LAPORAN PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)
Transcript of LAPORAN PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)
ii
LAPORAN
PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM B-GALAKTOSIDASE BAKTERI ASAM
LAKTAT DARI FERMENTASI BUAH SIRSAK (ANNONA MURICATA. L)
Tim Pengusul
Fitri Yuniarti, M.Si. (0318068504)
Wahyu Hidayati, S.Si., M. Biomed (0308108202)
PROGRAM STUDI S1-FARMASI
FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA
TAHUN 2020
3
LEMBAR PENGESAHAN
PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)
Judul Penelitian
Isolasi dan Uji Aktivitas Enzim B-Galaktosidase Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi
Buah Sirsak (Annona Muricata L.)
Jenis Penelitian : PENELITIAN DASAR KEILMUAN (PDK)
Ketua Peneliti : Fitri Yuniarti, M. Si Link Profil simakip : http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/690
Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978
Fakultas : Fakultas Farmasi dan Sains
Anggota Peneliti : Wahyu Hidayati, S.Si., M. Biomed
Link Profil simakip : http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/1008 Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978
Anggota Peneliti :-
Link Profil simakip :- Contoh link: http://simakip.uhamka.ac.id/pengguna/show/978
Waktu Penelitian : 6 Bulan
Luaran Penelitian :
Luaran Wajib : Jurnal Kimia Sains Dan Aplikasi-Jurnal Nasional Terakreditasi Sinta 2
Status Luaran Wajib : In Review
Luaran Tambahan : Prosiding Seminar Nasional
Status Luaran Tambahan: Submitted
Mengetahui, Jakarta, 5 Mei 2020
Ketua Program Studi Ketua Peneliti
Kori Yati, M.Farm., Apt Fitri Yuniarti, M.Si
NIDN. 0324067802 NIDN.0318068504
Menyetujui,
Dekan Fakultas Farmasi dan Sains Ketua Lemlitbang UHAMKA
Dr. Hadi Sunaryo, M.Si., Apt Prof. Dr. Suswandari, M.Pd
NIDN.0325067201 NIDN. 0020116601
v
vi
vii
ABSTRAK Bakteri asam laktat memiliki kemampuan dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase yang
berguna untuk penderita intoleransi laktosa. Salah satu sumber penghasil bakteri asam laktat
adalah buah sirsak (Annona Muricata L) dengan kandungan glukosa yang cukup tinggi yang
berguna untuk pertumbuhan bakteri asam laktat, terutama pada proses fermentasi buah sirsak.
Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak yang
memiliki aktivitas enzim β-galaktosidase. Produksi enzim β-galaktosidase menggunakan metode
sonikasi. Uji aktivitas enzim dilakukan dengan melihat kemampuan enzim β- Galaktosidase
dalam menguraikan laktosa menjadi monosakarida. Penelitian ini di awali dengan isolasi BAL
dari fermentasi buah sirsak, kemudian dilakukan karakterisasi Bakteri Asam Laktat secara
makroskopis dan mikroskopis. Isolat BAL terpilih dari hasil karakterisasi dilakukan pengukuran
aktivitas enzim menggunakan spektrofotometer visible dengan substrat o-nitrophenyl-β-D-
galactopyranoside (ONPG) dan dilanjutkan uji kadar protein dengan metode Bradford. Hasil
isolasi didapatkan 6 isolat BAL dengan morfologi terbaik. Isolat SM6 memiliki nilai aktivitas enzim
tertinggi yaitu 0,292 U/ml dengan kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Dari data diatas dapat
disimpulkan bahwa buah sirsak mengandung bakteri asam lakat yang berpotensi sebagai penghasil
enzim β-galaktosidase.
Kata Kunci: Bakteri Asam Laktat, fermentasi, enzim β-galaktosidase, buah sirsak
(Annona Muricata. L)
DAFTAR ISI
Halaman Pengesahan ............................................................................ ii
Surat Perjanjian Kontrak ....................................................................... iii
Abstrak .................................................................................................. v
Daftar Isi ................................................................................................ vi
Bab 1. Pendahuluan ............................................................................... 1
Bab 2. Tinjauan Pustaka ....................................................................... .4
Bab 3. Metodologi Penelitian ............................................................... .9
Bab 4. Hasil dan Pembahasan .............................................................. 13
Bab 5. Simpulan dan Saran……………………………………………21
Bab 6. Luaran Yang dicapai…………………………………………..22
Bab 7. Rencana Tindak Lanjut Dan Proyeksi Hilirisasi………………23
Daftar Pustaka ...................................................................................... 24
Lampiran-lampiran……………………………………………...….…28
iv
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Daging buah sirsak sebelum dan setelah fermentasi ................. .… 14
Tabel 2. Hasil isolasi bakteri asam laktat pada fermentasi buah sirsak ... ….14
Tabel 3. Hasil karakterisasi isolate bakteri asam laktat…………………… 16
Tabel 4. Hasil produksi Enzim β-Galaktosidase…… .............................. … 17
Tabel 5. Rerata aktivitas enzim β-Galaktosidase ……………………….…18
Tabel 6. Rerata kadar protein enzim β-Galaktosidase ………….………...…..20
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hidrolisis Laktosa oleh Enzim β-Galaktosidase…………..…….…. 5
1
BAB I
PENDAHULUAN
1. Latar Belakang
Tanaman sirsak (Annona muricata L.) merupakan komoditas hasil pertanian yang
banyak ditanam di Indonesia. Kandungan karbohidrat yang tinggi pada buah sirsak
merupakan sumber yang potensial untuk mendapatkan bakteri asam laktat. Salah satu
jenis karbohidrat pada buah sirsak adalah gula pereduksi (glukosa dan fruktosa), yang
merupakan sumber karbon utama bagi mikroorganisme dalam proses fermentasi
(Diniyah dkk. 2013). Menurut Buckle (1987), fermentasi asam laktat terjadi karena
adanya aktivitas bakteri asam laktat yang mengubah glukosa menjadi asam laktat,
sehingga jumlah bakteri asam laktat meningkat selama proses fermentasi berlangsung
yang akan diikuti dengan penurunan pH. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri
Gram-positif yang mengeksresikan asam laktat sebagai produk akhir fermentasi yang
berperan sebagai preservasi bahan makanan (Schnurer dan Magnusson 2005).
Kelompok bakteri asam laktat merupakan salah satu kelompok bakteri yang
mempunyai enzim-enzim β-galaktosidase dan laktat dehidrogenase (Surono 2004).
Enzim β- galaktosidase merupakan enzim yang menghidrolisis laktosa menjadi
glukosa dan galaktosa dengan memutus ikatan β-galaktosida pada ujung nonreduksi β-
D-galaktosa (Gary dan Kindell 2005). Secara alamiah, enzim β- galaktosidase
(laktase) terdapat pada usus halus manusia (Campbell et al. 2005). Kekurangan laktase
sementara pada individu dengan kadar β- galaktosidase normal juga dapat diakibatkan
oleh kerusakan pada lapisan usus yang disebabkan oleh infeksi virus atau bakteri,
kemoterapi kanker, kondisi alergi atau autoimun dan penurunan β- galaktosidase yang
terkait dengan penuaan (Sinuhaji 2006).
Enzim β-galaktosidase digunakan untuk menghidrolisis susu laktosa untuk
mengatasi masalah intoleransi laktosa oleh individu yang kekurangan laktase
(Artolozaga et al. 1998). Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim ß-galaktosidase yang rendah (Marsh dan
Riley 1998). Laktosa tidak mudah diserap, tetapi harus dihidrolisis oleh laktase (β-
galaktosidase) menjadi monosakarida (mudah diserap usus). Jika laktosa tidak dapat
dihidrolisis oleh β-galaktosidase, akan timbul gejala sakit perut, mulas, kejang perut,
pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). Untuk mengurangi masalah tersebut
2
penderita lactose intolerance dapat mengkonsumsi suplemen β- galaktosidase atau
dengan mengkonsumsi susu rendah laktosa. Karena semakin meningkatnya penderita
intoleransi laktosa pada saat ini, oleh karena itu perlu dilakukan penelitian dan
ditemukan sumber-sumber baru penghasil enzim ß-galaktosidase yang terdapat dialam
yang nantinya bisa digunakan sebagai produk atau suplemen kesehatan bagi penderita
intoleransi laktosa.
Secara luas, enzim β-galaktosidase dapat diperoleh dari beberapa sumber antara
lain mikroorganisme, tanaman, dan hewan (Grosova et al. 2008). Enzim β-galaktosidase
juga dapat diisolasi dari ragi kelompok Kluyveromyces sp. dan fungi kelompok
Aspergillus sp. (Harti 2015). Dibandingkan dengan sumber tanaman dan hewan, enzim
yang diisolasi dari mikroorganisme lebih mudah dipisahkan dan dimurnikan setelah
disekresikan ke dalam media pertumbuhan mikroorganisme (Radji 2009). Informasi
mengenai BAL yang diisolasi dari fermentasi buah dan sayur telah banyak
dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah
sirsak (Annona muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014) yang
telah berhasil mengisolasi 7 isolat BAL. Namun, isolasi BAL yang berpotensi
penghasil enzim β-galaktosidase pada fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.)
belum pernah dilakukan. Mengingat banyaknya manfaat dari BAL dan enzim ß-
galaktosidase terhadap kesehatan maka perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang
isolasi BAL penghasil enzim β-galaktosidase dari fermentasi buah sirsak (Annona
muricata L.).
2 Rumusan Masalah
Berdasarkan hal yang telah di uraikan di latar belakang, diketahui bahwa fermentasi
buah sirsak mengandung bakteri asam laktat serta adanya kemampuan bakteri asam
laktat dari produk fermentasi yang mampu menghasilkan enzim β-Galaktosidase.
Adanya informasi tersebut, maka perlu dilakukan penelitian untuk mendapatkan isolat
BAL yang memiliki kemampuan dalam menghasilkan enzim β-Galaktosidase dari
fermentasi buah sirsak.
3 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri asam laktat
penghasil enzim β-galaktosidase dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.)
3
disertai pengukuran aktivitas enzim β-galaktosidase. Informasi ini selanjutnya akan di
publikasikan dalam bentuk jurnal ilmiah.
4 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini yaitu diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah
mengenai bakteri asam laktat yang dapat menghasilkan enzim β-galaktosidase yang
diisolasi dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.). Dengan demikian dapat
diaplikasikan sebagai probiotik maupun produk farmasi untuk penderita lactose
intolerance.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
1. Sirsak
Deskripsi Tanaman
Sirsak merupakan tanaman buah yang tumbuh dengan baik di daerah tropis lembab.
Tanaman ini dapat tumbuh di dataran rendah sampai daerah berketinggian 500 meter
dari permukaan laut (mdpl), beriklim basah sampai kering, bersuhu 22-28oC,
kelembaban udara (RH) 60-80%, dan curah hujan berkisar antara 1.500-2.500 mm per
tahun (Zuhud 2011).Sirsak merupakan tanaman dengan tinggi pohon sekitar 8 meter.
Batang coklat berkayu, bulat, bercabang. Mempunyai daun bebentuk telur atau lanset,
ujung runcing, tepi rata, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang tangkai 5
mm, hijau kekuningan. (Syamsu hidayat dan Hutapea 1991). Buah sirsak mengandung
protein, kalsium, fosfor, vitamin A, dan vitamin C. Batang dan daun kaya akan tannin,
fitosterol, kalsium oksalat, serta alkaloid mirisine. Anggota famili Annonaceae itu
bersifat manis (buah masak). Faedahnya sebagai astrigen (daun dan buah mentah),
antibakteri dan antikejang.
2. Fermentasi
Fermentasi adalah perubahan glukosa secara anaerob yang meliputi glikolisis dan
pembentukan NAD. Fermentasi menghasilkan jumlah energi yang relatif lebih sedikit
daripada energi yang dihasilkan melalui respirasi secara normal. Fermentasi dibedakan
menjadi dua tipe reaksi, yaitu fermentasi alcohol dan fermentasi asam laktat. Proses
fermentasi asam laktat adalah proses fermentasi glukosa yang menghasilkan asam
laktat. Proses fermentasi asam laktat dimulai dengan proses glikolisis yang
menghasilkan asam piruvat, kemudian proses ini dilanjutkan dengan perubahan asam
piruvat menjadi asam laktat. Dalam proses fermentasi asam laktat, asam piruvat
bereaksi secara langsung dengan NADH membentuk asam laktat. Hasil dari
fermentasi, setiap molekul glukosa akan menghasilkan 2 molekul ATP. Sementara itu,
dari respirasi aerobik akan dihasilkan 36 molekul ATP (Karmana 2008).
3. Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat adalah kelompok bakteri yang mampu mengubah karbohidrat
menjadi asam laktat. Bakteri yang memproduksi asam laktat termasuk ke dalam
5
golongan bakteri Gram positif, sebagian besar bersifat katalase negatif, tidak
membentuk spora, berbentuk batang. Golongan bakteri asam laktat ini dapat tumbuh
dengan atau tanpa oksigen (Casida 1968). Kelompok bakteri asam laktat terdiri dari
famili Micrococcaceae yaitu spesies dari genus Micrococcus dan Staphylococcus,
famili Lactobacillaceae yaitu spesies dari genus Lactobacillus dan bakteri yang
termasuk dalam famili Streptococcaceae, yaitu spesies dari genus Leuconostoc,
Streptococcus, Pediococcus dan Aerococcus (Fardiaz 1992). Bakteri asam laktat
(BAL) merupakan bakteri mampu hidup pada berbagai habitat yang cukup luas di
alam seperti pada tanaman, saluran pencernaan hewan dan manusia, pada produk
makanan kalengan, produk susu, produk fermentasi, buah- buahan dan sayur-sayuran
tropis (Misgiyarti dan Widowati 2005). BAL ini dapat digolongkan menjadi 2
golongan yaitu golongan bakteri homofermentatif dan bakteri heterofermentatif
(Soeharsono 2010).
