MEDIA PERTUMBUHAN

ISOLASI DAN INOKULASI MIKROORGANISME15

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar BelakangMikroorganisme di alam tersebar luas, mulai dari tempat terdingin dikutub sampai di dalam tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. Hal tersebut mengakibatkan sulitnya pengamatan mikroba secara spesifik. Oleh sebab itu diperlukan teknik isolasi dan pemurnian agar didapatkan media murni. Bakteri berasal dari bahasa latin bacterium (jamak : bacteria), adalah kelompok raksasa dari organisme hidup, berukuran sangat kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatifsederhana tanpa nucleus atau inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Bakteri adalah yang paling berlimpah dari semua organisme. Mereka tersebar (berada dimana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dan organisme lain.

Bakteri adalah salah satu contoh mikroorganisme yang penting dan memiliki bentuk yang beragam. Pada umumnya bakteri berhubungan dengan makanan. Adanya bakteri dalam bahan pangan dapat mengakibatkan pembusukan yang tidak diinginkan atau menimbulkan penyakit yang ditularkan melalui makanan atau dapat melangsungkan fermentasi yang menguntungkan. Di alam fungi dan yeast/khamir juga tidak pernah berada di suatu tempatanya dalam satu spesies. Karena itu untuk memperoleh populasi fungi dan yeast/khamir dalam kultur murni, juga harus dilakukan teknik isolasi danpemurnian. Metodenya serupa bakteri, sumber fungi hampir sama dengan bakteri. Perbedaannya bahwa populasi fungi di air lebih sedikit dibandingkan lingkungan dengan pH rendah. Pertumbuhan fungi pada medium menunjukkan penampakkan yang pada umumnya berupa benang-benang putih dan sangat mudah untuk dilihat. Sedangkan yeast/khamir akan tampak seperti koloni bakteri yang tidak mengkilap. Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.B. TujuanTujuan pada pratikum ini adalah :

1. Untuk mengetahui metode-metode yang digunakan untuk memisahkan mikroba tertentu dari populasi campurannya untuk mendapatkan kultur murni.2. Untuk mengetahui karakteristik mikroba yang tumbuh pada kultur murni.

C. ManfaatManfaat dari praktikum ini adalah :1. Memahami metode-metode yang digunakan untuk memisahkan mikroorganisme tertentu dari populasi campurannya untuk mendapatkan kultur murni.2. Memahami karakteristik mikroba yang tumbuh pada kultur murni.BAB II

