LAPORAN PRAKTIKUM 1 Mikrobiologi
-
Upload
yuny-hafitry -
Category
Documents
-
view
1.374 -
download
11
Transcript of LAPORAN PRAKTIKUM 1 Mikrobiologi
LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
STERILISASI ALAT DAN BAHAN
PADA PENGUJIAN MIKROBIOLOGI
Nada Rinjani (10060309116)
Tristhy Novilia A (10060309117)
Indah Abdilah (10060309118)
Yuny Hafitry (10060309119)
Tanggal Praktikum : 12 Oktober 2010
Tanggal Laporan : 26 Oktober 2010
Asisten : Reza Abdul Kodir., S.Si
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG
2010
I. TUJUAN PRAKTIKUM
Memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk alat dan
bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi serta mampu menyiapakan dan membuat
media steril untuk pengujian mikrobiologi.
II. TEORI DASAR
Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga
jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang
biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora
bakteri(Fardiaz, 1992).
Sterilisasai adalah tahap awal yang penting dari proses pengujian mikrobiologi. Ada
5 metode umum sterilisasi yaitu :
•Sterilisasi uap (panas lembap)
•Sterilisasi panas kering
•Sterilisasi dengan penyaringan
•Sterilisasi gas
•Sterilisasi dengan radiasi
Pemilihan cara sterilisasi didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan. Cara sterilisasi
yang umum digunakan secara rutin di laboratorium mikrobiologi ialah dengan sterilisasi uap
(panas lembap) dan sterilisasi panas kering.
A. Sterilisasi Uap (Panas Lembap)
Sterilisasi uap menggunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Ini merupakan
metode sterilisasi yang biasa digunakan dalam industri farmasi, karena dapat diprediksi dan
menghasilkan efek dekstruksi bakteri, dan parameter-parameter sterilisasi seperti waktu dan
suhu dapat dengan mudah dikontrol dan monitoring dilakukan sekali dalam satu siklus yang
divalidasi. Metode ini sangat efektif untuk sterilisasi karena menyediakan suhu jauh di atas
titik didih, proses cepat, daya tembus kuat dan kelembaban sangat tinggi sehingga
mempermudah koagulasi protein sel-sel mikroba yang menyebabkan sel hancur. Suhu
efektifnya adalah 121oC pada tekanan 5 kg/cm2 dengan waktu standar 15 menit. Alat yang
digunakan : pressure cooker, autoklaf (autoclave) dan retort.
Sterilisasi panas lembab sangat efektif digunakan meskipun pada suhu yang tidak
begitu tinggi, karena ketika uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan
dilepaskan panas sebesar 686 kalori per gram uap air pada suhu 121oC. Panas ini
mendenaturasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup dan dengan
demikian mematikannya (Amir, 2009).
Prinsip Kerja Autoklaf
Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat & bahan yang
menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 121°C. Suhu dan tekanan tinggi yang
diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar
untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media
digunakan suhu 121°C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan
digunakan suhu 121°C atau 249,8°F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika
digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level)
air mendidih pada suhu 100°C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian
sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 121°C.
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih
dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara
dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam
autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi
dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber
panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak
boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja
dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki
endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial
dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan.
Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka
menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.
Kondisi-kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoklaf dalah
sebagai berikut :
Suhu 111,5°C, waktu 30 menit
Suhu 121,5°C, waktu 20 menit
Suhu 126,5°C, waktu 15 menit
Metode ini biasanya digunakan untuk mensterilisasi:
Larutan dengan pembawa air
Alat-alat gelas
Pembalut untuk bedah
Penutup karet dan plastik
Media untk pekerjaan mikrobiologi
B. Sterilisasi Panas Kering
Beberapa bahan yang tidak dapat disterilkan dengan uap, paling baik disterilkan dengan
panas kering,. Misalnya petrolatum jelly, minyak mineral, lilin, wax, serbuk talk. Karena
panas kering kurang efisien dibanding panas lembab, pemaparan lama dan temperatur tinggi
dibutuhkan. Range luas waktu inaktivasi dalam temperatur bervariasi telah diterapkan
berdasarkan tipe indikator steril yang digunakan, kondisi kelembaban dan faktor lain. Jumlah
air dalam sel mikroba diketahui mempengaruhi resistensinya terhadap destruksi panas
kering(Remington’s Pharmaceutical Sciences 18th : 1471).