4. Enzim β-Galaktosidase
Enzim β-galaktosidase adalah golongan enzim yang dapat menghidrolisis residu
ikatan β- galaktosa dari berbagai senyawa dan biasanya digunakan untuk
menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Nama sistematiknya adalah ß-
D-galaktosida galaktohidrolase. Enzim ini mempunyai nama lain laktase. Enzim ini
bersifat intraseluler pada bakteri dan yeast tetapi bersifat ekstraseluler pada fungi
(IUBMB Enzyme Nomenclature 1980). Cara kerja enzim ini adalah menghidrolisa
ikatan ß-(1,4)-glikosida pada laktosa (Gambar 1.). Penggunaan enzim ß- galaktosidase
dalam proses hidrolisa ini mempunyai kekurangan di mana hidrolisa laktosa secara
keseluruhan tidak mungkin terjadi karena enzim dihambat oleh terbentuknya
galaktosa di dalam reaksi hidrolisis (Boyer 2002).
Menurut Tryland dan Fiskdal (1997), ß-galaktosidase dapat dihasilkan oleh
bakteri Gram negatif (Enterobacteriaceae, Vibrinoceae, Pseudomonaceae dan
Neisseriaceae), bakteri Gram positif (Lactobacteriaceae, Streptococcaceae), yeast
dan fungi. Enzim ß-galaktosidase yang dihasilkan oleh yeast (Kluyveromyces fragilis
dan Kluyveromyces lactis) bersifat aktif pada pH tinggi sedangkan yang berasal dari
fungi (Aspergillus oryzae dan Aspergillus niger) bersifat aktif pada pH rendah. Enzim
ß-galaktosidase yang berasal dari fungi mempunyai pH optimum 5 dan suhu optimum
50oC, sedangkan yang berasal dari yeast mempunyai pH optimum 6 dan suhu
6
optimum 37oC. Enzim ß-galaktosidase dari bakteri mempunyai pH optimum 7 dengan
suhu optimum 37oC (Aurand 1987).
Gambar 1. Hidrolisis Laktosa oleh Enzim β-Galaktosidase
5. Isolasi Bakteri
Isolasi merupakan suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme dari sampel
atau alam dan menumbuhkan dalam media kultur secara in vitro sehingga diperoleh
biakan murni (Harti 2015). Dalam mengisolasi bakteri menjadi biakan murni perlu
dilakukan secara aseptik agar terhindar dari kontaminasi mikroorganisme lain. Teknik
aseptik merupakan suatu cara untuk mengkulturkan mikroorganisme dengan
menggunakan alat, bahan atau metode secara mikrobiologis. Dengan adanya teknik
aseptis. maka dapat mencegah tercemarnya biakan murni dan melindungi diri dari
infeksi akibat masuknya mikroorganisme yang tidak dikehendaki (Harti 2015).
6. Uji aktivitas Enzim β-galaktosidase
Pengujian aktivitas enzim β-galaktosidase dilakukan menggunakan substrat O-
Nitrophenyl-β- D-Galactopyranoside (ONPG). Satu unit aktivitas β-galaktosidase
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 μmol O-
Nitrophenol (ONP) dari subsrat ONPG per menit pada kondisi perlakuan (Khusniati
dkk. 2015). Aktivitas enzim β- galaktosidase dinyatakan dalam unit (U/ml) dan dapat
dihitung dengan rumus berikut :
"Aktivitas (U/ml) = mikromol ONP /V x t ……………………………….(1)
Keterangan :
Mikromol ONP = Jumlah ONP saat percobaan
V = Volume enzim yang diuji (0,1 ml)
t = Waktu Inkubasi (menit)
7
Senyawa ONPG merupakan senyawa yang tidak berwarna dan berfungsi untuk
mendeteksi aktivitas β-galaktosidase. Adanya aktivitas β-galaktosidase menyebabkan
terjadinya reaksi hidrolisis ONPG menjadi dua senyawa, yaitu galaktosa dan ONP.
7. Uji Kadar Protein (Bradford Method)
Pengukuran kadar suatu enzim dapat diujikan dengan menggunakan metode
Bradford. Metode Bradford merupakan suatu metode pengukuran konsentrasi protein
total secara kolorimetri dalam suatu larutan. Metode ini didasarkan pada pengikatan
antara pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250 yang terdapat dalam reagen Bradford
dengan protein pada sampel larutan dalam suasana asam sehingga menghasilkan
kompleks bewarna biru. Kedua interaksi bersifat hidrofobik dan menstabilkan ion
bentuk anionik pewarna yang menyebabkan perubahan warna terlihat. Dengan
demikian, secara kolorimetri dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometri pada panjang gelombang 465‐595 nm (Purwanto 2006).
Pereaksi Bradford bereaksi terutama dengan residu arginin, dan sedikit bereaksi
dengan histidin, lisin, tirosin, triptofan, dan residu fenilalanin. Uji Bradford agak
sensitif terhadap albumin serum sapi, dua kali lebih dari rata-rata protein secara umum
(Bintang 2010). Pengujian kadar protein dengan metode Bradford merupakan
pengujian yang cukup akurat karena sampel yang berada di luar jangkauan dapat diuji
ulang dalam beberapa menit sehingga uji ini konstan pada rentang konsentrasi 10 kali
lipat. Selain itu, pengujian ini bersifat sensitif, selektif dan juga cukup stabil terhadap
keberadaan surfaktan sebagai pengotor (Purwanto 2006).
State Of The Art
Bakteri asam laktat merupakan salah satu kelompok bakteri yang mempunyai
enzim-enzim β-galaktosidase dan laktat dehidrogenase (Surono 2004). Enzim β-
galaktosidase digunakan untuk menghidrolisis susu laktosa untuk mengatasi masalah
intoleransi laktosa oleh individu yang kekurangan laktase (Artolozaga et al. 1998).
Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan
galaktosa karena enzim ß-galaktosidase yang rendah (Marsh dan Riley 1998). Jika
laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase, akan timbul gejala sakit perut,
mulas, kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). Semakin
meningkatnya penderita intoleransi laktosa pada saat ini, mendorong untuk dilakukan
penelitian dan penemuan sumber-sumber baru penghasil enzim ß-galaktosidase yang
8
terdapat dialam yang nantinya bisa digunakan sebagai produk atau suplemen
kesehatan bagi penderita intoleransi laktosa.
Secara luas, enzim β-galaktosidase dapat diperoleh dari beberapa sumber antara
lain mikroorganisme, tanaman, dan hewan (Grosova et al. 2008). Dibandingkan
dengan sumber tanaman dan hewan, enzim yang diisolasi dari mikroorganisme lebih
mudah dipisahkan dan dimurnikan setelah disekresikan ke dalam media pertumbuhan
mikroorganisme (Radji 2009). Informasi mengenai BAL yang diisolasi dari
fermentasi buah dan sayur telah banyak dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi
bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) dan penentuan
aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014) yang telah berhasil mengisolasi 7 isolat BAL.
Isolasi BAL yang berpotensi penghasil enzim β-galaktosidase dari fermentasi
buah sirsak (Annona muricata L.) belum pernah dilakukan. Isolasi BAL dari Produk
atau tanaman fermentasi memiliki keunggulan dimana BAL yang dihasilkan memiliki
kualitas yang lebih baik dan jumlah isolat yang di dapat juga lebih banyak, hal ini
disebabkan terjadinya optimalisasi reaksi enzimatis pada proses fermentasi (Fardiaz
1992). Mengingat banyaknya manfaat dan peranan yang dihasilkan oleh Bakteri Asam
Laktat (BAL) dan enzim ß-galaktosidase terhadap kesehatan, maka perlu dilakukan
penelitian lanjutan tentang produksi enzim ß-galaktosidase Bakteri Asam Laktat yang
berasal dari fermentasi buah/tanaman asli lokal seperti fermentasi buah sirsak (Annona
muricata L.)
RoadMap Penelitian
9
BAB III
METODE PENELITIAN
Rancangan Penelitian
A. Lokasi penelitian : Di Laboratorium Mikrobiologi, Laboratorium Bioteknologi,
dan Laboratorium Kimia Terpadu Fakultas Farmasi dan Sains Universitas
Muhammadiyah Prof. DR. Hamka dan Laboratorium Riset Oral Biologi Fakultas
Kedokteran Gigi Universitas Indonesia.
B. Desain Penelitian : Desain Yang digunakan adalah desain eksperimental secara
kualitatif
C. Sampel Penelitian: Sampel Penelitian berupa Buah Sirsak yang sudah matang
D. Cara Kerja
1. Persiapan dan pengambilan sampel
Persiapan awal yaitu terdiri dari menyiapkan alat dan bahan serta pembuatan
media. Alat- alat gelas di sterilisasi dalam oven suhu 1600C, medium yang telah di
siapkan di sterilisasi dalam autoklaf suhu 1210C, laminar air flow di sterilkan
menggunakan etanol 70%. Bahan yang digunakan sebagai sampel uji adalah Sirsak
Fermentasi kubis
sebagai sumber
isolat BAL
Isolat BAL yang
memiliki kemampuan
dalam menghasilkan
enzim β Galaktosidase
yang bermanfaat bagi
penderita intoleransi
laktosa
Isolasi BAL Dan
karakterisasi
morfologi
1
Produksi enzim
β Galaktosidase
Penentuan kadar
protein enzim β
Galaktosidase
Uji aktivitas
enzim β
Galaktosidase
4
3
2
10
(Annona Muricata L.). Sirsak terlebih dahulu dideterminasi di Pusat Penelitian Biologi
LIPI Cibinong.
2. Fermentasi Buah Sirsak
Pada tahap fermentasi, isi buah dikeluarkan dan dibungkus dengan daun pisang
steril, ditempatkan dalam wadah fermentasi dan dikondisikan agar udara tidak masuk.
Fermentasi dilakukan pada suhu ruang selama 72 jam (Sari 2013).
3. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Buah Sirsak
Hasil fermentasi ditimbang sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam 45 mL MRSB,
lalu dihomogenkan sehingga didapatkan pengenceran 10-1. Kemudian diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah inkubasi, sampel diencerkan menggunakan
media pepton water hingga pengenceran 10-9. Dari pengenceran 10-9, diambil 100 µl
sampel dan ditanam dengan metode sebar pada cawan petri yang telah berisi media
MRS Agar, kemudian diratakan dengan drugalsky yang sebelumnya disterilkan
dengan alkohol dan dibakar dengan bunsen lalu diangin- anginkan. Inokulum
disimpan dalam anaerob jar kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 48 jam pada
suhu 37ºC dan dilakukan pengkodean petridish dengan menandai masing-masing
petridish.
Setelah 48 jam, single colony yang mencirikan BAL yaitu bulat licin berwarna
putih dipindahkan ke media MRS Agar untuk pemurnian koloni dengan metode streak
yaitu dengan menggunakan jarum ose kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu
37ºC (Purwati et al. 2005).
4. Karakterisasi Bakteri
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dilakukan dengan identifikasi morfologi
bakteri asam laktat secara makroskopik dan mikroskopik.
5. Produksi Enzim β-galaktosidase
Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari MRSA slant dipindahkan ke dalam media
produksi yang sudah disterilisasi (MRSB dengan kandungan laktosa 1% dan pH
medium: 8). Kemudian media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Sel dipanen
dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu
4°C. Peletnya dicuci sebanyak dua kali dengan buffer fosfat 0,1 M pH 7. Kemudian
pemecahan sel dengan sonikator selama 5 menit pada suhu 4°C. Suspensi sel
11
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Supernatan
yang diperoleh merupakan enzim β-galaktosidase kasar (Fazriyani 2015).
6. Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase
Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan menggunakan 1000 μl buffer fosfat
0,1 M pH 7 dan 100 μl enzim β-galaktosidase dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Larutan yang sudah diinkubasi kemudian
ditambahkan 200 μl ONPG 4 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit.
Pada menit ke-15, larutan ditambahkan 1000 μl Na2CO3 1 M. Selanjutnya, larutan
dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ 420 (Khusniati dkk.
2015).
7. Uji Kadar Protein
Sebanyak 20 µl enzim β-galaktosidase ditambahkan 1 ml larutan Bradford.
Larutan dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada
λ 595 nm. Nilai absorbansi yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam kurva
standar BSA untuk menentukan kadar protein yang terkandung dalam sampel enzim
β-galaktosidase (Bradford 1976).
E. Indikator pencapaian hasil penelitian
Indikator pencapaian hasil penelitian yaitu dengan mendapatkan isolate BAL
yang menghasilkan enzim β-galaktosidase ditandai dengan adanya aktivitas enzim β-
galaktosidase dalam menghidrolisis Substrat ONPG menjadi ONP. Atau dapat juga
dikatakan bahwa satu unit aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan dalam
banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol ONP dari subtrat
ONPG per menit. Dengan adanya aktivitas enzim β- galaktosidase ini dapat
disimpulkan bahwa BAL yang berasal dari fermentasi buah sirsak memiliki atau dapat
menghasilkan enzim β-galaktosidase.
