Laboratorio Integrato II

Modulo di Biochimica

Programma delle esercitazioni

• Determinazione della costante di affinità dell’eme per la sieroalbumina umana

• Separazione di proteine in miscela mediante cromatografia a scambio ionico

Determinazione della costante di affinità dell’eme per la sieroalbumina umana

• Stechiometria: numero di ligandi per proteina

• Affinità: stabilità relativa del complesso. Descritta dalla costante

termodinamica di equilibrio

LP

PLKa

PL

LPKd

P + L PL

LK

L

PLPK

PL

KPL

P

KPL

PLP

PL

C

PL

dd

d

d

P

LK

L

d

LK

LCPL

d

P

xa

xy

0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Kd[PL]

[L]

0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

CP=2

CP=10

CP=50

CP=100

[PL]

[L]

La concentrazione di proteina deve essere dell’ordine di grandezza della Kd

td

ttddttddttd

LK

PNLKKPNLKKPNLKA

A

1

221111max

2

411

)(

)(

PLLK

PLL

LK

L

P

PL

td

t

dt

Misura dell’assorbimento

Sorgente

Monocromatore

Io I

Ricevitore

Campione

Monocromatore

td

ttddttddttd

LK

PNLKKPNLKKPNLKA

A

1

221111max

2

411

Separazione di proteine in miscela mediante cromatografia a scambio ionico

Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico

RIVELATORE

Valvole di iniezione

L’interfaccia universalmente utilizzata per introdurre il campione è la valvola a 6 (o 7) vie.

A seconda del loop montato varia il volume del campione iniettato in colonna

Rivelatore UV a fissa

La radiazione proveniente da una lampada a vapori di Hg passa attraverso la cella del campione e arriva al fotodiodo.

L’intensità della luce assorbita è proporzionale alla concentrazione dell’analita.

Vantaggi e svantaggi

Il principale vantaggio è il basso costo. Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254/280 nm.

Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a fissa.

Cromatografie di adsorbimento

• Interazione idrofobica

• Scambio ionico

• Per affinità– Affinità per ligandi (anticorpi)– Proteine ingenierizzate (His-tag)

• Immobilized Metal ion Affinity Chromatography

Coefficiente di partizione -

• Il coefficiente di partizione tra le due fasi, è definito come il rapporto tra il soluto adsorbito sulla fase stazionaria rispetto a quello in soluzione nella fase mobile.

= 0 nessun adsorbimento

= 1 tutto adsorbito

Cromatografia di scambio ionico• Scambio anionico

– A pH maggiore del pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e lega la colonna a scambio anionico.

– L’eluizione avviene con [Cl-] crescente o abbassando il pH (più difficile da controllare).

• Scambio cationico– A pH minore del pI (almeno una unità) la

proteina è carica positivamente e lega la colonna a scambio cationico.

– L’eluizione avviene con [Na+] crescente o alzando il pH.

Scambiatori ionici

Cromatografia di scambio ionico

Cromatografia di scambio ionico• VANTAGGI

– Per grandi volumi,– Grandi quantità di proteina

(1-5 g proteina per 100 ml),– Matrice molto robusta,– Condizioni molto flessibili,

possibili molte variazioni.

• SVANTAGGI– Proteine allo stesso pH e

concentrazioni di sali della colonna.

– Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

All’esame…

• Il candidato descriva l’esperimento atto a determinare la costante termodinamica di dissociazione della emoverdina (che assorbe a 460 nm, ε = 1×105 cm-1 M-1) con la HSA sapendo che in letteratura è riportato che lo stesso ligando si lega all’albumina bovina con Kd ≈ 10-6 M.

All’esame…

• Descrivere un protocollo di purificazione di una proteina avente pI = 9.8 mediante cromatografia di scambio ionico, sapendo che la maggioranza delle proteine presenti nel campione possiede pI compreso tra 5 e 8.