PCR

PCR Tcnica inventada por Kary Mullis :1987

Premio Nobel 1993

Amplifica una NICA secuencia a partir de una mezcla compleja de ADN

Aprovecha los requerimientos de la replicacin Templete ADN Nucletidos Primers (Imprimadores) Polimerasa

PrimersSe debe tener informacin de la secuencia que rodea el fragmento de inters

Primers dan especificidad a la reaccin, delimitan regin a amplificar6-40 nuclotidosUsualmente 18-22A no ms de 4 kb uno de otro

Primers

2 primers: complementarios a bandas opuestasDeben estar en exceso

Para realizar la tcnica se necesitan: dNTPs Dos cebadores (o primers) Iones divalentes. Se suele usar magnesio

(Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), Actan como cofactores de la polimerasa.

Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

ADN polimerasa (la ms comn es la Taq polimerasa).

ADN molde Termociclador

Ciclos

20 a 35 ciclos de:1. Desnaturalizacin: 94-96

5 3

3 5

3 5

5 3

2. Annealing50-65

3 5

5 3

3. Elongacin 72C

3 5

5 3

Ciclo completo de PCR

Tamao definido

Clave para facilidad proceso: polimerasa Debe ser termoestable Thermus aquaticus, una bacteria

Desventajas de la Taq No corrige errores 1 error en 2 x 104 bases Nuevas polimerasas cometen menos errores

Termociclador

Templete para PCR Se pueden usar bajas cantidades En teora: una sola molcula No se debe aislar la secuencia de inters No debe ser muy puro ADN es una molcula muy estable en ausencia

de nucleasas

A partir de: Sangre Semen Pelo Mucosa bucal Uas Cepillo dientes

Cuidado con PCR Es tan sensible que se debe evitar la

contaminacin

Resolucin de problemas de PCR

http://bitesizebio.com/articles/the-essential-pcr-troubleshooting-checklist/

Primers

Caractersticas importantes de un primer

Longitud

Tm

TmTemperatura de melting, separacin, fusin la temperatura a la que la mitad de las hebras de ADN son simple banda y la mitad son doble banda. Entre ms G-C ms alta Tm.

Clculos:

Menos de 13: Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4 Ms largo de 13: Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)

Programas usan frmulas modificadas ms exactas. Consideran concentracin de sales, de iones, etc

Caractersticas de un buen primer

Tm en el rango de 52C a 65C. Idealmente ambos primers con Tm parecida.

Que no sean capaces de dimerizar

Ausencia de formacin de horquillas

Falta de sitios secundarios de unin

Unin nicaSecuencia debe ser nica en el ADN templete

No debe existir annealing en posibles fuentes contaminantes (humano, rata, ratn). Se logra haciendo BLAST o BLAT con el genoma correspondiente

Primer candidato 1 5-TGCTAAGTTG-3

Primer candidato 2 5-CAGTCAACTGCTAC-3

TGCTAAGTT

G

CAGTCAACTGCTAC

5...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3

No nico!

nico!

TGCT

AGTTG

A

Longitud del primer En trminos generales:

Entre ms largo ms especfico Entre ms largo ms alta Tm y temp annealing Por lo menos 15pb de longitud Por lo general 17-28pb

Caso especial: mutagnesis dirigida. Longitud: 25-45pb

Temperatura de Annealing

Ta Opt = 0.3 x (Tm de primer) + 0.7 x (Tm del producto) - 25

Tm del primer: es la Tm del primer que tenga la ms baja

Temperatura de Annealing, Tanneal temperatura a la que los primers se unen al molde de ADN. Se puede calcular a partir de Tm .

Estructura InternaUnin de primer con l mismo, o con el otro primer antes que con el molde: disminuye eficiencia

Podra no ser tan importante si la temperatura de annealing no los deja formarse. Algunos dmeros y horquillas se forman a 30C.

Pareja de primers debe calzar

Primers funcionan en parejas

Se usan en la misma reaccin de PCR: las condiciones deben ser adecuadas para ambos

Mxima diferencia entre temperaturas de annealing debera ser 3C

Especificidad del producto

Tanneal es el factor principal en determinar especificidad del annealing y que se obtenga el producto deseado

Tanneal : muy baja menos especfico unin de primers en otro lado bandas inespecficas

muy alta primers pueden no unirse

Estabilidad 3 y 5Elongacin de primer empieza en extremo 3.

Mientras el extremo 3 se una al molde, la elongacin empieza. 5 menos importante

Problema: Si 3 tiene 3 o ms C/G, se puede unir establemente a casi cualquier secuencia con tres C/G

Situacin Ideal:

Extremo 5 estable + extremo 3menos estable, elimina unin incorrecta debida a unin de slo extremo 3. Preferiblemente: extremo 5 con 1 o 2 bases G/C. Extremo 3 no tiene ms de una base G/C.

Resumen criterios para diseo

1. Unin nica

2. Longitud: 17-28 bases. Podra variar

3. Composicin: contenido promedio de (G+C) alrededor 50-60%; evitar secuencia larga de (A+T) y regin rica en (G+C)

4. Optimizar apareamiento: estabilidad en extremo 5 debe ser alta y relativamente baja en 3, para evitar unin equivocada de los primers

5. Tm preferiblemente entre 55-65 C

6. Primers en un juego con diferencia de t. de annealing entre 2-3C

7. Minimizar estructura secundaria interna: horquillas y dmeros se deben evitar

Diseo de primers con computadora

Mucho mejores resultados que a mano

Algunos programas:- Primer3: MIT http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi-Oligo -GCG -BioTools - Otros: GeneFisher, Primer!, Web Primer

Software para calcular Tm: - BioMath: http://www.promega.com/biomath/calc11.htm

PCR Multiplex

Varias parejas de primers en mismo tubo al hacer PCR

Bueno para amplificar sitios mltiples

Ej: microsatlites

Dificultad de diseo Tm deberan ser parecidas Evitar dmeros

Primers universales Basados en alineamiento de secuencias

Ejemplo:

todos los genes de una familia

el mismo gen en diferentes organismos

Estrategia 1. Alinear secuencias a amplificar.2. Buscar regiones ms conservadas en extremos 5 y 3.3. Diseo de primer F en la regin conservada 5.4. Diseo de primer R en la regin conservada 3.5. Buscar la mejor pareja en cuanto a Tm etc6. Asegurarse de amplificacin nica en todas secuencias7. Asegurar que no amplifique posibles contaminantes

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