F. Diagram Alir Penelitian
12
G. Fishbond Penelitian
3
4
5
6
7
Persiapan dan
pengambilan
sampel
Uji kadar
protein enzim
dg metode
bradford
Fermentasi
sirsak dan
isolasi bakteri
asam laktat
Identifikasi
morfologi BAL
Uji aktivitas
enzim dengan
spektro UV Vis
Produksi enzim
b galaktosidase
Isolate BAL yang dapat
menghasilkan enzim
B galaktosidase
13
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi
Hasil determinasi yang diperoleh di Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia Cibinong menyatakan bahwa sampel yang diperoleh dari Pasar
Klender, Jakarta Timur adalah benar buah sirsak (Annona muricata L.).
B. Fermentasi Buah Sirsak
Pada tahap awal proses fermentasi, daging buah sirsak dibungkus dengan daun
pisang dan disimpan dalam wadah fermentasi selama 72 jam secara anaerob karena
bakteri asam laktat bersifat anaerob fakultatif. Sirsak yang digunakan adalah sirsak yang
telah matang dengan ciri-ciri duri sirsak tidak tajam lagi, dipegang terasa empuk dan
kulit sirsak berubah menjadi hijau buram. Daging buah sirsak diambil menggunakan
pinset yang sudah steril lalu dibungkus dengan daun pisang karena daun pisang dapat
menghalangi cahaya yang masuk, hal itu merupakan salah satu syarat untuk terjadinya
fermentasi (Suprapti 2003). Kandungan polifenol pada daun pisang juga dapat
menghambat pertumbuhan bakteri lain dan akan lebih memaksimalkan proses
fermentasi. Proses fermentasi ini dilakukan dengan tujuan untuk meningkatkan jumlah
bakteri asam laktat yang tumbuh secara spontan karena adanya nutrisi untuk
pertumbuhan bakteri asam laktat yang terkandung dalam buah sirsak terutama
karbohidrat berupa glukosa, fruktosa atau sukrosa (Utami 2011). Karbohidrat tersebut
akan terurai menjadi senyawa-senyawa sederhana seperti asam laktat, asam asetat, asam
propionat dan etil alkohol (Sari 2013).
Hasil fermentasi setelah 72 jam menunjukkan terjadinya perubahan pH dari sebelum
dan sesudah fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) yaitu dari pH 5 menjadi 4
(Tabel 1.). Terjadinya perubahan pH ini disebabkan karena peningkatan jumlah mikroba
penghasil asam sehingga terjadi proses oksidasi anaerobik pada saat fermentasi yang
menghasilkan alkohol serta beberapa senyawa asam (Sari 2013). Proses fermentasi juga
memberikan perubahan secara organoleptis terhadap buah sirsak seperti warna, rasa,
bau dan serat sirsak. Buah sirsak yang telah difermentasi akan menghasilkan perubahan
warna dari putih menjadi putih kekuningan, dengan rasa dan bau seperti tape namun
khas sirsak. Sebelum fermentasi, daging buah sirsak terlihat lebih berserat namun
setelah proses fermentasi teksturnya terasa lebih lunak (Tabel 1.). Peningkatan jumlah
14
bakteri asam laktat selama fermentasi menunjukkan terjadinya seleksi pertumbuhan
yang dapat disebabkan karena terjadi perubahan kondisi pada saat fermentasi.
C. Isolasi Bakteri Asam Laktat
Pada tahap awal isolasi bakteri asam laktat, buah sirsak yang telah difermentasi
dimasukkan ke dalam medium MRSB dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
Hasil inkubasi menunjukkan terjadinya kekeruhan pada media dari kondisi sebelumnya
yang bewarna coklat jernih. Perubahan kekeruhan ini terjadi akibat pertumbuhan bakteri
asam laktat dan peningkatan senyawa asam laktat yang dihasilkan oleh bakteri tersebut
yang diekskresikan keluar sel, sehingga terakumulasi dalam cairan fermentasi yang
akhirnya menyebabkan terbentuknya endapan (Sari 2013). Dalam melakukan isolasi
dilakukan beberapa proses sampai didapatkan kultur murni isolat bakteri asam laktat.
Proses yang dilakukan meliputi pengenceran dengan rentang pengenceran 10-1 sampai
10-9. Hal ini bertujuan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang
tersuspensi dalam cairan. Larutan pengenceran yang digunakan adalah pepton water
yang berguna sebagai sumber karbon nitrogen dan vitamin untuk pertumbuhan dan
perkembangan bakteri dalam menghasilkan enzim yang diharapkan (Prihantini 2013).
15
Hasil pengenceran yang ditanamkan ke medium MRSA dalam cawan petri hanya
hasil pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyaknya koloni yang terdapat
dalam hasil pengenceran 10-1 sampai 10-6. Medium MRSA merupakan medium selektif
untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Teknik isolasi dilakukan dengan menggunakan
metode sebar agar koloni yang tumbuh dapat tersebar secara merata pada bagian
permukaan agar, sehingga memudahkan dalam pengambilan koloni bakteri. Suspensi
bakteri yang telah disebar kemudian diinkubasi pada suhu 37oC yang merupakan suhu
optimum untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Setelah inkubasi selama 48 jam,
didapatkan jumlah koloni pada hasil sebar pengenceran 10-9 sebanyak 2 koloni
sehingga kedua koloni tunggal tersebut yang diambil untuk proses pemurnian. Hasil
sebar pada pengenceran 10-8 didapatkan 5 koloni, namun hanya 3 koloni tunggal terbaik
yang diambil sedangkan hasil sebar pada pengenceran 10-7 diambil 1 koloni tunggal
terbaik dari 52 koloni yang tumbuh.
Pemilihan koloni tunggal berdasarkan bentuk morfologi terbaik yang mencirikan
koloni BAL yaitu bulat, cembung, licin, dan bewarna putih susu. Keenam koloni
tunggal yang diambil harus dilakukan pemurnian terlebih dahulu untuk mendapatkan
isolat bakteri asam laktat yang murni dengan menggunakan metode gores kuadran
karena metode tersebut lebih mudah untuk mendapatkan koloni tunggal dibandingkan
metode gores lainnya. Isolat bakteri asam laktat yang telah murni disimpan sebagai stok
pada medium MRSA slant dalam tabung reaksi dan diberikan kode isolat SM1 yang
berasal dari pengenceran 10-7. Kode isolat SM2, SM3 dan SM4 berasal dari
pengenceran 10-8 dan isolat yang berasal dari pengenceran 10-9 diberi kode isolat SM5
dan SM6. Stok isolat disimpan untuk pengujian ke tahap selanjutnya.
D. Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Isolat bakteri asam laktat yang telah murni selanjutnya dilakukan pengujian
karakterisasi. Uji karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan dengan 2 cara yaitu
identifikasi makroskopik dan mikroskopik. Pada identifikasi makroskopik, koloni
bakteri yang tumbuh diamati warna, bentuk, tepian dan elevasi dari koloni. Koloni
bakteri asam laktat yang diamati morfologinya adalah koloni yang tumbuh pada
medium MRSA dalam cawan petri.
16
Berdasarkan data pada Tabel 3 diketahui keenam isolat bakteri yang diperoleh dari
fermentasi buah sirsak memiliki kesamaan morfologi baik makroskopik maupun
mikroskopik. Hasil identifikasi secara makroskopik memperlihatkan hasil berupa isolat
koloni bewarna putih susu, bentuk bulat, tepian licin dan elevasi cembung, dengan hasil
mikroskopik yang menunjukkan sel bakteri bewarna ungu (Gram positif) dan berbentuk
basil. Isolat BAL hasil isolasi dari fermentasi buah sirsak ini menunjukkan gambaran
morfologi makroskopik dan mikroskopik yang sama dengan BAL pada penelitian
sebelumnya yang berasal dari buah sirsak dan buah mangga (Utami 2011; Ibrahim 2015).
E. Produksi Enzim β-Galaktosidase
Produksi enzim β-galaktosidase dilakukan pada medium MRSB yang telah
ditambahkan laktosa 1%. Laktosa sebagai sumber energi, karbon, dan induser enzim ß-
galaktosidase (Kilara & Shahani 1975). Medium MRSB mengandung pepton, beef
extract, Yeast extract, tween 80, magnesium sulfat dan mangan sulfat yang dibutuhkan
untuk pertumbuhan bakteri asam laktat. Pepton dan beef extract berfungsi sebagai
sumber karbon, nitrogen, dan vitamin untuk pertumbuhan bakteri. Yeast extract sebagai
sumber vitamin dan asam amino. Tween 80 sebagai surfaktan untuk membantu
penyerapan nutrien oleh bakteri asam laktat.
Magnesium sulfat dan mangan sulfat merupakan sumber kation yang digunakan
untuk metabolisme (Man et al. 1960). Pada saat produksi, bakteri asam laktat dibiakan
pada medium MRSB selama 24 jam. Menurut Prihantini (2013), inkubasi selama 24
jam merupakan waktu produksi enzim β-galaktosidase yang optimum. Pada fase
tersebut, sel membelah dengan laju konstan, jumlah masa menjadi dua kali lipat dengan
laju yang sama, aktivitas metabolit konstan dan menghasilkan enzim untuk
17
pertumbuhan (Pelczar & Chan 1986). Enzim ß-galaktosidase pada bakteri asam laktat
merupakan enzim intraseluler sehingga memerlukan pemecahan dinding sel (Huang et
al. 1993). Proses pemecahan dinding sel diawali dengan pemanenan bakteri asam laktat
yang dilakukan dengan cara sentrifugasi. Teknik sentrifugasi akan memisahkan sel dari
larutan media sehingga sel akan mengendap dalam media. Sentrifugasi dilakukan
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC agar tidak terjadi
kerusakan enzim. Sel yang diperoleh kemudian dicuci dua kali dengan buffer fosfat 0.1
M pH 7 agar terbebas dari pengotor yang berasal dari media.
Pemecahan dinding sel dilakukan dengan metode sonikasi. Sonikasi adalah salah
satu metode yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan metode lain untuk
gangguan dinding sel bakteri (Engler 1985) dan terbukti lebih efektif untuk melepaskan
β-gal (Toba et al. 1990; Sakakibara et al. 1994). Enzim kasar diperoleh dengan cara
sentrifugasi dengan mengambil bagian supernatan. Data volume supernatan yang
diperoleh pada penelitian ini dapat dilihat pada tabel 4.
F. Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase
Enzim kasar yang telah didapatkan dari tahap produksi segera dilakukan pengujian
aktivitas enzim β-galaktosidase menggunakan substrat kromogenik yaitu o-nitrophenyl-
ß-D-Galactoside (ONPG). Senyawa ONPG tidak berwarna, namun dengan adanya β-
Galaktosidase, diubah menjadi galaktosa dan o- nitrophenol. O-nitrophenol berwarna
kuning dan bisa diukur penyerapannya pada panjang gelombang 420 nm. Jika
konsentrasi ONPG cukup tinggi, maka jumlah o-nitrophenol yang dihasilkan sebanding
dengan jumlah enzim β-galaktosidase yang ada pada saat enzim β-galaktosidase
bereaksi dengan ONPG. Reaksi dihentikan dengan menambahkan larutan Na2CO3, yang
mengubah pH larutan menjadi basa yaitu sekitar pH 10-11 karena pada pH ini enzim ß-
18
galaktosidase tidak aktif (Yuningtyas 2008). Intensitas warna kuning yang dihasilkan
dari ONP dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi enzim. Jumlah ONP yang
terbentuk dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada λ = 420 nm (Miller 1972).
Aktivitas enzim β-galaktosidase dapat ditentukan dengan pembuatan kurva standar
ONP terlebih dahulu dengan rentang konsentrasi 0-2.5mM untuk menentukan
konsentrasi enzim β-galaktosidase pada isolat bakteri asam laktat yang akan diuji. Satu
unit aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan dalam banyaknya enzim yang
diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol ONP dari subtrat ONPG per menit pada kondisi
percobaan (Miller 1972). Aktivitas enzim isolat bakteri asam laktat dari buah sirsak
dibandingkan dengan bakteri pembanding yaitu Bakteri Lactobacillus plantarum.
Bakteri Lactobacillus plantarum digunakan sebagai pembanding karena bakteri ini
mempunyai aktivitas enzim β- galaktosidase yang cukup tinggi (Prihantini 2013).
Berdasarkan hasil percobaan, nilai aktivitas enzim β-galaktosidase yang diperoleh
dari bakteri pembanding lebih besar dibandingkan dengan isolat bakteri asam laktat
yaitu 0,776 U/ml. Nilai aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi dihasilkan oleh isolat
SM6 yaitu 0,292 U/ml, sedangkan nilai aktivitas enzim β- galaktosidase terendah
dihasilkan oleh isolat SM3 yaitu 0,232 U/ml. Nilai aktivitas enzim rata-rata isolat
bakteri asam laktat dan bakteri pembanding kecil, hal ini disebabkan karena waktu dan
kondisi yang diukur belum optimum serta masih banyak enzim lain selain enzim ß-
galaktosidase yang terdapat dalam ekstrak enzim kasar tersebut.