Selama pemanasan kering, mikroorganisme dibunuh oleh proses oksidasi. Ini berlawanan
dengan penyebab kematian oleh koagulasi protein pada sel bakteri yang terjadi dengan
sterilisasi uap panas. Pada umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu pemaparan yang
dibutuhkan saat proses dilakukan dengan uap di bawah tekanan. Sterilisasi panas kering
membutuhkan pemaparan pada suhu 150°C sampai 170°C selama 1-4 jam. Alat yang
digunakan pada umumnya adalah oven. Beberapa waktu dan suhu yang umum digunakan
pada oven :
170°C (340 F) sampai 1 jam
160°C (320 F) sampai 2 jam
150°C (300 F) sampai 2,5 jam
140°C (285 F) sampai 3 jam
Karena suhunya yang tinggi sterilisasi panas kering tidak dapat digunakan untuk alat-alat
gelas yang membutuhkan keakuratan. Contoh: alat ukur dan penutup karet atau plastik.
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang
disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan
mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis
mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada
medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber
karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium
yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks
lainnya. (Volk, dan Wheeler,1993 . Mikrobiologi Dasar Jilid 1).
Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang merupakan
substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah
degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus
memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan
faktor tumbuh. (Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)
Berdasarkan konsistensi atau kepadatannya, medium dibagi menjadi tiga jenis, yaitu :
a. Medium cair/broth/liquid medium
Contoh : air pepton, nutrient broth, lactosa
b. Medium setengah padat (semi solid medium)
Contoh : sim agar, cary dan brain agar
c. Medium padat (solid medium)
Contoh : endo agar, PDA, nutrient agar
III. ALAT DAN BAHAN
Alat : Autoclave
Erlenmeyer
Tabung Reaksi
Cawan Petri
Gelas Ukur
Labu takar
Pipet Ukur
Benang Kasur
Alumunium Foil
Kapas
Kain Kasa
Kertas HVS bekas
Gunting
Kertas Label
Bahan : Media ( Nutrient Agar, Nutrient Broth)
IV. PROSEDUR KERJA
Persiapan dan Sterilisasi Alat
Alat-alat yang akan disterilisasi dicuci terlebih dahulu kemudian dikeringkan. Alat-
alat yang mempunyai mulut (tabung reaksi, gelas ukur, labu takar) disumbat menggunakan
kain kasa dan kapas. Penyumbatan dilakukan dengan cara, pertama kain kasa digunting
sehingga berbentuk segiempat (besarnya tergantung mulut alat). Kedua, kapas digulung
hingga berbentuk silinder yang cukup padat lalu kapas dibungkus dengan kain kasa dan diikat
dengan benang kasur. Ketiga, kain kasa yang telah berisi kapas dimasukkan ke dalam mulut
alat (2/3 masuk di bagian mulut alat). Kain kasa yang dimasukkan harus dipastikan menutupi
mulut alat dan tidak ada udara yang masuk. Selanjutnya kapas penutup ditutup lagi dengan
alumunium foil lalu ikat dengan benang kasur agar kuat.
Cawan petri dan Pipet ukur dibungkus seluruhnya dengan kertas HVS bersih.
Selanjutnya, semua alat disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121°-126° C selama
15-20 menit.
Pembuatan dan Sterilisasi Media Larutan Pengencer
Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 10 gr (untuk 2 kelompok) sedangkan
nutrient Broth (NB) sebanyak 3,38 gr (untuk 2 kelompok). Masing-masing media
dimasukkan kedalam erlenmeyer yang sudah diberi tanda sesuai nama nutrient, lalu
ditambahkan akuades, untuk NA sebanyak 500mL dan NB sebanyak 260mL. Selanjutnya
media dipanaskan di atas penangas air sambil diaduk sampai larutan tidak keruh lagi/jernih.
Suhu pemanasan untuk NA T= 300°C sedangkan NB T= 100°C Dinginkan beberapa saat,
kemudian erlenmeyer disumbat dengan kapas dan alumunium foil serta diikat dengan benang
kasur dan diberi etiket (tanggal pembuatan, nama media dan nama pembuat). Kemudian
media disterilisasi menggunakan autoclave. Pengamatan kondisi media dilakukan setelah
2X24 jam.
V. DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN
ALAT KONDISI SETELAH STERILISASI
Tabung ReaksiAlumunium foil yang menutupi mulut tabung masih terbungkus rapih ,
tidak ada sobekan.
Gelas Ukur
Alumunium foil yang menutupi mulut gelas masih terbungkus rapih ,
tidak ada sobekan.
Di dalam gelas ukur 100mL terdapat sisa uap air
Labu UkurAlumunium foil yang menutupi mulut labu masih terbungkus rapih ,
tidak ada sobekan.
