan H2O2 pada gelas benda

↓

Menambahkan 1 ose atau 2 – 3 tetes suspense isolate murni bakteri.

↓

Mengamati yang terjadi. Hasil positif ditandai dengan timbulnya buih seketika

↓

Membandingkan dengan kontrol ( tanpa inokulasi bakteri )

3. Test O-F (Oksidasi – Fermentasi)

Menginokulasikan secara haati-hati isolate murni bakteri kedalam 4 tabung

berisi media O-F yang mengandung 0,5%-1% karbohidrat ( glukosa, laktosa,

manitol, maltose, atau sukrosa) secara tusukan.

↓

Menutup tabung I dengan paraffin lunak, tabung II tidak ditutup paraffin,

tabung III dan IV sebagai kontrol ( ditutup paraffin dan tidak ditutup paraffin

tanpa inokolasi bakteri)

↓

Mengamati setalah 24 jam pada suhu kamar

↓Membandingkan perlakuan dengan kontrol ( Terjadi oksidasi apabila

terbentuk warna kuning pada media O-F yang tidak ditutup paraffin, terjadi

pada mikroba aerobik. Terjadi fermentasi apabila terbentuk warna kuning

pada media O-F yang ditutup paraffin, terjadi pada mikroba anaerob)

↓

Membandingkan dengan kontrol ( Perhatikan perubahan warna media yang

terjadi dan indicator yang terkandung dalam media O-F )

4. Test Penggunaan Sitrat

Menginokulasikan isolate murni bakteri secara goresan menggunakan ose dan

secara secara tusukan menggunakan jarum inokulasi pada media Simmons

Citrate Agar Miring.

↓

Kemudian menginkubasi selama 24 jam pada suhu kamar

↓

Membandingkan dengan kontrol ( perhatikan perubahan warna dari hijau

menjadi biru)

5. Test Dekarboksilase Lysin

Pada medium yang mengandung Lysin dan kontrol ( media tanpa lysine)

diinokulasikan secara tusukan dengan isolate murnii bakteri

↓

Menginkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Hasil positif jika terjadi

perubahan warna dari kuning, menjadi ungu dan kembali ke ungu, sementara

pada kontrol terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning.

6. Test Hidrolisis Gelatin

Menginokulasi isolate murni bakteri secara tusukan pada media yang

mengandung gelatin sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan.

↓

Menginkubasi elama 24 jam pada suhu kamar

↓

Memasukkan tabung perlakuan dan kontrol ( media tanpa inokulasi bakteri )

kedalam lemari es selama 30 menit. Terjadi hasil positif jika terjadi

pencairan.

7. Uji H2S dan Fermentasi Gula-gula

Dengan menggunakan media TSIA, inokulasikan isolate murni bakteri secara

goresan menggunakan jarum inokulasi.

↓

Meng inokulasi selama 24 jam. Pembentukan H2S ditunjukan dengan

terbentuknya endapan berwarna hitam.

↓

Perubahan arna media TSIA, dari merah menjadi kuning menunjukan adanya

fermentasi gula ( glukosa, sukrosa, laktosa)

↓

Mengamati juga terbentuknya gas yang ditandai dengan pecahnya media atau

terangkatnya media keatas.

↓

Membandingkan dengan kontrol ( media tanpa inokulasi bakteri.

8. Uji Indol

Menginkubasi 1 tabung media Trypton Water dengan 2 tetes isolate murni

bakteri dan satu tabung media untuk kontrol ( tanpa inokulasi bakteri )

↓

Menginkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.

↓

Setelah inkubasi, tiap-tiap tabung ditambah 5 mL larutan reagen konvacs.

Terbentuknya warna merah / merah muda pada lapisan larutan reagen

menunjukan terbentuknya indol.

↓

Membandingkan dengan kontrol

9. Test MR ( Methy Red )

Menginokulasikan isolate murni bakteri pada media MP-VP ( media Methy

Red – Voges Proskauer )

↓

Menginkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar.

↓

Menambahkan 5 tetes reagen metyl red kedalam tabung berisi media MR-VP.

↓

Mengocoknya dengan hati-hati. Hasil positif terjadi jika terbentuk warna

merah dalam 30 menit setelah penambahan reagen.

↓

Membandingkan dengan kontrol ( tanpa inokulasi bakteri )

10. Test VP ( Voges Proskauer )

Menginokulasikan isolate murni bakteri pada media MR-VP

↓

Menginkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar

↓

Menambahkan 0,6 ml larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan 0,2 ml KOH 40%.

↓

Mengocok dengan hati-hati, melonggarkan tutupnya, dan kocok kembali,

ulangi setiap 5 menit.

↓

Mengamati perubahan warnanya setelah 30 menit. Tes menunjukan hasil

positif jika terjadi warna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan

reagen.

II. DETERMINASI BAKTERI

Hasil – hasil pengujian dimasukan dalam daftar pengamatan yang disebut

Descriptive Chart. Untuk determinasi bakteri digunakan buku panduan

determinasi bakteri Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.