G. Uji Kadar Protein Enzim β-Galaktosidase
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford, yaitu
untuk mengukur konsentrasi protein total secara kolorimetri dalam suatu larutan. Dalam
19
uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue G250 (CBBG) yang
berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan
warna (kebiruan) dengan absorbansinya diukur pada λ 595 nm. Ikatan antara zat warna
CBBG dan protein dapat terjadi karena adanya gaya van der walls antara keduanya.
Gaya van der walls ini terjadi karena adanya bagian protein yang bersifat hidrofobik
mengikat bagian zat warna dari CBBG yang bersifat non polar dan mengakibatkan zat
warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian hidrofobik protein. Kompleks warna
biru pada larutan yang diberi reagen Bradford sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil
karena antara zat warna dan protein terdapat kekuatan ionik yang memperkuat ikatan
antara keduanya sehingga membuat zat warna tersebut menjadi stabil (Ninfa et al.
2009). Pereaksi Bradford bereaksi terutama dengan residu arginine dan bereaksi dengan
histidin, lisin, tirosin, triptofan dan residu fenilalanin (Bintang 2010) yang mungkin
terkandung dalam ekstrak enzim kasar. Jumlah CBBG yang terikat pada protein
proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein.
Penentuan panjang gelombang maksimum digunakan larutan standar Bovine Serum
Albumin (BSA) dengan konsentrasi 400 ppm. Setelah dilakukan pengukuran, panjang
gelombang maksimum berada pada 595,0 nm dengan absorbansi sebesar 0,8236. Data
hasil pengukuran panjang gelombang maksimum kemudian ditentukan konsentrasi
minimum dan maksimum untuk membuat kurva kalibrasi untuk mengetahui linieritas
hubungan antara konsentrasi larutan standar dengan absorbansinya. Rentang
konsentrasi untuk pembuatan kurva kalibrasi BSA yaitu 73 ppm, 158 ppm, 243 ppm,
328 ppm, dan 413 ppm. Uji protein keenam isolat bakteri asam laktat dan bakteri
pembanding dilakukan secara triplo. Kadar protein tertinggi ditunjukan pada isolat
bakteri SM6 yang memiliki nilai rata-rata kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml,
sedangkan yang terendah ditunjukan pada isolat bakteri SM3 yaitu sebesar 0,6690
mg/ml (Tabel 6.). Jika dibandingkan dengan kadar protein L. plantarum, kadar protein
keenam isolat lebih rendah. Hal ini disebabkan oleh tingginya produksi enzim pada
L.plantarum.
20
21
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan keenam isolat
bakteri asam laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β- galaktosidase namun
isolat SM6 memiliki aktivitas tertinggi sebesar 0,292 U/ml dengan kadar protein sebesar
0,8092 mg/ml.
B. Saran
Untuk penelitian berikutnya, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kondisi
optimum pada produksi enzim β-galaktosidase sehingga dapat menghasilkan enzim β-
galaktosidase yang maksimal serta dilakukan pemurnian enzim untuk mendapatkan
aktifitas enzim β-galaktosidase yang lebih tinggi.
22
BAB VI
LUARAN YANG DICAPAI
Nama Jurnal Al-Kauniyah
Website Jurnal journal.uinjkt.ac.id/index.php/kauniyah/user
Status Makalah Submitted
Jenis Prosiding -
Tanggal Submit 2 Mei 2020
Nama Jurnal JURNAL PSR UI
Website Jurnal http://psr.ui.ac.id/index.php/journal/user
Status Makalah Submitted
Jenis Prosiding -
Tanggal Submit 24 FEBRUARI 2020
23
BAB VII. RENCANA TINDAK LANJUT DAN PROYEKSI HILIRISASI
Hasil penelitian yang telah didapatkan merupakan pengembangan ilmu dari
mikrobiologi dimana didapatkan sumber alami bakteri asam laktat yang berasal dari
fermentasi buah sirsak yang memiliki keunggulan dibandingkan sumber bakteri asam
laktat yang lain, seperti dari buah sirsak atau buah2an yang tanpa proses fermentasi.
Keunggulannya yaitu terjadinya reaksi enzimatis yang lebih optimum pada buah sirsak
yang melalui proses fermentasi, karena pada proses fermentasi dilakukan penyesuaian
lingkungan hidup dari bakteri asam laktat tersebut. Sehingga reaksi enzimatis yang
optimal tersebut dapat meningkatkan jumlah dari bakteri asam laktat dan meningkatkan
kualitas dari bakteri asam laktat yang di hasilkan. Selain itu juga merupakan
pengembangan ilmu biokimia, dimana pada penelitian ini didapatkan sumber enzim beta
galaktosidase bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak yang sebelumnya belum
pernah dilakukan atau diteliti.
Setelah dilakukannya penelitian ini, peneliti akan melanjutkan untuk melakukan
optimasi aktivitas enzim beta galactosidase yang dihasilkan dari bakteri asam laktat
fermentasi buah sirsak, sehingga nantinya dapat digunakan sebagai kondisi atau bahan
pertimbangan dalam menghasilkan produk kesehatan yang berasal dari enzim beta
galactosidase bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak. Selain itu peneliti juga
akan melakukan uji aktifitas morfologi dan optimasi terhadap bakteri asam laktat serta
enzim beta galactosidase yang dihasilkan pada berbagai parameter.
24
DAFTAR PUSTAKA
Alimsardjono L, Purwono PB. 2015. Buku ajar Pemeriksaan Mikrobiologi Pada
Penyakit Infeksi. Sagung Seto, Jakarta. Hlm. 30-31
Aurand LW, Woods AE, Wells MR. 1987. Food Composition and Analysis. Van
Nostrand Reinhold. New York. Hlm. 307
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga. Jakarta. Hlm. 103-104
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of
microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Journal Analytical Biochemistry. 1(72): 248-254
Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 1985. Ilmu Pangan, Terjemahan:
Purnomo H, Adiono, Food Science. Jakarta.
Campbell AK, Waud JP, Matthews SB. 2005. The Molecular Basis of Lactose
Intolerance. Journal Science Progress. 88(3): 157-202
Candra JI. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Produk Bekasam
Ikan Bandeng (Chanos Chanos). Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Hlm. 38
Desniar, Rusmana I, Suwanto A, Mubarik NR. 2012. Senyawa antimikroba yang
dihasilkan oleh bakteri asam laktat asal bekasam. Skripsi. Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor,
Bogor. Hlm. 2
Diniyah N, Subagio A, Fauzi M. 2013. Produksi Minuman Fungsional Sirsak (Annona
muricata L.) dengan Fermentasi Bakteri Asam Laktat. Jurnal Fakultas
Teknologi Pertanian Universitas Jember. Hlm. 1007-1012
Engler CR. 1985. Disruption of microbial cells. Journal comprehensive Biotechnology,
(Second Edition). Pergamon, UK. (2): 305–324
Fazriyani R. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat penghasil Enzim β-
galaktosidase dari Buah Durian. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains
Universitas Muhammadiyah Prof. DR. Hamka. Jakarta.
Fueller R. 1989. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology . 5(66):
365-378
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi dasar dalam praktek teknik dan prosedur dasar
laboratorium. Gramedia, Jakarta.
Hariana A. 2007. Tumbuhan Obat dan Khasiatnya seri 3. Penebar Swadaya, Jakarta.
Hlm. 89-90
Harti AS. 2012. Dasar-dasar Mikrobiologi Kesehatan. Nuha Medika, Yogyakarta.
1(16): 109-111
25
Hartono LK. 2013. Purifikasi parsial dan karakterisasi β-galaktosidase dari isolat bakteri
asam laktat (BAL) strain b134. Skripsi. Fakultas matematika dan ilmu
pengetahuan alam Institut pertanian bogor, Bogor. Hlm. 4-6
Hermawan AW, Wikandari PR. 2016. Pengaruh jenis kultur starter bakteri asam laktat
terhadap karakteristik soyghurt. UNESA Journal of Chemistry Vol. 5 No.1.
Departemen kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Negeri Surabaya, Surabaya. Hlm. 14
Huang DQ, Prevost H, Divies C. 1995. Principal characteristics of ß-galactosidase from
Leuconostoc spp. J Int Dairy. 1(5): 29-43
Ibrahim A, Fridayanti A, Delvia F. 2015. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat
(BAL) dari Buah Mangga (Mangifera indica L.). Jurnal Ilmiah Manuntung.
Laboratorium Penelitian dan Pengembangan FARMAKA TROPIS. Fakultas
Farmasi Universitas Mulawarman. Kalimantan Timur. 1(2): 159-163
Irma A, Dwyana Z, Haedar N. 2010. Efektivitas antimikroba bakteri probiotik dari usus
itik pedaging Anas domesticus terhadap pertumbuhan Vibrio spp. Jurnal
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin,
Makassar. Hlm: 4
ISO International Standardisation Organisation. Microbiology of food and animal
feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic
acid bacteria - Colony-count technique at 30°C. ISO 15214:1998
Karmana O. 2008. Biologi untuk kelas XII semester 1 sekolah menengah atas.
Grafindo Media Pratama, Bandung.
Khusniati T, Aditya AT, Choliq A, Sulistiani. 2013. Characterization and identification
of the best screened indigenous lactic acid bacteria producing β-galactosidase.
Knowledgee Publishing Services. High School of Industrial Technology and
Pharmacy, Bogor. Hlm: 441
Khusniati T, Mariyani N, Lioe HN, Faridah DN, Choliq A. 2015. Purifikasi parsial dan
karakterisasi β-galaktosidase Lactobacillus plantarum B123 indigenos dan
hidrolisis laktosa untuk produksi susu ultra high temperature rendah laktosa.
Jurnal Departemen Teknologi Pangan, FATETA, Universitas Pertanian
Bogor, Bogor. Hlm: 2
Kilara A, Shahani KM. 1975. Lactase activity of cultured and acidified dairy products.
Jurnal Dairy Sci. 59(12): 2031-2035
Lu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating β-
galactosidase from Lactobacillus Indigen B5. Process Biochemistry. 2(44):
232-236
Man JC, de RM, Sharpe ME. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli. Dalam
: Jurnal appl. Bact. 23(1): 130-135
26
Mardalena. 2016. Fase Pertumbuhan Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Tempoyak Asal
Jambi yang Disimpan Pada Suhu Kamar. Jurnal Sain Peternakan Indonesia
Vol. 11 No. 1, ISSN 1978-3000. Fakultas Peternakan Universitas Jambi, Jambi.
Hlm: 59-61
Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. EGC, Jakarta.
Hlm. 98
Miller J. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory,
New York.
Nur F, Hafsan, Wahdiniar A. 2015. Isolasi Bakteri Asam Laktat Berpotensi Probiotik
pada Dangke, Makanan Tradisional dari susu Kerbau di Curio Kabupaten
Enrekang. Jurnal Biogenesis, ISSN 2302-1616 Vol.3 No. 1. Fakultas Sains dan
Teknologi, UIN Alaudin, Malang. 1(3): 60-65
Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Terjemahan: Hadioetomo
RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL. UI Press, Elements of Microbiology.
Prasad, L. N., Ghosh, B. C., Sherkat, F. and Shah, N. P. 2013. Extraction and
characterisation of β-galactosidase produced by Bifidobacterium animalis spp.
lactis Bb12 and Lactobacillus delbrueckiispp. Bulgaricus ATCC 11842 grown
in whey. International Food Research Journal. School of Biomedical and
Health Sciences, Victoria University, Australia. 20(1): 487-494
Prihantini NN, Khusniati T, Bintang M, Choliq A, Sulistiani. 2013. Purifikasi Parsial
dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Lactobacillus Plantarum Strain D-210.
Jurnal Kedokteran Yarsi. Universitas Kristen Indonesia, Jakarta. 21(1): 014-
026
Poedjiadi A, Supriyanti FMT. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. UI-Press, Jakarta. Sari
YNM, Syukur S, Jamsari. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Identifikasi DNA
Bakteri Asam Laktat (BAL) yang Berpotensi sebagai Antimikroba dari Fermentasi
Markisa Ungu (Passiflora edulis var. flavicarpa). Jurnal Kimia FMIPA.
Universitas Andalas. Hlm: 84.
Schnurer J, Magnusson J. 2005. Antifungal Lactic Acid Bacteria as biopreservatives.
Journal Trends Food Sci Technol. 16(1): 70-78.
Sinuhaji AB. 2006. Intoleransi Laktosa. Majalah Kedokteran Nusantara. Departemen
Ilmu Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatera
Utara/Rumah Sakit H. Adam Malik, Medan. Hlm. 425
Sudjijo. 2014. Mengenal Sirsak Varietas Ratu dan Lokal. Balai Penelitian. Tanaman
Buah Tropika, Solok Sumatera Barat.
Sunatmo TI. 2007. Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium. Ardy Agency,
Bogor.
27
Suprapti L. 2003. Pembuatan Tempe. Kanisius, Yogyakarta.
Surono IS. 2004. Probiotik: Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya, Jakarta.
Syamsuhidayat SS, Hutapea JR. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia, edisi kedua,
Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Toba T, Hayasaka I, Taguchi S, Adachi S. 1990. A new method for manufacture of
lactose-hydrolysed fermented milk. Journal of Science Food Agriculture.
52(3): 403–407
Utami DA, Syukur S, Darma A. 2011. Karakterisasi Molekular Bakteri Asam Laktat
(BAL) Probiotik dengan Gen 16s rRNA yang Berpotensi Menghasilkan
Bakteriosin dari Fermentasi Sirsak (Annona muricata L.) di Sumatera Barat.