Cawan Petri Masih terbungkus rapih oleh kertas, tidak ad sobekan
Pipet Ukur Terdapat robekan pada kertas pembungkus dibagian ujung pipet
MEDIA KONDISI SETELAH STERILISASI
Nutrient Agar Padatan berwarna kuning tua jernih dan tidak terdapat lendir dan jamur
Nutrient Broth Berwarna kuning muda jernih, tidak ada endapan
NA sebelum dipanaskan NA setelah dipanaskan NA setelah disterilisasi (Kuning tua keruh) (Kuning tua jernih) kemudian didiamkan 24jam
NB sebelum dipanaskan NB setelah dipanaskan NB setelah disterilisasi(Kuning muda keruh) (Kuning muda jernih) kemudian didiamkan 24jam
Perhitungan Pembuatan Media
Nutrient AgarDiketahui: 20 gram untuk 1000 mL akuadesDitanya: Berapa gram NA yang diperlukan untuk pembuatan 500 mL?Jawab: Berat diketahui = Volume diketahui
Berat ditanya Volume ditanya
20 gr = 1000 mL X 500 mL
X = 10 gr
Nutrient BrothDiketahui: 13 gram untuk 1000 mL akuadesDitanya: Berapa gram NB yang diperlukan untuk pembuatan 260 mL?Jawab: Berat diketahui = Volume diketahui
Berat ditanya Volume ditanya
13 gr = 1000 mL X 130 mL
X = 3,38 gr
VI. PEMBAHASAN
Dalam praktikum mikrobiologi harus menggunakan alat yang steril. Hal ini bertujuan
agar tidak terjadi kontaminasi terhadap lingkungan luar sehingga di dapat hasil yang
maksimal. Proses membuat peralatan menjadi steril disebut dengan proses sterilisasi. Dimana
sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan seperti medium pertumbuhan mikrobia
ataupun peralatan laboratorium dari semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan
di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi
harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri(Fardiaz,
1992). Dalam proses sterilisasi ada empat cara utama yang dipakai, yaitu dengan pemanasan,
penggunaan bahan kimia, penyaringan (filtrasi), dan radiasi.
Dalam praktikum kali ini proses sterilisasi yang digunakan praktikan adalah dengan
pemanasan. Ada dua metode sterilisasi dengan pemanasan yaitu metode strerilisasi uap dan
sterilisasi panas kering. Praktikan lebih memilih menggunakan metode sterilisasi uap karena
metode ini sangat efektif, menyediakan suhu jauh di atas titik didih, proses cepat, daya
tembus kuat dan kelembaban sangat tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein sel-sel
mikroba yang menyebabkan sel hancur. Prinsip sterilisasi uap adalah menggunakan uap air
sebagai pensterilnya. Karena ketika uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan
dilepaskan panas sebesar 686 kalori per gram uap air pada suhu 121oC. Panas ini
mendenaturasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup dan dengan
demikian mematikannya (Amir, 2009). Alat yang digunakan untuk sterilisasi dengan metode
uap ini adalah autoclave.
Sebelum dimasukkan ke dalam autoclave alat-alat yang memiliki mulut (tabung
reaksi, gelas ukur dan labu ukur) harus disumbat dulu dengan kapas agar tidak ada udara
yang masuk sehingga setelah proses strelisasi selesai , tidak terkontaminasi oleh bakteri dari
udara luar. Selain disumbat dengan kapas ditutupi lagi dengan alumunium foil karena sifat
alumunium yang dapat menahan uap agar tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Untuk
cawan petri dan pipet ukur cukup dibungkus dengan kertas HVS bekas dengan bagian yang
bersih bersentuhan dengan alat. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai
pembungkus karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.
Seharusnya untuk bagian mulut pipet ukur disumbat dengan kapas agar tidak ada udara
masuk. Namun praktikan tidak melakukannya sehingga ketika proses sterilisasi, kertas yang
membungkus pipet ukur sobek, alat terkontaminasi udara dari luar.
