LABORATORIUM KIMIA DASAR

SEMESTER GENAP TAHUN AJARAN 2012/2013

Praktikum : KROMATOGRAFI

Modul : Kromatografi Cair Vakum

Pembimbing : Endang Widyastuti

Oleh :

Kelompok : 8

Nama : Amanda Aulia Prima NIM. 111431002

Claudia NIM. 111431005

Fuji Surya Gumilar NIM. 111431012

Kelas : 2A

PROGRAM STUDI DIPLOMA III ANALIS KIMIA

JURUSAN TEKNIK KIMIA

POLITEKNIK NEGERI BANDUNG

2013

Praktikum : 15 Maret 2013

Penyerahan : 22 Maret 2013

(Laporan)

I. Judul Praktikum

Kromatografi Cair Vakum

II. Pembimbing Praktikum

Endang Widyastuti

III. Tujuan

1. Memahami prinsip Kromatografi Cair Vakum (KCV) dan melakukan pemisahan

dengan metoda KCV.

2. Mampu melakukan pemisahan dan mengidentifikasi sampel dengan metoda KCV.

IV. Dasar Teori

Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen

campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang

membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Pada fasa

kromatografi cair, fasa geraknya berupa zat cair.

Kromatografi cair vakum atau vacuum liquid chromatography (VLC) pertama

kali diperkenalkan oleh Coll et al., pada tahun 1977. Kromatografi vakum cair

menggunakan silika gel 60 (63-200 μm, Merck®). Kolom kromatografi dikemas kering

(biasanya dengan penyerap mutu 10-40 μm, Merck®) dalam keadaan vakum agar

diperoleh kerapatan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah

dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi (Hostettmann et al., 1997).

            Teknik ini berdasarkan pertimbangan pada kromatografi lapis tipis preparatif

yang dijalankan dalam bentuk kolom kromatografi dengan menggunakan vakum untuk

mempercapat aliran eluen. Ini berbeda dengan flash chomatography, dalam kolom VLC

dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi kemudian dikeringkan dan dielusi

kembali dengan eluen yang lebih polar (Hostettmann et al., 1997).

Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau pada

tekanan lebih besar dari atmosfer dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya

gas nitrogen. Kromatografi cair vakum menggunakan tekanan rendah untuk

meningkatkan laju aliran fase geraknya.

Kromatografi cair vakum menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai

perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) : DCM dan

menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen.

Kromatografi cair-vakum merupakan kromatografi kolom yang dikemas kering

pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya

berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar

diperoleh kerapatan maksimum. Setelah diperoleh kemasan yang maksimum, kemudian

vakum dihentikan dan pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan kedalam permukaan

penjerap lalu divakum lagi, kolom dihisap sampai kering dan kolom sekarang siap

dipakai. Alat yang digunakan terdiri dari corong, sumbat karet, pengisap yang

dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi.

Prinsip kerja dari Kromatografi Cair Vakum (KCV) adalah adsorpsi atau serapan,

sedangkan pemisahannya didasarkan pada senyawa-senyawa yang akan dipisahkan

terdistribusi di antara fasa diam dan fasa gerak dalam perbandingan yang berbeda-beda.

Elusi diawali dengan pelarut non polar dilarutkan dengan kombinasi pelarut dengan

polaritas meningkat. Masing-masing pelarut dituangkan ke permukaan kolom kemudian

dihisapkan pompa vakum. Masing-masing ekstrak ditampung dalam wadah terpisah

sehingga menghasilkan sejumlah fraksi.

V. Alat dan Bahan

Alat Bahan

Kolom kaca KCV Aquades

Erlenmeyer 250 mL Silika gel

Gelas kimia 100 mL Methilen blue

Kuvet Rhodamin B

Spektrofotometer Shimadzu DCM

Tabung reaksi Methanol

VI. Langkah Kerja

a. Persiapan Sampel

Mengaduk hingga rata campuran sampel dengan silica gel hingga kering

Sampel siap digunakan

Mencampurkan silica gel dengan campuran rhodamin B dan metilen biru

b. Pemisahan sampel menggunakan KCV

Memasang alat sesuai rangkaian

Memasukkan silica gel kedalam kolom KCV sebanyak 2/3 tinggi

kolom

Memasukkan sampel yang telah disiapkan kedalam kolom

Menutup bagian atas kolom dengan corong gelas lalu memasukkan eluen (larutan pengembang) dimulai dari yang non-polar (DCM 100%) ke polar (methanol)