Tesis. Universitas Andalas, Padang.
Wati SW. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat penghasil Enzim β-
galaktosidase dari Buah Tomat. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains
Universitas Muhammadiyah Prof. DR. Hamka. Jakarta.
Yulia F. 2014. Isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata
L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya. Skripsi. Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang.
Winarno FG. 1999. Enzim Pangan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Yuningtyas S. 2008. Isolasi dan karakterisasi β-galaktosidase bakteri asam laktat dari
makanan hasil fermentasi. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
alam Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hlm: 1-2, 5
Zahro F. 2014. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Asal Fermentasi Markisa
Ungu (Pasiflora edulis var. Sims) sebagai Penghasil Eksopolisakarida. Skripsi.
Fakultas Sains dan Teknologi UIN Malang, Malang. Hlm: 3
Zuhud EAM. 2011. Bukti Kedahsyatan Sirsak Menumpas Kanker. Jakarta: AgroMedia
Pustaka. Hlm: 18
28
LAMPIRAN
Bukti submit jurnal akreditasi sinta 2
29
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM β-GALAKTOSIDASE
BAKTERI ASAM LAKTAT DARI FERMENTASI BUAH SIRSAK
(ANNONA MURICATA. L)
ISOLATION AND ACTIVITY TEST OF ß-GALACTOSIDASE ENZYME LACTIC ACID BACTERIA FROM FERMENTATION OF SOURSOUP FRUIT (ANNONA
MURICATA. L)
Fitri Yuniarti1*, Wahyu Hidayati1, Septi Setiawati1 , Khansa Nabilah1 1Universitas Muhammadiyah Prof DR Hamka, Jl Delima Raya II/IV Perumnas Klender, Jakarta
Timur.13460
*Corresponding author: [email protected]
Abstrak
Bakteri asam laktat memiliki kemampuan dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase
yang berguna untuk penderita intoleransi laktosa. Salah satu sumber penghasil bakteri asam
laktat adalah buah sirsak (Annona Muricata. L) dengan kandungan glukosa yang cukup
tinggi yang berguna untuk pertumbuhan bakteri asam laktat, terutama pada proses
fermentasi buah sirsak. Penelitian ini bertujuan mendapatkan isolat bakteri asam laktat dari
fermentasi buah sirsak yang memiliki aktivitas enzim β-galaktosidase. Produksi enzim β-
galaktosidase menggunakan metode sonikasi. Uji aktivitas enzim dilakukan dengan melihat
kemampuan enzim β- Galaktosidase dalam menguraikan laktosa menjadi monosakarida.
Penelitian ini di awali dengan isolasi BAL dari fermentasi buah sirsak, kemudian dilakukan
karakterisasi Bakteri Asam Laktat secara makroskopis dan mikroskopis. Isolat BAL terpilih
dari hasil karakterisasi dilakukan pengukuran aktivitas enzim menggunakan
spektrofotometer visible dengan substrat o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG)
dan dilanjutkan uji kadar protein dengan metode Bradford. Hasil isolasi didapatkan 6 isolat
BAL dengan morfologi terbaik. Isolat SM6 memiliki aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,292 U/ml
dengan kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Dari data diatas dapat disimpulkan bahwa buah
sirsak mengandung bakteri asam lakat yang berpotensi menghasilkan enzim β-galaktosidase.
Hasil Penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi tambahan mengenai bahan alam
yang menjadi sumber Bakteri Asam Laktat penghasil enzim β- Galaktosidase yang nantinya
dapat dimanfaatkan bagi penderita intoleransi laktosa.
Kata kunci: Bakteri asam laktat; buah sirsak (annona muricate. L.); enzim β-
galaktosidase; fermentasi.
Abstract
Lactic acid bacteria have the ability to produce β-galactosidase enzymes that are useful for
patients with lactose intolerance. One source of producing lactic acid bacteria is soursop
(Annona Muricata. L) with a fairly high glucose content which is useful for the growth of lactic
acid bacteria, especially in the fermentation process of soursop fruit. This study aims to obtain
lactic acid bacterial isolates from soursop fruit fermentation that has β-galactosidase enzyme
activity. The production of the β-galactosidase enzyme uses the sonication method. Enzyme
activity testing is done by looking at the ability of the β-galactosidase enzyme in breaking
down lactose into monosaccharides. This research began with BAL isolation from soursop
fermentation, then macroscopic and microscopic characterization of Lactic Acid Bacteria.
LAB isolates selected from the results of the characterization were measured by enzyme
activity using a visible spectrophotometer with o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG)
30
substrate and continued with protein content testing using Bradford method. The isolation
results obtained 6 LAB isolates with the best morphology. SM6 isolates had the highest enzyme
activity, 0.292 U / ml with protein content of 0.8092 mg / ml. From the above data it can be
concluded that the soursop fruit contains lactic acid bacteria which has the potential to
produce the β-galactosidase enzyme. The results of this study are expected to be additional
information about natural materials which are the source of Lactic Acid Bacteria producing
β-Galactosidase enzymes which can later be utilized for people with lactose intolerance.
Keywords: Lactic acid bacteria; soursop fruit (annona muricate. L.); β-galactosidase
enzyme;
fermentation.
PENDAHULUAN
Tanaman sirsak (Annona muricata L.) merupakan komoditas hasil pertanian
yang banyak ditanam di Indonesia. Kandungan karbohidrat yang tinggi pada buah
sirsak merupakan sumber yang potensial untuk mendapatkan bakteri asam laktat.
Salah satu jenis karbohidrat pada buah sirsak adalah gula pereduksi (glukosa dan
fruktosa), yang merupakan sumber karbon utama bagi mikroorganisme dalam
proses fermentasi (Diniyah dkk. 2013). Menurut Buckle (1987), fermentasi asam
laktat terjadi karena adanya aktivitas bakteri asam laktat yang mengubah glukosa
menjadi asam laktat, sehingga jumlah bakteri asam laktat meningkat selama proses
fermentasi berlangsung yang akan diikuti dengan penurunan pH. Bakteri asam
laktat (BAL) merupakan bakteri Gram-positif yang mengeksresikan asam laktat
sebagai produk akhir fermentasi yang berperan sebagai preservasi bahan makanan
(Schnurer dan Magnusson 2005). Kelompok bakteri asam laktat merupakan salah
satu kelompok bakteri yang mempunyai enzim-enzim β-galaktosidase dan laktat
dehidrogenase (Surono 2004). Enzim β- galaktosidase merupakan enzim yang
menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa dengan memutus ikatan β-
galaktosida pada ujung nonreduksi β-D-galaktosa. Secara alamiah, enzim β-
galaktosidase (laktase) terdapat pada usus halus manusia (Campbell et al. 2005).
Kekurangan laktase sementara pada individu dengan kadar β- galaktosidase normal
juga dapat diakibatkan oleh kerusakan pada lapisan usus yang disebabkan oleh
infeksi virus atau bakteri, kemoterapi kanker, kondisi alergi atau autoimun dan
penurunan β- galaktosidase yang terkait dengan penuaan (Sinuhaji 2006).
Enzim β-galaktosidase digunakan untuk menghidrolisis susu laktosa untuk
mengatasi masalah intoleransi laktosa oleh individu yang kekurangan laktase.
Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan
galaktosa karena enzim ß-galaktosidase yang rendah (Marsh dan Riley 1998).
31
Laktosa tidak mudah diserap, tetapi harus dihidrolisis oleh laktase (β-galaktosidase)
menjadi monosakarida (mudah diserap usus). Jika laktosa tidak dapat dihidrolisis
oleh β-galaktosidase, akan timbul gejala sakit perut, mulas, kejang perut,
pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). Untuk mengurangi masalah tersebut
penderita lactose intolerance dapat mengkonsumsi suplemen β- galaktosidase atau
dengan mengkonsumsi susu rendah laktosa. Karena semakin meningkatnya
penderita intoleransi laktosa pada saat ini, maka perlu dilakukan penelitian dan
ditemukan sumber-sumber baru penghasil enzim ß-galaktosidase yang terdapat
dialam yang nantinya bisa digunakan sebagai produk atau suplemen kesehatan bagi
penderita intoleransi laktosa.
Secara luas, enzim β-galaktosidase dapat diperoleh dari beberapa sumber antara
lain mikroorganisme, tanaman, dan hewan. Enzim β-galaktosidase juga dapat
diisolasi dari ragi kelompok Kluyveromyces sp. dan fungi kelompok Aspergillus sp.
(Harti 2015). Dibandingkan dengan sumber tanaman dan hewan, enzim yang
diisolasi dari mikroorganisme lebih mudah dipisahkan dan dimurnikan setelah
disekresikan ke dalam media pertumbuhan mikroorganisme (Radji 2009). Informasi
mengenai BAL yang diisolasi dari fermentasi buah dan sayur telah banyak
dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah
sirsak (Annona muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014)
yang telah berhasil mengisolasi 7 isolat BAL. Namun, isolasi BAL yang berpotensi
penghasil enzim β-galaktosidase pada fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.)
belum pernah dilakukan. Mengingat banyaknya manfaat dari BAL dan enzim ß-
galaktosidase terhadap kesehatan maka perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang
isolasi BAL penghasil enzim β-galaktosidase dari fermentasi buah sirsak (Annona
muricata L.). Berdasarkan hal ini diharapkan bakteri asam laktat yang berhasil di
isolasi pada penelitian ini dapat dijadikan sebagai sumber baru dalam menghasilkan
enzim β-galaktosidase yang bermanfaat bagi kesehatan terutama penderita
intoleransi laktosa. Selain itu buah sirsak hasil fermentasi juga membawa dampak
positif di dalam dunia industri dan kesehatan karena akan mengasilkan buah sirsak
probiotik yang baik untuk usus yang mengkonsumsinya.
MATERIAL DAN METODE
Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Buah Sirsak
32
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah buah sirsak lokal (Annona
muricata L.) matang yang diperoleh dari Pasar Klender. Sebelum dilakukan isolasi,
buah sirsak difermentasi terlebih dahulu dengan cara isi buah dikeluarkan dan
dibungkus dengan daun pisang steril, ditempatkan dalam wadah fermentasi dan
dikondisikan agar udara tidak masuk. Fermentasi dilakukan pada suhu ruang selama
72 jam (Sari 2013). Hasil fermentasi ditimbang sebanyak 5 g dimasukkan ke dalam
45 mL MRSB, lalu dihomogenkan sehingga didapatkan pengenceran 10-1.
Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah inkubasi, sampel
diencerkan menggunakan media pepton water hingga pengenceran 10-9. Dari
pengenceran 10-9, diambil 100 µl sampel dan ditanam dengan metode sebar pada
cawan petri yang telah berisi media MRS Agar. Inokulum disimpan dalam anaerob
jar kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 37ºC.
Setelah 48 jam, single colony yang mencirikan BAL yaitu bulat licin berwarna
putih dipindahkan ke media MRS Agar baru untuk pemurnian koloni dengan metode
streak yaitu dengan menggunakan jarum ose kemudian diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 37ºC (Purwati et al. 2005).
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan secara makroskopis yaitu
identifikasi morfologi bakteri asam laktat dan secara mikroskopis/pewarnaan gram.
Produksi Enzim β-galaktosidase
Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari MRSA slant dipindahkan ke dalam media
produksi yang sudah disterilisasi (MRSB dengan kandungan laktosa 1% dan pH
medium: 8). Kemudian media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Sel
dipanen dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit
pada suhu 4°C. Peletnya dicuci sebanyak dua kali dengan buffer fosfat 0,1 M pH
7. Kemudian pemecahan sel dengan sonikator selama 5 menit pada suhu 4°C.
Suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada
suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh merupakan enzim β-galaktosidase kasar
(Fazriyani 2015).
Uji Aktivitas Enzim β-galaktosidase
Uji aktivitas ß-galaktosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1000 µL buffer
33
fosfat 0,1 M pH 7 dan 100 µL enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu
diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 200 µL o-
nitrofenil-ß-D-galaktopiranosida (oNPGal) 4 mg/mL dan diinkubasi pada suhu
37°C selama 15 menit. Pada menit ke-15 ditambahkan 1000 µL Na2CO3 1 M.
Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 420 nm (Lu et al. 2009).
Penentuan Kadar Protein
Sebanyak 20 µL enzim β-galaktosidase ditambahkan 1 ml larutan Bradford.
Larutan dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya
pada λ 595 nm. Absorbansi yang diperoleh dikonversikan pada persamaan garis dari
kurva standar BSA yang telah dibuat, sehingga dapat diperoleh kadar protein dari
enzim β-galaktosidase (Fazriyani 2015).
HASIL
Fermentasi Buah Sirsak
Pada tahap awal proses fermentasi, dilakukan secara anaerob karena bakteri
asam laktat bersifat anaerob fakultatif. Proses fermentasi ini dilakukan dengan
tujuan untuk meningkatkan jumlah bakteri asam laktat yang tumbuh secara spontan
karena adanya nutrisi untuk pertumbuhan bakteri asam laktat yang terkandung
dalam buah sirsak terutama karbohidrat berupa glukosa, fruktosa atau sukrosa
(Utami 2011). Karbohidrat tersebut akan terurai menjadi senyawa-senyawa
sederhana seperti asam laktat, asam asetat, asam propionat dan etil alkohol (Sari
2013).
