LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI STERILISASI ALAT DAN BAHAN PADA PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

KELOMPOK 1 SHIFT 1 1. Asep Irfan Trispandi (10060308078) 2. Muhamad faisal Rizal (10060308079) 3. Devianti (10060308082)

HARI/TANGGAL PRAKTIKUM HARI/TANGGAL LAPORAN ASISTEN

: KAMIS/8 OKTOBER 2009 : KAMIS/15 OKTOBER 2009

: NONGKI, S. Si., Apt.

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG 2009 1. Tujuan Percobaan Praktikan dapat memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi serta mampu menyiapkan dan membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi.

2. Teori dasar Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya serta mencegah mikroorganisme tersebut agar tidak kembali hidup. 5 metode umum sterilisasi yaitu: Sterilisasi uap (panas lembab) Sterilisasi panas kering Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) Sterilisasi gas Sterilisasi dengan radiasi Metode yang paling umum digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembab) dan metode sterilisasi panas kering. a) Sterilisasi Uap (Panas Lembap) Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklaf menggunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Bila ada kelembaban (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan bila tidak ada kelembaban. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air

panas adalah karena tejadinya denaturasi dan koagulasi (penggumpalan) beberapa protein esensial dari organism tersebut. Kondisi kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoklaf adalah sebagai berikut: o Suhu 115,50C, waktu 30 menit. o Suhu 121,50C, waktu 20 menit. o Suhu 126,50C, waktu 15 menit Sebagian besar autoklaf dioperasikan pada suhu 1210C. Metode sterilisasi uap ini pada umumnya digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan lain yang tahan terhadap penembusan uap air. Metode ini digunakan untuk : o Larutan dengan pembawa air o Alat-alat gelas o Pembalut untuk bedah o Penutup karet dan plastik o Media untuk pekerjaan mikrobiologi b) Sterilisasi Panas Kering Sterilisasi panas kering biasanya dilakukan dengan menggunakan oven pensteril. Karena panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan uap air panas maka metode ini memerlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Sterilisasi panas kering biasanya ditetapkan pada temperatur 160-1700C dengan waktu 1-2 jam. Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air panas, karena sifatnya yang tidak dapat ditembus atau tidak tahan dengan uap air. Senyawasenyawa tersebut meliputi minyak lemak, gliserin (berbagai jenis minyak), dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini juga efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah. Karena suhunya sterilisasi yang tinggi, sterilisasi panas kering tidak dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan (contoh: alat ukur), dan penutup karet atau plastik.

c) Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yang mudah rusak jika terkena panas atau mudah menguap (bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotic). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut.

d) Sterilisasi dengan radiasi Sterilisasi dengan radiasi dapat dilakukan dengan penyinaran UV. Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV. e) Sterilisasi kimia Digunakan apabila dengan sterilisasi panas kering atau sterilisasi tekanan tinggi akan merusak objek tersebut atau peralatan tidak tersedia. contoh: Etilen oksida, Gas formaldehid, Glutaraldehid. o kelebihan : larutan glutyaraldehid dan formaldehid tidak begitu mudah dinonaktifkan oleh materi organik, kedua larutan ini digunakan untuk instrumen yang tidak tahan sterilisasi panas ,seperti leparoskop kekurangan : glutaraldehid mahal harganya. Formaldehid tidak dapat dicampur dengan clorin karena memproduksi gas berbahaya. Media adalah suatu substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh yang disesuaikan dengan lingkungan hidupnya. Pembuatan media Nutrien Agar (NA) menggunakan bahan utama ekstrak daging sapi 5 g, pepton 3 g dan agar 3 g. Pada awal pengamatan media Nutrien Agar, sebelum proses sterilisasi berwarna kuning, setelah sterilisasi warna media menjadi agak coklat. Pada pembuatan media NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N2 (Dwidjoseputro, 1994). Agar-agar yang digunakan dalam proses ini untuk mengentalkan media, juga berperan sebagai

media tumbuh yang ideal bagi mikroba (Schlegel, 1993). Nutrient broth adalah media dasar yang terdiri dari pepton sederhana dan ekstrak daging sapi. Kontribusi pepton nitrogen organik dalam bentuk asam amino dan dirantai panjang asam lemak. Ekstrak daging sapi memberikan tambahan vitamin, karbohidrat, garam dan senyawa nitrogen organik lainnya yang dibutuhkan untuk kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme.