Eluen yang pertama ditambahkan adalah DCM 100%, lalu DCM : methanol sebanyak 75:25 ; 50:50 ; 25:75 ;15:18 ; 5:95 ; 0:100

Semua larutan yang turun ditampung dalam Erlenmeyer. Larutan dipisahkan sesuai dengan eluennya

VII. Data Pengamatan

Pelarut Pengamatan Gambar

DCM 100%

Pada kolom terlihat mulai terjadi pemisahan

fraksi warna, umumnya terdiri dari 3 warna yaitu

bening, biru dan pink tua.

Setelah ditampung, terlihat fraksi warna yang

terlihat berwarna biru tua.

Mengamati pemisahan yang terjadi pada kolom dan mengamati larutan yang tertampung dalam erlenmeyer

Menguji pemisahan dengan menggunakan Spektrofotometer UV- Vis Shimadzu

DCM:Metanol=75%:25%

Fraksi biru pada kolom semakin menurun, perlahan

hilang. Yang terlihat hanya fraksi bening dan pink.

Fraksi warna yang tertampung adalah warna biru

bening (pudar).

DCM :Metanol=50%:50%Pada kolom, terlihat fraksi berwana pink yang

perlahan turun.

Fraksi warna yang tertampung berwarna pink.

DCM :Metanol=25%:75%

Bagian atas kolom mulai bening, yang tersisa fraksi

berwarna pink.

Yang tertampung adalah fraksi warna pink

kejinggaan.

DCM:Metanol=15%:85%

Kolom perlahan bersih kembali, fraksi berwarna

pink tersisa di bagian bawah kolom.

Yang tertampung adalah fraksi pink cerah.

DCM:Metanol=5%:95%Hanya tertinggal sedikit sekali zat warna pada kolom.

Yang tertampung fraksi pink pucat.

Metanol 100%

Kolom hampir bersih, yang tertampung berwarna

bening sedikit sekali pink.

C. Analisa kualitatif menggunakan Spektrofotometer UV-Vis Shimadzu

Panjang gelombang maksimum rhodamin b (literatur) : 542 nm

Panjang gelombang maksimum metilen blue (literatur) : 660 nm

Komposisi

Eluen

Sampel 1Warna efluen

λmax Abs

DCM 100% 587,00,17

8Biru tua

DCM : Metanol

75% : 25%577,0

0,15

8Biru muda

DCM : Metanol

50% : 50%551

0,73

8Merah muda

DCM : Metanol

25% : 75% 5113,43

6

Merah muda

DCM : Metanol

15% : 85%550

1,97

7Merah muda

DCM : Metanol

5% : 95%548

0,09

0Merah muda

Metanol 100% 5460,01

7Merah muda

VIII. Pembahasan

Metode kromatografi dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan komponen-

komponen yang ada dalam suatu zat atau bahan. Pada praktikum ini, digumakan metode

kromatografi cair vakum yang menggunakan prinsip hampir serupa dengan metode

kromatografi kolom. Perbedaannya adalah pada kromatografi cair vakum menggunakan

alat vakum seperti pompa, sehingga fasa gerak yang dimasukkan kedalam kolom dapat

bergerak atau terdistribusi lebih cepat.

Fasa diam adalah berupa silica gel kering dalam kolom, sedangkan eluen yang

digunakan adalah campuran pelarut (DCM:Metanol) dengan berbagai perbandingan.

Variasi perbandingan ini dilakukan untuk mengetahui pada perbandingan pelarut

campuran berapa, komponen dalam sampel akan terpisah Prinsip pengerjaan dari metode

ini adalah dengan menempatkan suatu sampel dalam fasa diam yang kemudian akan

terbawa oleh fasa gerak dengan menggunakan bantuan pompa vakum untuk mempercepat

distribusi fasa gerak dan sampel melewati fasa diam sampai terjadi pemisahan sampel

berdasarkan tingkat kepolaran tiap komponennya. Sampel yang digunakan adalah

campuran Rhodamin B dan Methilen blue Komponen yang terpisah, kemudian dilakukan

uji kualitatif untuk menentukan kemurnian tiap komponen dengan metode

spektrofotometer.