Hasil fermentasi setelah 72 jam menunjukkan terjadinya perubahan pH dari
sebelum dan sesudah fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) . Terjadinya
perubahan pH ini disebabkan karena peningkatan jumlah mikroba penghasil asam
sehingga terjadi proses oksidasi anaerobik pada saat fermentasi yang menghasilkan
alkohol serta beberapa senyawa asam (Sari 2013). Proses fermentasi juga
memberikan perubahan secara organoleptis terhadap buah sirsak seperti warna, rasa,
bau dan serat sirsak.
Isolasi Bakteri Asam Laktat
34
Dalam melakukan isolasi dilakukan beberapa proses sampai didapatkan kultur
murni isolat bakteri asam laktat. Proses yang dilakukan meliputi pengenceran dengan
rentang pengenceran 10-1 sampai 10-9. Hal ini bertujuan untuk memperkecil atau
mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Larutan pengenceran
yang digunakan adalah pepton water yang berguna sebagai sumber karbon nitrogen
dan vitamin untuk pertumbuhan dan perkembangan bakteri dalam menghasilkan
enzim yang diharapkan (Prihantini 2013).
Hasil pengenceran yang ditanamkan ke medium MRSA dalam cawan petri hanya
hasil pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyaknya koloni yang terdapat
dalam hasil pengenceran 10-1 sampai 10-6. Teknik isolasi dilakukan dengan
menggunakan metode sebar agar koloni yang tumbuh dapat tersebar secara merata
pada bagian permukaan agar, sehingga memudahkan dalam pengambilan koloni
bakteri. Suspensi bakteri yang telah disebar kemudian diinkubasi pada suhu 37oC
yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri asam laktat.
Hasil pengenceran yang ditanamkan ke medium MRSA dalam cawan petri hanya
hasil pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyaknya koloni yang terdapat
dalam hasil pengenceran 10-1 sampai 10-6. Pemilihan koloni tunggal berdasarkan
bentuk morfologi terbaik yang mencirikan koloni BAL yaitu bulat, cembung, licin,
dan bewarna putih susu. Isolat bakteri asam laktat yang telah murni disimpan sebagai
stok pada medium MRSA slant dalam tabung reaksi dan diberikan kode isolat SM1
yang berasal dari pengenceran 10-7. Kode isolat SM2, SM3 dan SM4 berasal dari
pengenceran 10-8 dan isolat yang berasal dari pengenceran 10-9 diberi kode isolat SM5
dan SM6. Stok isolat disimpan untuk pengujian ke tahap selanjutnya.
35
Gambar 1. Hasil pemurnian bakteri asam laktat
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Isolat bakteri asam laktat yang telah murni selanjutnya dilakukan pengujian
karakterisasi. Uji karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan dengan 2 cara yaitu
identifikasi makroskopik dan mikroskopik. Pada identifikasi makroskopik, koloni
bakteri yang tumbuh diamati warna, bentuk, tepian dan elevasi dari koloni. Koloni
bakteri asam laktat yang diamati morfologinya adalah koloni yang tumbuh pada
medium MRSA dalam cawan petri. Hasil identifikasi secara makroskopik
memperlihatkan hasil berupa isolat koloni bewarna putih susu, bentuk bulat, tepian
licin dan elevasi cembung, dengan hasil mikroskopik yang menunjukkan sel bakteri
bewarna ungu (Gram positif) dan berbentuk basil. Isolat BAL hasil isolasi dari
Isolat SM6 Isolat SM5
Isolat SM4 Isolat SM3
Isolat SM2 Isolat SM1
36
fermentasi buah sirsak ini menunjukkan gambaran morfologi makroskopik dan
mikroskopik yang sama dengan BAL pada penelitian sebelumnya yang berasal dari
buah sirsak dan buah mangga (Utami 2011; Ibrahim 2015).
Produksi Enzim β-Galaktosidase
Produksi enzim β-galaktosidase dilakukan pada medium MRSB yang telah
ditambahkan laktosa 1%. Laktosa sebagai sumber energi, karbon, dan induser enzim
ß-galaktosidase (Kilara & Shahani 1975). Pada saat produksi, bakteri asam laktat
dibiakan pada medium MRSB selama 24 jam. Menurut Prihantini (2013), inkubasi
selama 24 jam merupakan waktu produksi enzim β-galaktosidase yang optimum.
Pada fase tersebut, sel membelah dengan laju konstan, jumlah masa menjadi dua
kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolit konstan dan menghasilkan
enzim untuk pertumbuhan (Pelczar & Chan 1986). Enzim ß-galaktosidase pada
bakteri asam laktat merupakan enzim intraseluler sehingga memerlukan pemecahan
dinding sel (Huang et al. 1993). Pemecahan dinding sel dilakukan dengan metode
sonikasi. Sonikasi adalah salah satu metode yang paling banyak digunakan
dibandingkan dengan metode lain untuk gangguan dinding sel bakteri (Engler 1985)
dan terbukti lebih efektif untuk melepaskan β-gal (Toba et al. 1990; Sakakibara et
al. 1994). Enzim kasar diperoleh dengan cara sentrifugasi dengan mengambil bagian
supernatan.
Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase
Aktivitas enzim β-galaktosidase dapat ditentukan dengan pembuatan kurva
standar ONP terlebih dahulu dengan rentang konsentrasi 0-2.5mM yang bertujuan
untuk menentukan konsentrasi enzim β-galaktosidase pada isolat bakteri asam laktat
yang akan diuji. Satu unit aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan dalam
banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol ONP dari subtrat
ONPG per menit pada kondisi percobaan (Miller 1972). Berdasarkan hasil
percobaan, nilai aktivitas enzim β-galaktosidase yang diperoleh dari bakteri
pembanding lebih besar dibandingkan dengan isolat bakteri asam laktat yaitu 0,776
U/ml. Nilai aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi dihasilkan oleh isolat SM6
yaitu 0,292 U/ml, sedangkan nilai aktivitas enzim β- galaktosidase terendah
dihasilkan oleh isolat SM3 yaitu 0,232 U/ml.
37
Uji Kadar Protein Enzim β-Galaktosidase
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford. Uji
protein keenam isolat bakteri asam laktat dan bakteri pembanding dilakukan secara
triplo. Kadar protein tertinggi ditunjukan pada isolat bakteri SM6 yang memiliki
nilai rata-rata kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml, sedangkan yang terendah
ditunjukan pada isolat bakteri SM3 yaitu sebesar 0,6690 mg/ml . Jika dibandingkan
dengan kadar protein L. plantarum, kadar protein keenam isolat lebih rendah. Hal
ini disebabkan oleh tingginya produksi enzim pada L.plantarum.
PEMBAHASAN
Pengujian aktivitas enzim β-galaktosidase menggunakan substrat kromogenik
yaitu o-nitrophenyl-ß-D-Galactoside (ONPG). Senyawa ONPG tidak berwarna,
namun dengan adanya β-Galaktosidase, diubah menjadi galaktosa dan o-
nitrophenol. O-nitrophenol berwarna kuning dan bisa diukur penyerapannya pada
panjang gelombang 420 nm. Jika konsentrasi ONPG cukup tinggi, maka jumlah o-
38
nitrophenol yang dihasilkan sebanding dengan jumlah enzim β-galaktosidase yang
ada pada saat enzim β-galaktosidase bereaksi dengan ONPG. Reaksi dihentikan
dengan menambahkan larutan Na2CO3, yang mengubah pH larutan menjadi basa
yaitu sekitar pH 10-11 karena pada pH ini enzim ß-galaktosidase tidak aktif
(Yuningtyas 2008). Aktivitas enzim isolat bakteri asam laktat dari buah sirsak
dibandingkan dengan bakteri pembanding yaitu Bakteri Lactobacillus plantarum.
Bakteri Lactobacillus plantarum digunakan sebagai pembanding karena bakteri ini
mempunyai aktivitas enzim β- galaktosidase yang cukup tinggi (Prihantini 2013).
Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue G250
(CBBG) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam
sehingga memberikan warna (kebiruan) dengan absorbansinya diukur pada λ 595
nm. Ikatan antara zat warna CBBG dan protein dapat terjadi karena adanya gaya van
der walls antara keduanya. Gaya van der walls ini terjadi karena adanya bagian
protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian zat warna dari CBBG yang bersifat
non polar dan mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian
hidrofobik protein. Kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen Bradford
sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil karena antara zat warna dan protein
terdapat kekuatan ionik yang memperkuat ikatan antara keduanya sehingga
membuat zat warna tersebut menjadi stabil. Pereaksi Bradford bereaksi terutama
dengan residu arginine dan bereaksi dengan histidin, lisin, tirosin, triptofan dan
residu fenilalanin (Bintang 2010) yang mungkin terkandung dalam ekstrak enzim
kasar. Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif
yang ditemukan pada protein.
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, didapatkan keenam isolat
bakteri asam laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β- galaktosidase. Ini
membuktikan bahwa isolate bakteri asam laktat yang berasal dari fermentasi buah
sirsak dapat dijadikan sumber baru dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase yang
bermanfaat bagi kesehatan terutama penderita intoleransi laktosa.
SIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan keenam
isolat bakteri asam laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β-
galaktosidase. Isolat SM6 memiliki aktivitas tertinggi sebesar 0,292 U/ml dengan
39
kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Untuk penelitian berikutnya, perlu dilakukan
penelitian lebih lanjut terhadap kondisi optimum pada produksi enzim β-
galaktosidase sehingga dapat menghasilkan enzim β-galaktosidase yang maksimal
serta dilakukan pemurnian enzim untuk mendapatkan aktifitas enzim β-
galaktosidase yang lebih tinggi.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai oleh Lembaga Penelitian dan Pengembangan UHAMKA
Tahun Anggaran 2019-2020.
REFERENSI
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga. Jakarta. Hlm. 103-104
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of
microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye
binding. Journal Analytical Biochemistry. 1(72): 248-254
Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 1985. Ilmu Pangan, Terjemahan:
Purnomo H, Adiono, Food Science. Jakarta.
Campbell AK, Waud JP, Matthews SB. 2005. The Molecular Basis of Lactose
Intolerance. Journal Science Progress. 88(3): 157-202
Diniyah N, Subagio A, Fauzi M. 2013. Produksi Minuman Fungsional Sirsak
(Annona muricata L.) dengan Fermentasi Bakteri Asam Laktat. Jurnal
Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Jember. Hlm. 1007-1012
Engler CR. 1985. Disruption of microbial cells. Journal comprehensive
Biotechnology, (Second Edition). Pergamon, UK. (2): 305–324
Fazriyani R. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat penghasil Enzim
β-galaktosidase dari Buah Durian. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains
Universitas Muhammadiyah Prof. DR. Hamka. Jakarta.
Harti AS. 2012. Dasar-dasar Mikrobiologi Kesehatan. Nuha Medika, Yogyakarta.
1(16): 109-111
Huang DQ, Prevost H, Divies C. 1995. Principal characteristics of ß-galactosidase
from Leuconostoc spp. J Int Dairy. 1(5): 29-43
Ibrahim A, Fridayanti A, Delvia F. 2015. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam
Laktat (BAL) dari Buah Mangga (Mangifera indica L.). Jurnal Ilmiah
Manuntung. Laboratorium Penelitian dan Pengembangan FARMAKA
TROPIS. Fakultas Farmasi Universitas Mulawarman. Kalimantan Timur.
1(2): 159-163
Kilara A, Shahani KM. 1975. Lactase activity of cultured and acidified dairy
products. Jurnal Dairy Sci. 59(12): 2031-2035
Lu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating β-
40
galactosidase from Lactobacillus Indigen B5. Process Biochemistry.
2(44): 232-236
Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. EGC, Jakarta.
Hlm. 98
Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Terjemahan: Hadioetomo
RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL. UI Press, Elements of
Microbiology.
Prihantini NN, Khusniati T, Bintang M, Choliq A, Sulistiani. 2013. Purifikasi Parsial
dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Lactobacillus Plantarum Strain D-
210. Jurnal Kedokteran Yarsi. Universitas Kristen Indonesia, Jakarta.
21(1): 014-026
Sari YNM, Syukur S, Jamsari. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Identifikasi DNA
Bakteri Asam Laktat (BAL) yang Berpotensi sebagai Antimikroba dari
Fermentasi Markisa Ungu (Passiflora edulis var. flavicarpa). Jurnal
Kimia FMIPA. Universitas Andalas. Hlm: 84.
Schnurer J, Magnusson J. 2005. Antifungal Lactic Acid Bacteria as
biopreservatives. Journal Trends Food Sci Technol. 16(1): 70-78.
Sinuhaji AB. 2006. Intoleransi Laktosa. Majalah Kedokteran Nusantara.
Departemen Ilmu Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran. Universitas
Sumatera Utara/Rumah Sakit H. Adam Malik, Medan. Hlm. 425
Surono IS. 2004. Probiotik: Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya,
Jakarta.
Toba T, Hayasaka I, Taguchi S, Adachi S. 1990. A new method for manufacture of
lactose-hydrolysed fermented milk. Journal of Science Food Agriculture.
52(3): 403–407
Utami DA, Syukur S, Darma A. 2011. Karakterisasi Molekular Bakteri Asam Laktat
(BAL) Probiotik dengan Gen 16s rRNA yang Berpotensi Menghasilkan
Bakteriosin dari Fermentasi Sirsak (Annona muricata L.) di Sumatera
Barat. Tesis. Universitas Andalas, Padang.
Yulia F. 2014. Isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak (Annona
muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya. Skripsi. Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang.