3. Alat dan Bahan

Alat Autoklaf Aluminium foil. Benang kasur Gunting Kain kasa Kapas Kertas HVS A4 putih Magnetik stirrer Neraca analitik

Bahan Cawan petri Erlenmeyer Gelas ukur (100ml,10ml) Labu ukur (100ml, 25ml, 10ml) Media ( Nutrient agar, Nutrient Broth) Pipet volume

Tabung reaksi

4. Prosedur Percobaan Persiapan dan sterilisasi alat 1) Alat -alat yang akan disterilisasi dicuci dan dikeringkan. 2) Alat-alat yang mempunyai mulut seperti : Tabung reaksi, Erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, pipet ditutup dengan kapas berlemak. Cara : Ambil sepotong kapas, lipat kedua ujungnya sehingga berbentuk segi empat (besarnya bergantung besar mulut). Gulung kapas hingga berbentuk silinder yang cukup padat, bungkus dengan kain kasa, kemudian dimasukkan ke dalam mulut alat (2/3 masuk di bagian mulut alat) serta dibungkus dengan kertas aluminium foil dan diikat

dengan benang kasur. Khusus untuk pipet, pada bagian tutup pipet ditutup dengan kapas, kemudian seluruh bagian pipet dibungkus dengan kertas HVS. 3) Alat yang permukaannya harus steril ditutup dengan aluminium foil satu per satu. Cawan petri dibungkus seluruhnya dengan kertas HVS. 4) Alat-alat yang presisi disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 15-20 menit. 5) Setelah disterilisasi dengan autoklaf, dinginkan alat-alat pada suhu kamar. Kemudian dimasukkan dalam lemari untuk disimpan. Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer. 1) Nutrient agar ditimbang sebanyak 5,6 gram dan Nutrient broth ditimbang sebanyak 0,8 gram. 2) Masing-masing media yang telah ditimbang, dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang sudah diberi tanda (sesuai nama media). 3) Aquades ditambahkan pada media Nutrient agar sebanyak 200 ml dan pada media Nutrient broth sebanyak 100 ml, lalu panaskan di atas pemanas serta diaduk dengan magnetik stirrer sampai larutan tidak keruh lagi/jernih. 4) Dinginkan larutan pada suhu kamar, lalu ditutup dengan kapas yang dibalut dengan kain kasa serta aluminium foil dan diikat dengan benang kasur dan diberi etiket (tuliskan tanggal pembuatan, nama media, dan nama pembuat). 5) Sterilisasi dengan autoklaf. 6) Setelah steril dinginkan di suhu kamar, kemudian dimasukkan dalam lemari untuk disimpan. 7) Langkah 1 sampai 4 diulangi sebagai pembuatan media control, dengan NA sebanyak 2,8 gram ditambah aquades 100 ml. NB sebanyak 0,8 gram ditambah aquades?? 8) Kondisi media diamati dan dicatat (dengan melihat kejernihan). Pengamatan dilakukan 24 jam. 5. Data Pengamatan Pengamatan pada alat-alat yang disterilisasi Nama Bahan Keterangan

Tabung reaksi 10 buah Labu ukur (100ml, 10ml) Gelas ukur (100ml, 25ml, 10ml) Pipet ukur Cawan petri

Setelah disterilisasi dengan autoklaf, keadaan alat-alat terlihat tetap bersih.

Pengamatan pada sterilisasi media serta larutan pengencer Tabel 1. Pengamatan media yang telah disterilisasi Nama Media Larutan Pengencer Nutrient Agar T0 = 12.15 wib (8/10/09) warna : kuning kejernihan : jernih wujud : cair

Kondisi Ta =12.00 wib (9/10/09) warna : coklat muda kejernihan : keruh wujud : padat, pada bagian lapisan atas tidak putih (nonkoloni) warna : kuning putih bening kejernihan : jernih wujud : cair.

Nutrient Broth

warna : kuning putih bening

kejernihan : jernih wujud : cair

Ket : pengamatan dilakukan < 24 jam setelah media disterilisasi. Tabel 2. Pengamatan media kontrol Nama Media Larutan Pengencer Nutrient Agar T0 = 12.15 wib (8/10/09) warna : kuning Ta =12.00 wib (9/10/09) warna putih, keruh, Kondisi

Nutrient Broth

kejernihan : jernih wujud: cair. warna : kuning putih bening

padat, berkoloni warna putih kejernihan : keruh

kejernihan : jernih wujud: cair

wujud : cair, ada gumpalan putih (berkoloni)

Ket: pengamatan dilakukan < 24 jam.