TINJAUAN PUSTAKAA. Teori UmumNama bakteri berasal dari kata bakterion (bahasa Yunani) yang berarti tongkat atau batang. Sejalan dengan pertambahnya pengetahuan, sekarang bakteri digunakan untuk mikroorganisme bersel satu, berkembang biak dengan pembelahan diri, serta memiliki ukuran mikron sehingga hanya tampak dengan mikroskop. Bakteri aerob merupakan bakteri yang membutuhkan O2 untuk pertumbuhannya. Sistem enzimnya membutuhkan O2 sebagai elektron aseptor pada proses fosforilasi oksidatifnya. Secara alami, mikroba di alam ditemukan dalam populasi campuran. Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan isolasi yang diawali dengan pengenceran bertingkat. Proses isolasi mikroba adalah memisahkan mikroba satu dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi dan sifat mikroba lainnya(Puspitasari dkk, 2012).Kultur yang menunjukkan indikasi adanya pertumbuhan bakteri pengoksidasi amonia diambil dan diisolasi secara tabur. Kultur tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3-5 hari. Isolat yang tumbuh kemudian dimurnikan dan dipindahkan pada media agar miring. Isolat yang diperoleh diseleksi kemampuan tumbuhnya dengan cara menumbuhkannya dalam erlenmeyer yang berisi 50 ml media basal. Kultur tersebut diinkubasi pada suhu ruang diatas penggoyang (shaker). Pertumbuhan bakteri pengoksidasi amonia ditentukan dengan mengukur perubahan amonia dan pembentukan nitrit secara kualitatif, menggunakan indikator penentu ammonium dan indikator penentu nitrit (Agustiyani dkk,2004).Bakteri pendegradasi phenanthrene diisolasi pada medium minimum agar ONR7a dengan menggunakan metode sebar (spread). Medium yang telah diinokulasikan kemudian disublimasi dengan cara memanaskan senyawa phenanthrene pada suhu optimum yaitu 100C selama 10 menit. Kondisi demikian menyebabkan senyawa tersebut menguap, lalu tertangkap pada medium yang diberi pendingin berupa batu es (Gambar 2). Pemberian batu es di atas medium yang telah diinokulasi untuk mencegah mencairnya medium agar karena terkena uap panas senyawa phenanthrene. Medium yang telah disublimasi kemudian diinkubasi selama 7 hari pada temperatur 300C. Bakteri yang dapat mendegradasi senyawa phenanthrene ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekeliling koloni (Riffiani,2010).Inokulasi adalah proses penempatan eksplan atau spora jamur pada media PDA dalam kondisi aseptik Caranya, eksplan atau spora dimasukkan kedalam media PDA dalam tabung reaksi. Setelah itu, mulut tabung langsung ditutup dengan kapas untuk menghindari kontaminasi. Proses inokulasi ini juga dilakukan di dalam ruang atau kotak inokulasi (Rahmat dan Nurhidayat, 2011).Kultur Piyrosporum ovale dengan menggunakan metode agar miring, dimana pengkulturan dilakukan pada LAF (Laminar Air Flow) dan semua alat yang digunakan telah disterilkan dahulu dengan menggunakan autoklaf. Satu ose kamir berumur 2 hari digoreskan pada medium agar SDA di dekat api bunsen, setelah itu ditutup dengan kapas steril dan diinkubasi selama 48 jam di dalam inkubator dengan suhu 37oC untuk kemudian digunakan pada uji antifungi (Mahataranti,2012).Metode agar tuang,seperti halnya metode perhitungan jumlah kuman hidup lainnya, dilakukan dengan mencampurkan sampel pada media padat yang mendukung pertumbuhan mikroorganisme, dan kemudian menginkubasi pelat sehingga setiap sel bakteri dapat membelah dan dapat membentuk koloni. Dengan demikian, jumlah koloni yang tumbuh tersebut dapat dihitung. Karena kita pada umumnya tidak mempunyai gambaran tentang jumlah bakteri dalam sampel, penyiapan pengenceran berseri hampir selalu dibutuhkan untuk memastikan bahwa kita akan mendapatkan pengenceran dengan jumah bakteri yang dapat dihitung (Harmita dan Radji,2008).Indikator waktu inkubasi optimum adalah waktu dimana senyawa antimikroba bakteriosin diproduksi optimal yang ditandai dengan besarnya zona bening yang terbentuk di sekitar sumur pada semua mikroba uji. Hasil uji aktivitas antimikroba supernatan Lactobcillus sp.RED4 dapat menghasilkan antimikroba bakteriosin, yang ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat disekitar koloni bakteri uji (Khoiriyah dkk,2014).B. Uraian Bahan

1. Agar (Ditjen POM Edisi III,1979)

Nama resmi

: AGAR

Pemerian: Tidak berbau atau bau lemah, berasa

musilago pada lidah.

Kelarutan: Tidak larut dalam air dingin, dan larut dalam

air mendidih.

Kegunaan : Sebagai bahan pemadat medium.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup baik.2. Pepton (Ditjen POM Edisi III,1979)

Pemerian:Serbuk ; kuning kemerahan sampai coklat; bau khas tidak busuk

Kelarutan:Larut dalam air ; memberikan larutan coklat kekuningan yang bereaksi agak asam ; praktis tidak larut dalam etanol ( 95% ) P dan dalam eter P.

Kegunaan

: Sumber protein untuk pertumbuhan mikroorganisme.