Sampel yang digunakan, sebelumnya perlu dipreparasi terlebih dahulu sebelum

masuk dalam kolom. Sampel yang berupa cairan, ditambahkan silica gel hingga kering

yang menunjukkan sudah terserapnya seluruh sampel dalam silica gel. Setelah itu, sampel

baru bisa digunakan untuk pemisahan.

Sebelum sampel dimasukkan ke dalam kolom, dilakukan penambahan pelarut

(DCM 100%), agar silica gel dalam keadaan basah oleh pelarut dan siap (aktif) untuk

melakukan pemisahan. Sampel kering dimasukkan dalam kolom, kemudian eluen

ditambahkan. Pemisahan dilakukan dengan bantuan water jet pump untuk mempercepat

waktu eluen dan sampel keluar dari kolom. Komponen senyawa yang diserap lemah oleh

fasa diam akan keluar lebih cepat bersama eluen sedangkan komponen yang diserap kuat

akan keluar lebih lama dari kolom. Permukaan silica gel tidak dibiarkan mengering,

untuk menghindari terjadinya difusi antara fasa gerak dengan fasa diamnya. Terjadinya

difusi antara fasa diam dengan fasa gerak akan mempengaruhi kecepatan eluen untuk

turun keluar meninggalkan kolom.

Di dalam kolom akan terjadi kesetimbangan dinamis antara komponen teradsorbsi

pada fasa diam dengan komponen yang terlarut dalam fasa gerak. Setiap komponen

mempunyai koefisien distribusi yang berbeda sehingga kecepatan migrasinya pun akan

berbeda. Perbedaan kecepatan migrasi menyebabkan terjadinya pemisahan komponen

dalam campuran. Komponen-komponen yang terpisah akan ditampung, kemudian

dilakukan uji kualitatif lanjutan untuk mengetahui kemurnian tiap komponen yang

terpisahkan. Dalam hal ini, komponen yang diambil merupakan komponen dari hasil

pemisahan masing-masing variasi perbandingan pelarut yang digunakan.

Sampel yang akan dipisahkan berwarna ungu tua, karena campuran antara

rhodamin b dengan metilen biru dengan perbandingan 1:3. Kemudian sampel dipisahkan

dengan menggunakan eluen DCM : Metanol dengan berbagai perbandingan mulai dari

DCM 100%, 75% : 25%, 50% : 50%, 25% : 75%, 15% : 85%, 5% : 95%, dan 100%

metanol. Pada konsentrasi DCM 100% terjadi pemisahan warna menjadi jingga

kemerahan dan biru dengan fraksi warna biru tua yang turun terlebih dahulu. Kemudian

selanjutnya dengan menggunakan eluen dengan konsentrasi yang berbeda yaitu 75% :

25%, warna yang keluar terlebih dahulu adalah warna biru tetapi intensitas warnanya

lebih terang dari sebelumnya. Selanjutnya dengan menggunakan eluen 50% : 50%, efluen

yang keluar berwarna merah muda. Pada konsentrasi ini rhodamin B mulai berikatan

dengan eluen. Warna merah muda pada efluen terus muncul pada setiap konsentrasi eluen

yang berbeda dengan intensitas warna yang berbeda pula.

Berdasarkan data yang diperoleh fraksi warna yang intensitas warnanya lebih

besar, terjadi pada perbandingan konsentrasi 25% DCM dengan 75% metanol dengan

panjang gelombang 511 dan absorbansi 3,436. Pada konsentrasi ini rhodamin B berikatan

secara maksimal dengan eluen DCM : Metanol.

Fraksi warna biru yang keluar menunjukkan bahwa afinitas metilen biru lebih

besar terhadap eluen dengan konsentrasi DCM yang lebih besar dari konsentrasi metanol,

hal ini menunjukkan bahwa metilen biru mempunyai kepolaran yang berbeda

dibandingkan dengan rhodamin B yang kepolarannya lebih besar. Oleh sebab itu warna

biru lebih cepat keluar dibandingkan dengan warna merah muda yang lebih lama

meninggalkan kolom. Lamanya fraksi warna merah muda meninggalkan kolom,

menunjukkan bahwa warna merah muda terjerap kuat oleh fasa diamnya.