6. Pembahasan Mikrobiologi merupakan suatu cabang ilmu yang mempelajari, dan mengamati organisme yang berukuran sangat kecil/ mikroskopis. Organisme tersebut misalnya bakteri, khamir, dan kapang. Pengenalan dan pemahaman dikhususkan pada ketiga mikroorganisme ini karena paling banyak dimanfaatkan pada pengujian mikrobiologi. Oleh karena itu laboratorium mikrobiologi pastinya dilengkapi dengan alat yang dapat membantu mengidentifikasi mikroorganisme tersebut. Selain itu, laboratorium juga dilengkapi dengan peralatan lain yang dapat digunakan sebagai alat bantu untuk penelitian dan percobaan/ praktikum yang jenisnya tak jauh berbeda dengan peralatan laboratorium (kimia) pada umumnya, seperti : tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, labu ukur, pipet volume, serta cawan petri yang berfungsi sebagai tempat pertumbuhan mikroba secara kuantitatif dan sebagai tempat pengujian sampel. Alat-alat yang digunakan dalam pengujian mikrobiologi tersebut harus disterilisasikan terlebih dahulu. Hal tersebut dimaksudkan untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan (kontaminasi oleh mikroba) serta mencegah terjadinya kontaminasi terhadap bahan-bahan yang akan dipakai dalam pengujian mikrobiologi. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan

glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993). Pada praktikum kali ini sterilisasi yang digunakan untuk alat dan bahan pengujian mikrobiologi adalah sterilisasi uap (panas lembab). Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklaf menggunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Uap air panas akan merusak protein esensial mikroba hingga mengalami koagulasi (penggumpalan), pada saat itu protein akan mengendap (denaturasi / penghancuran struktur protein) dan menyebabkan kematian pada mikroba. Prinsip cara kerja autoklaf yaitu pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi (tekanannya sama dengan tekanan atmosfer). Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Ketika akan membuka, posisikan tubuh praktikan jauh dari autoklaf. Jangan membuka pintu autoklaf terlalu cepat (tergesa-gesa) karena uap panasnya yang berbahaya dan dapat menyebabkan keretakan alat gelas karena perubahan suhu yang terlalu cepat. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. Sterilisasi dengan uap (panas lembab) merupakan sterilan yang efektif karena 2 alasan yaitu pertama, uap pekat adalah sebuah kendaraan energi termal yang sangat efektif. Kedua, uap adalah sterilan yang efektif karena lapisan luar mikroorganisme yang bersifat protektif dan resistan dapat dilemahkan oleh uap, sehingga terjadi koagulasi pada bagian mikroorganisme yang sensitif. Selain itu kelebihan sterilisasi uap (panas lembab) adalah suhu yang digunakan lebih rendah serta waktu yang

dibutuhkan dalam proses sterilisasi lebih cepat daripada metode panas kering (oven pensteril) atau siklus kimia. Sedangkan kekurangan dari sterilisasi uap (panas lembab) adalah membutuhkan sumber panas yang terus-menerus dan membutuhkan peralatan yang perawatannya serius. Untuk itu hal-hal yang harus diperhatikan bila melakukan sterilisasi uap (panas lembab): 1) Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan betul-betul dari ruang sterilisator. 2) Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkena uap, karena itu tabung dan labu kosong harus diletakkan dalam posisi tidur agar udara tidak terperangkap di dasarnya. 3) Bahan-bahan yang berpori atau berbentuk cair harus permeabel terhadap uap. 4) Suhu sebagaimana yang terukur oleh thermometer harus mencapai 121 oC dan dipertahankan setinggi itu selama 15 menit. Pada praktikum kali ini, praktikan juga melakukan pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer. Hal tersebut bertujuan karena pada praktikum mikrobiologi kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme dipengaruhi oleh adanya nutrisi dan faktor lingkungan. Bahan nutrisi yang tersedia dapat berupa bahan alami dapat pula berupa bahan sintetis. Bahan nutrisi yang digunakan mikroorganisme biasanya berupa senyawa sederhana yang tersedia secara langsung atau berasal dari senyawa yang kompleks yang kemudian dipecah oleh mikroorganisme menjadi senyawa yang sederhana melalui proses enzimatik. Bahan nutrisi ini dapat berupa cairan atau padatan setengah padat (semi solid), yang kemudian disebut Media. Media yang digunakan adalah Nutrient agar dan Nutrient broth. Nutrient agar adalah nutrisi yang mengandung ekstrak daging sapi, pepton, dan agar-agar dimana terdapat kandungan karbohidrat dengan berat molekul tinggi yang mengisi dinding sel rumput laut. Agar-agar tergolong kelompok pektin dan merupakan suatu polimer yang tersusun dari monomer galaktosa. Gel terbentuk karena pada saat dipanaskan