Winarno FG. 1999. Enzim Pangan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Yuningtyas S. 2008. Isolasi dan karakterisasi β-galaktosidase bakteri asam laktat
dari makanan hasil fermentasi. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan alam Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hlm: 1-2, 5
41
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM B-GALAKTOSIDASE BAKTERI
ASAM LAKTAT DARI FERMENTASI BUAH SIRSAK (ANNONA
MURICATA. L)
ISOLATION AND ACTIVITY TEST OF B-GALACTOSIDASE ENZYM LACTIC ACID
BACTERIA FROM FERMENTATION OF SOURSOP FRUIT (ANNONA MURICATA. L)
Fitri Yuniarti1*, Wahyu Hidayati1, Septi Setiawati1 , Khansa Nabilah1 1Universitas Muhammadiyah Prof DR Hamka, Jl Delima Raya II/IV Perumnas Klender, Jakarta Timur.13460
*Corresponding author: [email protected]
Abstrak
Bakteri asam laktat memiliki kemampuan dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase yang
berguna untuk penderita intoleransi laktosa. Salah satu sumber penghasil bakteri asam laktat adalah
buah sirsak (Annona Muricata. L) dengan kandungan glukosa yang cukup tinggi yang berguna untuk
pertumbuhan bakteri asam laktat, terutama pada proses fermentasi buah sirsak. Penelitian ini bertujuan
mendapatkan isolat bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak yang memiliki aktivitas enzim β-
galaktosidase. Produksi enzim β-galaktosidase menggunakan metode sonikasi. Uji aktivitas enzim
dilakukan dengan melihat kemampuan enzim β- Galaktosidase dalam menguraikan laktosa menjadi
monosakarida. Penelitian ini di awali dengan isolasi BAL dari fermentasi buah sirsak, kemudian
dilakukan karakterisasi Bakteri Asam Laktat secara makroskopis dan mikroskopis. Isolat BAL terpilih
dari hasil karakterisasi dilakukan pengukuran aktivitas enzim menggunakan spektrofotometer visible
42
dengan substrat o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) dan dilanjutkan uji kadar protein
dengan metode Bradford. Hasil isolasi didapatkan 6 isolat BAL dengan morfologi terbaik. Isolat SM6
memiliki aktivitas enzim tertinggi yaitu 0,292 U/ml dengan kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Dari data
diatas dapat disimpulkan bahwa buah sirsak mengandung bakteri asam lakat yang berpotensi menghasilkan
enzim β-galaktosidase. Hasil Penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi tambahan mengenai
bahan alam yang menjadi sumber Bakteri Asam Laktat penghasil enzim β- Galaktosidase yang nantinya
dapat dimanfaatkan bagi penderita intoleransi laktosa.
Kata kunci: Bakteri asam laktat; buah sirsak (annona muricate. L.); enzim β-galaktosidase; fermentasi.
Abstract
Lactic acid bacteria have the ability to produce β-galactosidase enzymes that are useful for patients with
lactose intolerance. One source of producing lactic acid bacteria is soursop (Annona Muricata. L) with
a fairly high glucose content which is useful for the growth of lactic acid bacteria, especially in the
fermentation process of soursop fruit. This study aims to obtain lactic acid bacterial isolates from
soursop fruit fermentation that has β-galactosidase enzyme activity. The production of the β-
galactosidase enzyme uses the sonication method. Enzyme activity testing is done by looking at the ability
of the β-galactosidase enzyme in breaking down lactose into monosaccharides. This research began with
BAL isolation from soursop fermentation, then macroscopic and microscopic characterization of Lactic
Acid Bacteria. LAB isolates selected from the results of the characterization were measured by enzyme
activity using a visible spectrophotometer with o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) substrate
and continued with protein content testing using Bradford method. The isolation results obtained 6 LAB
isolates with the best morphology. SM6 isolates had the highest enzyme activity at 0.292 U / ml with
protein content of 0.8092 mg / ml. From the above data it can be concluded that soursop contains lactic
acid bacteria which has the potential to produce β-galactosidase enzymes. The results of this study are
expected to be additional information about natural materials which are the source of Lactic Acid
Bacteria that produce β-galactosidase enzymes which can later be utilized for people with lactose
intolerance..
Keywords:Lactic acid bacteria; soursop fruit (annona muricate. L.); β-galactosidase enzyme;
fermentation.
PENDAHULUAN
Tanaman sirsak (Annona muricata L.) merupakan komoditas hasil pertanian yang banyak
ditanam di Indonesia. Kandungan karbohidrat yang tinggi pada buah sirsak merupakan sumber
yang potensial untuk mendapatkan bakteri asam laktat. Salah satu jenis karbohidrat pada buah
sirsak adalah gula pereduksi (glukosa dan fruktosa), yang merupakan sumber karbon utama
bagi mikroorganisme dalam proses fermentasi (Diniyah dkk. 2013). Menurut Buckle (1987),
fermentasi asam laktat terjadi karena adanya aktivitas bakteri asam laktat yang mengubah
glukosa menjadi asam laktat, sehingga jumlah bakteri asam laktat meningkat selama proses
fermentasi berlangsung yang akan diikuti dengan penurunan pH. Bakteri asam laktat (BAL)
merupakan bakteri Gram-positif yang mengeksresikan asam laktat sebagai produk akhir
fermentasi yang berperan sebagai preservasi bahan makanan (Schnurer dan Magnusson 2005).
Kelompok bakteri asam laktat merupakan salah satu kelompok bakteri yang mempunyai
enzim-enzim β-galaktosidase dan laktat dehidrogenase (Surono 2004). Enzim β- galaktosidase
43
merupakan enzim yang menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa dengan
memutus ikatan β-galaktosida pada ujung nonreduksi β-D-galaktosa. Secara alamiah, enzim β-
galaktosidase (laktase) terdapat pada usus halus manusia (Campbell et al. 2005). Kekurangan
laktase sementara pada individu dengan kadar β- galaktosidase normal juga dapat diakibatkan
oleh kerusakan pada lapisan usus yang disebabkan oleh infeksi virus atau bakteri, kemoterapi
kanker, kondisi alergi atau autoimun dan penurunan β- galaktosidase yang terkait dengan
penuaan (Sinuhaji 2006).
Enzim β-galaktosidase digunakan untuk menghidrolisis susu laktosa untuk mengatasi
masalah intoleransi laktosa oleh individu yang kekurangan laktase. Laktosa intoleran adalah
ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim ß-
galaktosidase yang rendah (Marsh dan Riley 1998). Laktosa tidak mudah diserap, tetapi harus
dihidrolisis oleh laktase (β-galaktosidase) menjadi monosakarida (mudah diserap usus). Jika
laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase, akan timbul gejala sakit perut, mulas,
kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). Untuk mengurangi masalah tersebut
penderita lactose intolerance dapat mengkonsumsi suplemen β- galaktosidase atau dengan
mengkonsumsi susu rendah laktosa. Karena semakin meningkatnya penderita intoleransi
laktosa pada saat ini, maka perlu dilakukan penelitian dan ditemukan sumber-sumber baru
penghasil enzim ß-galaktosidase yang terdapat dialam yang nantinya bisa digunakan sebagai
produk atau suplemen kesehatan bagi penderita intoleransi laktosa.
Secara luas, enzim β-galaktosidase dapat diperoleh dari beberapa sumber antara lain
mikroorganisme, tanaman, dan hewan. Enzim β-galaktosidase juga dapat diisolasi dari ragi
kelompok Kluyveromyces sp. dan fungi kelompok Aspergillus sp. (Harti 2015). Dibandingkan
dengan sumber tanaman dan hewan, enzim yang diisolasi dari mikroorganisme lebih mudah
dipisahkan dan dimurnikan setelah disekresikan ke dalam media pertumbuhan mikroorganisme
(Radji 2009). Informasi mengenai BAL yang diisolasi dari fermentasi buah dan sayur telah
banyak dipublikasikan, salah satunya adalah isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah
sirsak (Annona muricata L.) dan penentuan aktivitas antimikrobanya (Yulia 2014) yang telah
berhasil mengisolasi 7 isolat BAL. Namun, isolasi BAL yang berpotensi penghasil enzim β-
galaktosidase pada fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) belum pernah dilakukan.
Mengingat banyaknya manfaat dari BAL dan enzim ß-galaktosidase terhadap kesehatan maka
perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang isolasi BAL penghasil enzim β-galaktosidase dari
fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.). Berdasarkan hal ini diharapkan bakteri asam
laktat yang berhasil di isolasi pada penelitian ini dapat dijadikan sebagai sumber baru dalam
menghasilkan enzim β-galaktosidase yang bermanfaat bagi kesehatan terutama penderita
44
intoleransi laktosa. Selain itu buah sirsak hasil fermentasi juga membawa dampak positif di
dalam dunia industri dan kesehatan karena akan mengasilkan buah sirsak probiotik yang baik
untuk usus yang mengkonsumsinya.
MATERIAL DAN METODE
Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi Buah Sirsak
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah buah sirsak lokal (Annona muricata L.)
matang yang diperoleh dari Pasar Klender. Sebelum dilakukan isolasi, buah sirsak difermentasi
terlebih dahulu dengan cara isi buah dikeluarkan dan dibungkus dengan daun pisang steril,
ditempatkan dalam wadah fermentasi dan dikondisikan agar udara tidak masuk. Fermentasi
dilakukan pada suhu ruang selama 72 jam (Sari 2013). Hasil fermentasi ditimbang sebanyak 5
g dimasukkan ke dalam 45 mL MRSB, lalu dihomogenkan sehingga didapatkan pengenceran
10-1. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah inkubasi, sampel diencerkan
menggunakan media pepton water hingga pengenceran 10-9. Dari pengenceran 10-9, diambil
100 µl sampel dan ditanam dengan metode sebar pada cawan petri yang telah berisi media MRS
Agar. Inokulum disimpan dalam anaerob jar kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 48
jam pada suhu 37ºC.
Setelah 48 jam, single colony yang mencirikan BAL yaitu bulat licin berwarna putih
dipindahkan ke media MRS Agar baru untuk pemurnian koloni dengan metode streak yaitu
dengan menggunakan jarum ose kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC (Purwati
et al. 2005).
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan secara makroskopis yaitu identifikasi
morfologi bakteri asam laktat dan secara mikroskopis/pewarnaan gram.
Produksi Enzim β-galaktosidase
Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari MRSA slant dipindahkan ke dalam media produksi
yang sudah disterilisasi (MRSB dengan kandungan laktosa 1% dan pH medium: 8). Kemudian
media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Sel dipanen dengan cara disentrifugasi
dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Peletnya dicuci sebanyak dua
kali dengan buffer fosfat 0,1 M pH 7. Kemudian pemecahan sel dengan sonikator selama 5
menit pada suhu 4°C. Suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 15
menit pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh merupakan enzim β-galaktosidase kasar
(Fazriyani 2015).
45
Uji Aktivitas Enzim β-galaktosidase
Uji aktivitas ß-galaktosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1000 µL buffer fosfat 0,1
M pH 7 dan 100 µL enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diinkubasi pada suhu
37°C selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 200 µL o-nitrofenil-ß-D-galaktopiranosida
(oNPGal) 4 mg/mL dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Pada menit ke-15
ditambahkan 1000 µL Na2CO3 1 M. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-
Vis pada panjang gelombang 420 nm (Lu et al. 2009).
Penentuan Kadar Protein
Sebanyak 20 µL enzim β-galaktosidase ditambahkan 1 ml larutan Bradford. Larutan
dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada λ 595 nm.
Absorbansi yang diperoleh dikonversikan pada persamaan garis dari kurva standar BSA yang
telah dibuat, sehingga dapat diperoleh kadar protein dari enzim β-galaktosidase (Fazriyani
2015).
HASIL
Fermentasi Buah Sirsak
Pada tahap awal proses fermentasi, dilakukan secara anaerob karena bakteri asam laktat
bersifat anaerob fakultatif. Proses fermentasi ini dilakukan dengan tujuan untuk meningkatkan
jumlah bakteri asam laktat yang tumbuh secara spontan karena adanya nutrisi untuk
pertumbuhan bakteri asam laktat yang terkandung dalam buah sirsak terutama karbohidrat
berupa glukosa, fruktosa atau sukrosa (Utami 2011). Karbohidrat tersebut akan terurai menjadi
senyawa-senyawa sederhana seperti asam laktat, asam asetat, asam propionat dan etil alkohol
(Sari 2013).
Hasil fermentasi setelah 72 jam menunjukkan terjadinya perubahan pH dari sebelum dan
sesudah fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) . Terjadinya perubahan pH ini disebabkan
karena peningkatan jumlah mikroba penghasil asam sehingga terjadi proses oksidasi anaerobik
pada saat fermentasi yang menghasilkan alkohol serta beberapa senyawa asam (Sari 2013).
Proses fermentasi juga memberikan perubahan secara organoleptis terhadap buah sirsak seperti
warna, rasa, bau dan serat sirsak.
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Dalam melakukan isolasi dilakukan beberapa proses sampai didapatkan kultur murni isolat
bakteri asam laktat. Proses yang dilakukan meliputi pengenceran dengan rentang pengenceran
46
10-1 sampai 10-9. Hal ini bertujuan untuk memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang
tersuspensi dalam cairan. Larutan pengenceran yang digunakan adalah pepton water yang
berguna sebagai sumber karbon nitrogen dan vitamin untuk pertumbuhan dan perkembangan
bakteri dalam menghasilkan enzim yang diharapkan (Prihantini 2013).