Medium pertumbuhan mikrobia adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrien
yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhannya. Dengan menggunakan bahan medium
pertumbuhan, aktivitas mikrobia dapat dipelajari dan dengan menggunakan medium tumbuh
dapat dilakukan isolasi mikrobia menjadi biakan murni. Pada dasarnya bahan-bahan untuk
pertumbuhan medium dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu bahan dasar yang
meliputi air, agar yang bersifat tidak diuraikan oleh mikrobia, gelatin yang merupakan protein
yang dapat diuraikan oleh mikrobia, dan silika gel yaitu bahan yang mengandung natrium
silikat khusus untuk menumbuhkan mikrobia yang bersifat obligat autotrof, unsur-unsur
nutrien yang dapat diambil dari bahan alam, meliputi karbohidrat, lemak dan asam-asam
organik, sumber nitrogen yang mencakup pepton dan protein, garam-garam kimia (K, Na, Fe
dan Mg), vitamin, dan sari buah, ekstrak sayuran dan susu. Serta bahan-bahan tambahan yaitu
bahan yang sengaja ditambahkan ke dalam medium dengan tujuan tertentu seperti indikator
maupun antibiotik. Untuk hasil yang lebih baik agar bakteri tumbuh media yang digunakan
disterilkan terlebih dahulu (Syamsir, 2008).
Dalam praktikum kali ini percobaan yang dilakukan adalah pembuatan media Nutrient
Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB). NA adalah medium padat yang memiliki komposisi
yang berasal dari bahan olahan seperti beef extract dan peptone sehingga nutrisi yang
dimilikinya banyak. NB adalah media cair yang digunakan untuk menanam bakteri
(mikroorganisme). Komponen nutrisi dari NB adalah ekstrak daging, ekstrak ragi, pepton dan
sodium klorida.
Dalam praktikum kali ini untuk pembuatan media NA digunakan 10 gr NA bubuk
yang kemudian di larutkan dengan aquadest sebanyak 500 ml. Kedua bahan tersebut
dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, dipanaskan sekaligus dilakukan penghomogenan larutan
di atas penangas air dengan stirrer magnetic. Setelah dipanaskan media dibagi dua untuk
kelompok lain. Kemudian dilakukan sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC tekanan 1-
2 atm. Selanjutnya didiamkan 2x24 jam didapatkan medium padatan NA sebanyak 250 ml
dengan warna kuning tua jernih dan tidak terdapat lendir dan jamur yang mengindikasikan
bahwa media telah steril dan tidak terkontaminasi bakteri.
Sama halnya dengan NA, saat pembuatan medium NB digunakan 3,38 gr bubuk NB
yang dicampurkan dengan aquadest sebanyak 260 ml. Kedua bahan tersebut dimasukkan ke
dalam Erlenmeyer, dipanaskan sekaligus dilakukan penghomogenan larutan di atas penangas
air dengan stirrer magnetic. Setelah mendidih dan homogen larutan dibagi dua kembali,
kemudian dilakukan sterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC tekanan 1-2 atm Setelah
didiamkan selama 2x24 jam didapatkan hasil medium NB dengan berwarna kuning muda
jernih dan tidak ada endapan ini juga mengindikasikan bahwa media telah steril dan tidak
terkontaminasi.
VII. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan:
Proses sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan seperti medium pertumbuhan
mikrobia ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk kehidupan.
Sumbat atau pembungkus alat yang rusak setelah proses sterilisasi menandakan bahwa
alat tidak steril karena telah terkontaminasi udara dari luar.
Pipet ukur sudah tidak steril karena terkontaminasi udara luar.
Medium yang dibuat yaitu Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB) steril dan tidak
terkontaminasi dari segala bentuk kehidupan (bakteri).
DAFTAR PUSTAKA
A.R. Gennaro. 1990. Remington’s Pharmaceutical Sciences 18 th Edition. Pennsylvania :
Mack Publishing Company.
Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Jakarta: Erlangga
Pelczar,Jr.et al.1986. Dasar-Dasar Mirobiologi. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia
Amir. 2008. Pengendalian Mikroorganisme.
http://rachdie.blogsome.com/2006/10/14/pengendalian-mikroorganisme/
Syamsir, Elvira. 2008. Prinsip Sterilisasi Komersial Produk Pangan.
http://id.shvoong.com/exact-sciences/
Aisyah. 2009. Metode Sterilisasi
http://rgmaisyah.wordpress.com/2009/03/15/metode-sterilisasi/
Caray. 2008. Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi
http://makalahdanskripsi.blogspot.com/2008/08/pembuatan-media-agar-dan-
sterilisasi.html
Marnala. 2009. Sterilisasi Media dan Alat
http://www.marnala.co.cc/2009/07/sterilisasi-media-dan-alat.html
Ahyari, Jimmy. 2008. Pembuatan Media dan Sterilisasi
http://blogkita.info/pembuatan-media-n-sterilisasi/
Farmasi. 2010. Pembuatan Medium Mikroba
http://farmasiblogku.blogspot.com/2010/10/pembuatan-medium-mikroba.html