Penyimpanan: Simpan dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya.3. Ekstrak Beef (Ditjen POM Edisi III,1979)

Nama resmi : BEEF EXTRACT

Pemerian: Berbau dan berasa pada lidah. Kaldu daging sapi konsentrat diperoleh dengan mengekstraksi daging sapi segar tanpa lemak, dengn cara merebus dalam air dan menguapkan kaldu pada suhu rendah dalam hampa udara sampai terbentuk residu kental berbentuk pasta. Massa berbentuk pasta, berwarna coklat kekuningan sampai coklat tua, bau dan rasa seperti daging, sedikit asam.

Kelarutan

: Larut dalam air dingin.

Kegunaan: Sumber protein untuk pertumbuhan mikroorganisme.

Penyimpanan: Simpan dalam wadah tertutup rapat, tidak

tembus cahaya.

4. Aquadest (Ditjen POM Edisi III,1979)

Nama resmi

: AQUA DESTILLATA

Pemerian: Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau,

tidak berasa.

Kegunaan : Sebagai sumber nutrien mikroba dan pelarut medium.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup baik.5. Dekstrosa (Ditjen POM Edisi III,1979)

Nama resmi

: DEXTROSUM

Sinonim

: Glukosa, Dekstrosa

RM / BM

: C6H12O6/180,16 Pemerian: Hablur tidak berwarna, serbuk halus atau butiran

putih, tidak berbau, rasa manis.

Kelarutan: Mudah larut dalam air, sangat mudah larut dalam

air mendidih, agak sukar larut dalam etanol

(95%).

Kegunaan: Sebagai sumber nutrient yang spesifik untuk

mikroba jamur.

Penyimpanan: Dalam wadah tertutup baik.

6. Alkohol ( farmakope indonesia IV, hal: 63 )

Nama resmi

: Aethanolum

Nama lain

: Etanol / Alkohol

Rumus molekul: C2H6O

BM

: 46,07

Pemerian

: Cairan mudah menguap, jernih, tidak berwarna,

bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada

lidah. Mudah menguap meskipun pada suhu rendah dan mendidih pada suhu 78C dan mudah terbakar.

Kelarutan

: Bercampur dengan air dan praktis bercampur

dengan semua pelarut organik.

Berat Jenis

: 0,812 0,816 g/ml.

Stabilitas

: Mudah menguap walaupun pada suhu rendah.

OTT

: Bahan pengoksidasi Bila dicampur dengan

alkali, warna akan menjadi gelap.

Konsentrasi

: 60-90 %.

Kegunaan :Anti mikroba, desinfektan, pelarut,dan penetrasi

Penyimpanan: Wadah tertutup rapat jauh dari api.C. Uraian Mikroba Uji

1. Staphyloscoccus aureus

a. Klasifikasi

Kingdom: MoneraDivisio: FirmicutesClass: BacilliOrder: BacillalesFamily: StaphylococcaceaeGenus: StaphilococcusSpecies: Staphilococcus aureus

b. Morfologi

Staphyloscoccus aureus adalah bakteri berbentuk bulat, bersifat gram positif, biasanya tersusun dalam rangkaian tidak beraturan seperti buah anggur. Beberapa diantaranya tergolong flora normal pada kulit dan selaput mukosa manusia, menyebabkan penanahan, abses, berbagai infeksi piogen dan bahkan septikimia yang fatal. S. aureus mengandung polisakarida dan protein yang berfungsi sebagai antigen dan merupakan substansi penting didalam struktur dinding sel (Jawetz,E. 2005).BAB III

METODE KERJAA. Alat Dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan Isolasi dan Inokulasi Mikroorganisme adalah :Tabel 1: Alat yang digunakan berserta fungsinyaNo.Nama AlatFungsi

1.Cawan petri

Tempat pertumbuhan dan penyimpanan mikrobia, baik dalam media cair maupun media padat.

2.Inkubator

Menginkubasi/ menumbuhkan mikroba pada suhu optimum. Suhu maximumnya 70 C.

3.Jarum Ose lurus

Untuk memindahkan mikroorganisme dengan cara menusuk pada medium yang ada pada tabung reaksi.