Hasil pengenceran yang ditanamkan ke medium MRSA dalam cawan petri hanya hasil
pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyaknya koloni yang terdapat dalam hasil
pengenceran 10-1 sampai 10-6. Teknik isolasi dilakukan dengan menggunakan metode sebar agar
koloni yang tumbuh dapat tersebar secara merata pada bagian permukaan agar, sehingga
memudahkan dalam pengambilan koloni bakteri. Suspensi bakteri yang telah disebar kemudian
diinkubasi pada suhu 37oC yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri asam
laktat.
Hasil pengenceran yang ditanamkan ke medium MRSA dalam cawan petri hanya hasil
pengenceran 10-7 sampai 10-9 karena terlalu banyaknya koloni yang terdapat dalam hasil
pengenceran 10-1 sampai 10-6. Pemilihan koloni tunggal berdasarkan bentuk morfologi terbaik
yang mencirikan koloni BAL yaitu bulat, cembung, licin, dan bewarna putih susu. Isolat bakteri
asam laktat yang telah murni disimpan sebagai stok pada medium MRSA slant dalam tabung
reaksi dan diberikan kode isolat SM1 yang berasal dari pengenceran 10-7. Kode isolat SM2, SM3
dan SM4 berasal dari pengenceran 10-8 dan isolat yang berasal dari pengenceran 10-9 diberi kode
isolat SM5 dan SM6. Stok isolat disimpan untuk pengujian ke tahap selanjutnya.
47
Gambar 1. Hasil pemurnian bakteri asam laktat
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat
Isolat bakteri asam laktat yang telah murni selanjutnya dilakukan pengujian karakterisasi.
Uji karakterisasi bakteri asam laktat dilakukan dengan 2 cara yaitu identifikasi makroskopik
dan mikroskopik. Pada identifikasi makroskopik, koloni bakteri yang tumbuh diamati warna,
bentuk, tepian dan elevasi dari koloni. Koloni bakteri asam laktat yang diamati morfologinya
adalah koloni yang tumbuh pada medium MRSA dalam cawan petri. Hasil identifikasi secara
makroskopik memperlihatkan hasil berupa isolat koloni bewarna putih susu, bentuk bulat,
tepian licin dan elevasi cembung, dengan hasil mikroskopik yang menunjukkan sel bakteri
bewarna ungu (Gram positif) dan berbentuk basil. Isolat BAL hasil isolasi dari fermentasi buah
sirsak ini menunjukkan gambaran morfologi makroskopik dan mikroskopik yang sama dengan
BAL pada penelitian sebelumnya yang berasal dari buah sirsak dan buah mangga (Utami 2011;
Ibrahim 2015).
Isolat SM6 Isolat SM5
Isolat SM4 Isolat SM3
Isolat SM2 Isolat SM1
48
Produksi Enzim β-Galaktosidase
Produksi enzim β-galaktosidase dilakukan pada medium MRSB yang telah ditambahkan
laktosa 1%. Laktosa sebagai sumber energi, karbon, dan induser enzim ß-galaktosidase (Kilara
& Shahani 1975). Pada saat produksi, bakteri asam laktat dibiakan pada medium MRSB selama
24 jam. Menurut Prihantini (2013), inkubasi selama 24 jam merupakan waktu produksi enzim
β-galaktosidase yang optimum. Pada fase tersebut, sel membelah dengan laju konstan, jumlah
masa menjadi dua kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolit konstan dan
menghasilkan enzim untuk pertumbuhan (Pelczar & Chan 1986). Enzim ß-galaktosidase pada
bakteri asam laktat merupakan enzim intraseluler sehingga memerlukan pemecahan dinding sel
(Huang et al. 1993). Pemecahan dinding sel dilakukan dengan metode sonikasi. Sonikasi adalah
salah satu metode yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan metode lain untuk
gangguan dinding sel bakteri (Engler 1985) dan terbukti lebih efektif untuk melepaskan β-gal
(Toba et al. 1990; Sakakibara et al. 1994). Enzim kasar diperoleh dengan cara sentrifugasi
dengan mengambil bagian supernatan.
Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase
Aktivitas enzim β-galaktosidase dapat ditentukan dengan pembuatan kurva standar ONP
terlebih dahulu dengan rentang konsentrasi 0-2.5mM yang bertujuan untuk menentukan
konsentrasi enzim β-galaktosidase pada isolat bakteri asam laktat yang akan diuji. Satu unit
aktivitas enzim β-galaktosidase dinyatakan dalam banyaknya enzim yang diperlukan untuk
menghasilkan 1 µmol ONP dari subtrat ONPG per menit pada kondisi percobaan (Miller 1972).
Berdasarkan hasil percobaan, nilai aktivitas enzim β-galaktosidase yang diperoleh dari bakteri
pembanding lebih besar dibandingkan dengan isolat bakteri asam laktat yaitu 0,776 U/ml. Nilai
aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi dihasilkan oleh isolat SM6 yaitu 0,292 U/ml,
sedangkan nilai aktivitas enzim β- galaktosidase terendah dihasilkan oleh isolat SM3 yaitu
0,232 U/ml.
49
Uji Kadar Protein Enzim β-Galaktosidase
Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode Bradford. Uji protein
keenam isolat bakteri asam laktat dan bakteri pembanding dilakukan secara triplo. Kadar
protein tertinggi ditunjukan pada isolat bakteri SM6 yang memiliki nilai rata-rata kadar protein
sebesar 0,8092 mg/ml, sedangkan yang terendah ditunjukan pada isolat bakteri SM3 yaitu
sebesar 0,6690 mg/ml . Jika dibandingkan dengan kadar protein L. plantarum, kadar protein
keenam isolat lebih rendah. Hal ini disebabkan oleh tingginya produksi enzim pada
L.plantarum.
PEMBAHASAN
Pengujian aktivitas enzim β-galaktosidase menggunakan substrat kromogenik yaitu o-
nitrophenyl-ß-D-Galactoside (ONPG). Senyawa ONPG tidak berwarna, namun dengan adanya
β-Galaktosidase, diubah menjadi galaktosa dan o- nitrophenol. O-nitrophenol berwarna kuning
dan bisa diukur penyerapannya pada panjang gelombang 420 nm. Jika konsentrasi ONPG
cukup tinggi, maka jumlah o-nitrophenol yang dihasilkan sebanding dengan jumlah enzim β-
galaktosidase yang ada pada saat enzim β-galaktosidase bereaksi dengan ONPG. Reaksi
dihentikan dengan menambahkan larutan Na2CO3, yang mengubah pH larutan menjadi basa
yaitu sekitar pH 10-11 karena pada pH ini enzim ß-galaktosidase tidak aktif (Yuningtyas 2008).
Aktivitas enzim isolat bakteri asam laktat dari buah sirsak dibandingkan dengan bakteri
pembanding yaitu Bakteri Lactobacillus plantarum. Bakteri Lactobacillus plantarum
digunakan sebagai pembanding karena bakteri ini mempunyai aktivitas enzim β- galaktosidase
yang cukup tinggi (Prihantini 2013).
Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue G250 (CBBG) yang
berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan warna
(kebiruan) dengan absorbansinya diukur pada λ 595 nm. Ikatan antara zat warna CBBG dan
50
protein dapat terjadi karena adanya gaya van der walls antara keduanya. Gaya van der walls ini
terjadi karena adanya bagian protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian zat warna dari
CBBG yang bersifat non polar dan mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya
ke bagian hidrofobik protein. Kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen Bradford
sangat cepat terbentuk dan bersifat stabil karena antara zat warna dan protein terdapat kekuatan
ionik yang memperkuat ikatan antara keduanya sehingga membuat zat warna tersebut menjadi
stabil. Pereaksi Bradford bereaksi terutama dengan residu arginine dan bereaksi dengan
histidin, lisin, tirosin, triptofan dan residu fenilalanin (Bintang 2010) yang mungkin terkandung
dalam ekstrak enzim kasar. Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan
muatan positif yang ditemukan pada protein.
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, didapatkan keenam isolat bakteri asam
laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β- galaktosidase. Ini membuktikan bahwa
isolate bakteri asam laktat yang berasal dari fermentasi buah sirsak dapat dijadikan sumber baru
dalam menghasilkan enzim β-galaktosidase yang bermanfaat bagi kesehatan terutama penderita
intoleransi laktosa.
SIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan keenam isolat bakteri
asam laktat yang diperoleh mampu memproduksi enzim β- galaktosidase. Isolat SM6 memiliki
aktivitas tertinggi sebesar 0,292 U/ml dengan kadar protein sebesar 0,8092 mg/ml. Untuk
penelitian berikutnya, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap kondisi optimum pada
produksi enzim β-galaktosidase sehingga dapat menghasilkan enzim β-galaktosidase yang
maksimal serta dilakukan pemurnian enzim untuk mendapatkan aktifitas enzim β-galaktosidase
yang lebih tinggi.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai oleh Lembaga Penelitian dan Pengembangan UHAMKA Tahun
Anggaran 2019-2020.
REFERENSI
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga. Jakarta. Hlm. 103-104 Bradford MM.
1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Journal Analytical
Biochemistry. 1(72): 248-254
Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M. 1985. Ilmu Pangan, Terjemahan: Purnomo
H, Adiono, Food Science. Jakarta.
Campbell AK, Waud JP, Matthews SB. 2005. The Molecular Basis of Lactose Intolerance.
51
Journal Science Progress. 88(3): 157-202
Diniyah N, Subagio A, Fauzi M. 2013. Produksi Minuman Fungsional Sirsak (Annona muricata
L.) dengan Fermentasi Bakteri Asam Laktat. Jurnal Fakultas Teknologi Pertanian
Universitas Jember. Hlm. 1007-1012
Engler CR. 1985. Disruption of microbial cells. Journal comprehensive Biotechnology,
(Second Edition). Pergamon, UK. (2): 305–324
Fazriyani R. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat penghasil Enzim β-
galaktosidase dari Buah Durian. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains Universitas
Muhammadiyah Prof. DR. Hamka. Jakarta.
Harti AS. 2012. Dasar-dasar Mikrobiologi Kesehatan. Nuha Medika, Yogyakarta. 1(16): 109-
111
Huang DQ, Prevost H, Divies C. 1995. Principal characteristics of ß-galactosidase from
Leuconostoc spp. J Int Dairy. 1(5): 29-43
Ibrahim A, Fridayanti A, Delvia F. 2015. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat (BAL)
dari Buah Mangga (Mangifera indica L.). Jurnal Ilmiah Manuntung. Laboratorium
Penelitian dan Pengembangan FARMAKA TROPIS. Fakultas Farmasi Universitas
Mulawarman. Kalimantan Timur. 1(2): 159-163
Kilara A, Shahani KM. 1975. Lactase activity of cultured and acidified dairy products. Jurnal
Dairy Sci. 59(12): 2031-2035
Lu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating β- galactosidase
from Lactobacillus Indigen B5. Process Biochemistry. 2(44): 232-236
Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar. EGC, Jakarta. Hlm. 98
Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Terjemahan: Hadioetomo RS, Imas
T, Tjitrosomo SS, Angka SL. UI Press, Elements of Microbiology.
Prihantini NN, Khusniati T, Bintang M, Choliq A, Sulistiani. 2013. Purifikasi Parsial dan
Karakterisasi β-Galaktosidase dari Lactobacillus Plantarum Strain D-210. Jurnal
Kedokteran Yarsi. Universitas Kristen Indonesia, Jakarta. 21(1): 014-026
Sari YNM, Syukur S, Jamsari. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Identifikasi DNA Bakteri Asam
Laktat (BAL) yang Berpotensi sebagai Antimikroba dari Fermentasi Markisa Ungu
(Passiflora edulis var. flavicarpa). Jurnal Kimia FMIPA. Universitas Andalas. Hlm:
84.
Schnurer J, Magnusson J. 2005. Antifungal Lactic Acid Bacteria as biopreservatives. Journal
Trends Food Sci Technol. 16(1): 70-78.
Sinuhaji AB. 2006. Intoleransi Laktosa. Majalah Kedokteran Nusantara. Departemen Ilmu
Kesehatan Anak Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatera Utara/Rumah Sakit H.
Adam Malik, Medan. Hlm. 425
Surono IS. 2004. Probiotik: Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya, Jakarta.
Toba T, Hayasaka I, Taguchi S, Adachi S. 1990. A new method for manufacture of lactose-
hydrolysed fermented milk. Journal of Science Food Agriculture. 52(3): 403–407
52
Utami DA, Syukur S, Darma A. 2011. Karakterisasi Molekular Bakteri Asam Laktat (BAL)
Probiotik dengan Gen 16s rRNA yang Berpotensi Menghasilkan Bakteriosin dari
Fermentasi Sirsak (Annona muricata L.) di Sumatera Barat. Tesis. Universitas
Andalas, Padang.
Yulia F. 2014. Isolasi bakteri asam laktat dari fermentasi buah sirsak (Annona muricata L.) dan
penentuan aktivitas antimikrobanya. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang.
Winarno FG. 1999. Enzim Pangan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Yuningtyas S. 2008. Isolasi dan karakterisasi β-galaktosidase bakteri asam laktat dari makanan
hasil fermentasi. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan alam Institut
Pertanian Bogor, Bogor. Hlm: 1-2, 5
53
45