di air, molekul agar-agar dan air bergerak bebas. Ketika didinginkan, molekulmolekul agar-agar mulai saling merapat, memadat dan membentuk kisi-kisi yang mengurung molekul-molekul air, sehingga terbentuk sistem koloid padat-cair. Kisikisi ini dimanfaatkan dalam elektroforesis gel agar-agar untuk menghambat pergerakan molekul obyek akibat perbedaan tegangan antara dua kutub. Kepadatan gel agar-agar juga cukup kuat untuk menyangga tumbuhan kecil sehingga sangat sering dipakai sebagai media dalam kultur jaringan. Agar-agar mulai mencair pada suhu 85C dan mulai memadat pada suhu 32-40C. Jadi tidak seperti air yang memadat dan mencair pada titik suhu yang sama. Nutrient broth adalah media dasar yang terdiri dari pepton sederhana dan ekstrak daging sapi. Kontribusi pepton nitrogen organik dalam bentuk asam amino dan dirantai panjang asam lemak. Ekstrak daging sapi memberikan tambahan vitamin, karbohidrat, garam dan senyawa nitrogen organik lainnya untuk kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme. Berdasarkan hasil pengamatan, media Nutrient Agar (NA) sebelum proses sterilisasi berwarna kuning, setelah sterilisasi warna media menjadi agak coklat karena pada umumnya pembuatan media NA menggunakan bahan utama ekstrak daging sapi 5 g, pepton 3 g, dan agar 3 g. Sedangkan adanya lapisan lemak di atas permukaan NA kontrol (tidak disterilisasi) dan gumpalan putih pada NB kontrol (tidak disterilisasi) yang merupakan koloni disebabkan bahan pepton yang dapat mempercepat pertumbuhan mikroba, karena mengandung banyak N2.

7. Kesimpulan 1. Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya serta mencegah mikroorganisme tersebut agar tidak kembali hidup Sterilisasi uap mengunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. 2. Autoklaf merupakan alat pensteril yang paling efektif karena memiliki kelebihan yaitu, suhu yang digunakan lebih rendah serta waktu yang dibutuhkan lebih cepat dibandingkan alat pensteril lainnya yang digunakan dalam pengujian mikrobiologi. Sedangkan kekurangan dari sterilisasi uap

(panas lembab) adalah membutuhkan sumber panas yang terus-menerus dan membutuhkan peralatan yang perawatannya serius. 3. 121,50

C merupakan suhu yang paling efektif untuk menghancurkan

mikroorganisme. 4. Udara, Alat, dan Media praktikum merupakan sumber kontaminasi yang menghalangi proses pensterilan suatu mikroorganisme. 5. Media merupakan substrat atau nutrisi dimana mikroorganisme dapat tumbuh yang disesuaikan dengan lingkungan hidupnya. 6. Dari hasil pengamatan, NA dan NB yang telah disterilisasi tetap steril daripada NA dan NB kontrol yang menghasilkan mikroorganisme yang berkoloni dan terlihat bergrombol (gumpalan putih).

8. Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta. Hadioetomo, Ratna Siri, 1993, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek, Gramedia. Schlegel, G.H. 1993. General Microbiologi seventh edition. Cambrige University Press, USA. http://farmasiq.blogspot.com diakses tanggal 11 oktober 2009 http://makul-rizki.blogspot.com diakses tanggal 11 oktober 2009 http://dedistikes.blogspot.com/2009/02/sterilisasi-dan-disinfeksi.html diakses tanggal 11 oktober 2009 http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-3-sterilisasi.html. diakses tanggal 9 oktober 2009