4.Laminar Air Flow

untuk pengerjaan secara aseptic karena mempunyai pola pengaturan dan penyaringan aliran sehingga aseptis. Untuk aplikasi sinar UV beberapa jam sebelum digunakan.

5.Lampu spiritus (Bunsen)

Untuk sterilisasi panas dan mempertahankan sterilisasi ruang inokulasi, isolasi dan transfer mikroba.

6.Gelas ukur

Untuk mengambil cairan dengan volume tertentu.

7.SpoitUntuk memindahkan cairan dengan skala yang akurat dan zat hasil pengukuran, atau zat yang mau di uji.

8.Tabung reaksi

Tempat menyimpan media,larutan atau bahan.

9.Rak Tabung ReaksiUntuk menyimpan tabung-tabung reaksi baik yang digunakan pada saat praktikum ataupun yang tidak digunakan.

10.Labu ErlenmeyerSebagai wadah larutan, bahan atau cairan.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan Isolasi dan Inokulasi Mikroorganisme adalah :Tabel 2: Bahan yang digunakan beserta fungsinyaNo.Nama BahanFungsi

1.Alkohol

Sebagai Antiseptik.

2.Tisu

.Untuk membersihkan semua alat yang akan digunakan.

3.Aquades

Untuk melarutkan bahan medium, sebagai sumber air.

4.Larutan NA 50 mlUntuk melihat pertumbuhan pada bakteri.

5.Kain KasaUntuk melapisi kapas sebelum menutup tabung reaksi.

6.KapasUntuk menutup tabung reaksi.

7.Plastik wrapUntuk melapisi cawan petri agar tidak terkontaminasi.

8.Kertas bekas

Untuk melapisi cawan petri yang telah dilapisi plastic wrap terlebih dahulu.

10.Kertas LabelUntuk memberikan tanda diatas cawan petri.

B. Cara KerjaPembuatan Media

-Metode Agar Sebar

NA padat 15 ml (padat)

Diambil 0,1 ml pada cawan petri-Metode Agar Tuang Dimasukan 1 ml dari pengenceran

Dimasukan 10 ml pada media NALangkah kerja

1. Disiapkan semua alat dan bahan.2. Diambil tabung reaksi sebanyak 6 buah dan diberi kertas label 10-1 sampai 10-6 yang telah disterilkan dengan alkohol.3. Diambil air steril dengan menggunakan spoit dan diisi tabung reaksi masing-masing 9 ml/tabung.4. Diambil air kemasan dengan menggunakan spoit sebanyak 1 ml dan gojog hingga homogen.5. Dilakukan pengenceran dari tabung reaksi pertama sampai tabung reaksi terakhir.6. Dituangkan larutan NA 50 ml pada labu Erlenmeyer dan dituangkan lagi ke gelas ukur hingga 15 ml.7. Dibakar bunsen, dekatkan cawan petri lalu diambil larutan dari tabung reaksi 10-6 sebanyak 0,1 ml untuk metode sebar dan 1 ml untuk metode tuang dengan spoit tuangkan ke dalam cawan petri serta tuangakn larutan NA 15 ml ke dalam cawan petri.8. Ditutup kembali cawan petri, dan diratakan dengan membentuk angka 8.9. Diberikan kertas label di kedua cawan petri dan tunggu hingga beku.

10. Dibungkus dengan menggunakan plastic wrap serta dilapisi kembali menggunakan kertas bekas, untuk metode tuang sebelum dibungkus cawan petrinya di balik terlebih dahulu.

11. Dimasukkan ke dalam autoclave, dan amati hasilnya.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASANA. Hasil Pengamatan1. Gambar hasil pengamatan

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

Sebelum Disterilkan Setelah Disterilkan Keterangan :

1. Plastik Warp

2. Gelas Erlenmeyer

3. Medium

MEDIUM : Nutrient Borth (NB) Sintetik

B. Pembahasan

BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

B. Saran

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

1

1

3

2

2

3

SERLYANA BR. TAMBUNANNABILA SARASWATI HENDRAO1A114029