Peristiwa ini dipengaruhi oleh kepolaran dari larutan eluen yang digunakan.

Larutan eluen DCM (Dicloromethan) mempunyai kepolaran yang lebih rendah dari

larutan metanol yang merupakan larutan polar. Sehingga pada saat kedua eluen ini

dicampurkan, maka eluen campuran ini akan mempunyai kepolaran yang berbeda. Selain

kepoloran larutan eluen yang mempengaruhi keterpisahan warna pada kolom, aspek yang

turut mempengaruhi pemisahan warna yang terjadi adalah kelarutan sampel terhadap

eluen yang digunakan.

Efluen yang ditampung dengan berbagai fraksi warna yang diperoleh diuji dengan

menggunakan alat spektrofotometer untuk mengetahui intensitas warna hasil dari

pemisahan.

IX. Kesimpulan

1. Metilen biru mulai terpisah pada konsentrasi DCM 100% dan terpisah seluruhnya

pada konsentrasi 25% DCM : 75% Metanol.

2. Rhodamin B mulai larut dan keluar kolom pada konsentrasi 50% DCM : 50%

Metanol.

3. Metilen biru mempunyai afinitas yang kuat terhadap fasa gerak dibandingkan dengan

afinitas rhodamin B yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap fasa diam.

X. Daftar Pustaka

Hendayana Sumar, Ph.D. 2006. “Kimia Pemisahan : Metoda Kromatografi dan

Elektroforesis Modern”. PT. Remaja Rosdakarya. Bandung.

Basset, J., R. C. Denny, G. H. Jeffrey & J.. 1994. “Buku Ajar Vogel:Kimia

Analisis Kuantitatif Anorganik”. Penerbit Buku Kedokteran.

http://sersan-mulyono.blogspot.com/2011/04/sekunder-dengan-kromatografi-vakum-

cair_03.html (diunduh pada tanggal 21 Maret 2013).

http://data-farmasi.blogspot.com/2011/02/bab-i-pendahuluan-1.html ( diunduh pada tanggal 21 Maret 2013).

Lampiran

Tabel sifat-sifat pelarut umum

Solvent Rumus kimia Titik didih Konstanta Dielektrik Massa jenis

Pelarut Non-Polar

Heksana CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 69 °C 2.0 0.655 g/ml

Benzena C6H6 80 °C 2.3 0.879 g/ml

Toluena C6H5-CH3 111 °C 2.4 0.867 g/ml

Dietil eter CH3CH2-O-CH2-CH3 35 °C 4.3 0.713 g/ml

Kloroform CHCl3 61 °C 4.8 1.498 g/ml

Etil asetat CH3-C(=O)-O-CH2-CH3 77 °C 6.0 0.894 g/ml

Pelarut Polar Aprotic

1,4-Dioksana /-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-\ 101 °C 2.3 1.033 g/ml

Tetrahidrofuran (THF) /-CH2-CH2-O-CH2-CH2-\ 66 °C 7.5 0.886 g/ml

Diklorometana (DCM) CH2Cl2 40 °C 9.1 1.326 g/ml

Asetona CH3-C(=O)-CH3 56 °C 21 0.786 g/ml

Asetonitril (MeCN) CH3-C≡N 82 °C 37 0.786 g/ml

Dimetilformamida (DMF) H-C(=O)N(CH3)2 153 °C 38 0.944 g/ml

Dimetil sulfoksida (DMSO) CH3-S(=O)-CH3 189 °C 47 1.092 g/ml

Pelarut Polar Protic

Asam asetat CH3-C(=O)OH 118 °C 6.2 1.049 g/ml

n -Butanol CH3-CH2-CH2-CH2-OH 118 °C 18 0.810 g/ml

Isopropanol (IPA) CH3-CH(-OH)-CH3 82 °C 18 0.785 g/ml

n -Propanol CH3-CH2-CH2-OH 97 °C 20 0.803 g/ml

Etanol CH3-CH2-OH 79 °C 30 0.789 g/ml

Metanol CH3-OH 65 °C 33 0.791 g/ml

Asam format H-C(=O)OH 100 °C 58 1.21 g/ml

Air H-O-H 100 °C 80 1.000 g/ml