LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Dra Susana Elgueta Miranda.
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LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD
Dra Susana Elgueta Miranda
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RESPUESTA INMUNE El sistema inmunológico está
programado para: Diferenciar entre lo propio y lo extraño Defensa contra agentes externos
Las Moléculas responsables de estos eventos, pertenecen al MHC
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LEUCOCITOS PASAJEROS
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ALORECONOCIMIENTO RESPUESTA MUY VIGOROSA. 1-10%
DE LT RESPONDEN A ALOANTIGENO CLONES RESTRINGIDOS POR MHC
PRESENTAN ALOREACTIVIDAD PORCION TCR INVOLUCRADO EN
RECONOCIMIENTO DE Ag+AUTOMHC RECONOCE ALOANTIGENO
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RESPUESTA A ALOANTIGENOS
GRAN EXPRESION MOLECULAS CMH, RECONOCIMIENTO DIRECTO POR REACCION CRUZADA, ESTIMULA CLONES DE BAJA Y ALTA AFINIDAD
RESPUESTA POLICLONAL Y POLIESPECIFICA
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FUNCIONES LABORATORIO ISP
Laboratorio Nacional y de Referencia: *Estudio de histocompatibilidad a
Receptores (potenciales) y Donantes *Asignación de riñón de donante cadáver
*Tipificación HLA en enfermedades: B27, DR
Lleva la Lista Nacional de Receptores de Organos (en espera y trasplantados)
Otros: PEEC B27, Capacitación etc
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BARRERAS ANTIGENICAS EN TRASPLANTE DE ORGANOS
Grupo sanguíneo ABO
Antígenos del CMH (HLA)
Antígenos de Complejos Menores de Histocompatibilidad
Requerimientos variables según órgano o tejido
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OTROS ALOANTIGENOS
LEWIS
ANTIGENOS ENDOTELIO VASCULAR
MICA / MICB (MICC, MICD, MICE son pseudogenes
)
VIMENTINA
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REQUERIMIENTOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
HIGADO
CORAZON
RIÑON
MEDULA OSEA
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ANTIGENOS
ANTICUERPOS
LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD
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Estudios
RECEPTOR Tipificación HLA Existencia de anticuerpos anti-HLA (panel de
anticuerpos reactivos o PRA) pre-transplante Detección de la aparición de anticuerpos
anti-HLA post-transplante DONANTE
Tipificación de HLA RECEPTOR/DONANTE
Prueba cruzada (crossmatch XM)
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EFECTO HLA EN TRASPLANTE RENAL
SOBREVIDA INJERTO FRECUENCIA RECHAZOS AGUDOS GRADO INMUNOSUPRESION DISMINUYE RIESGO DE
SENSIBILIZACION (IMPACTO ECONOMICO)
Donante vivo/ donante cadavérico
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HERENCIA CMH
a b c d
ac, ad , bc, bd
A1B5DR8
A2B8DR3
A9B12DR2
A3B16DR4
HLA-A1,B5,DR8/ A9,B12,DR2 A1,B5,DR8/ A3,B16,DR4 A2,B8,DR3/ A9,B12,DR2 A2,B8,DR3/ A3,B16,DR4
25% idénticos25% 0 match50% semiidenticos
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Tipificación de HLA
Métodos serológicos: CDC: citotoxicidad dependiente de
complemento
Métodos moleculares: PCR-SSP (iniciadores secuencia-
específicos) PCR-SSO (sondas secuencia-
específicas)
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• Identificacion AntigenosPlacas con antisueros especificos(a-HLA A2, A3, B5, B7 etc)Celulas con antigenos a identificar
• Pesquisa de AnticuerposSuero para determinar existencia
anticuerposCélulas con Antigenos conocidos
Métodos serológicos
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2 x 106/ml lymphocytes
Dispense 1 l of T or B lymphocytes
Dispense 10 l of Stain-Fix™
or5 l of Fluoroquench™
Evaluation and
Reporting
1 hour incubation
30 minutesincubation
Dispense 5 l of Class I or II rabbit complement
RabbitComplement
Tipificación:Métodos serológicos
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“1” Reaction“1” Reaction
0–10% Dead Cells0–10% Dead Cells
“2” Reaction“2” Reaction
11–20% Dead Cells11–20% Dead Cells
“4” Reaction“4” Reaction
21–50% Dead Cells21–50% Dead Cells
“6” Reaction“6” Reaction
51–80% Dead Cells51–80% Dead Cells
“8” Reaction“8” Reaction
81–100% Dead Cells81–100% Dead Cells
Tipificación:Métodos serológicos
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TECNICAS MOLECULARES
BAJA RESOLUCION: INFORMACION SIMILAR A LA SEROLOGIA
kits CTS Biotest One Lambda
RESOLUCION INTERMEDIA: PERMITE IDENTIFICAR GRUPOS DE ALELOS
ALTA RESOLUCION: PERMITE IDENTIFICAR ALELOS Y SUS VARIANTES
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Micro SSPTM ProcedimientoMicro SSPTM Procedimiento 2. Agregar 10 ul de la
solucion que contiene el DNA/mezcla-D a cada uno de los pozos de la micro-placa del SSP, con excepción del pocillos que es el control negativo.
1. Agregar Amplitaq de Perkin-Elmer y la muestra de DNA en el tubo de D-Mix
3. Termociclador (Perkin Elmer 9600)
4. Transferir el producto de la reacción de PCR en un gel.
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Micro SSPMicro SSPTMTM Procedimiento ProcedimientoMicro SSPMicro SSPTMTM Procedimiento Procedimiento
6. Analizar los patrones de bandeo y asignar los alelos correspondientes.
5. Correr la electroforesis.
11223344
55667788
99101011111212
7. Interpretación
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TIPIFICACION HLA-A,B,DR
Tipificación SerológícaAntígeno A28 B40 DR5Subtipos A68 B61 DR11
Tipificación MolecularBaja resolución A*68 B*40 DRB1*11
Intermedia A*6801/6804 B*4001/4006 DRB1*1101/1104/1106
Alta resolución A*6801 B*4006 DRB1*1104
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MATCH O COMPATIBILIDADANTIGENOS PRESENTES EN EL RECEPTOR Y EN EL DONANTE
MISMATCH O INCOMPATIBILIDAD
ANTIGENOS PRESENTES EN EL DONANTE Y AUSENTES EN EL RECEPTOR
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EJEMPLO HLA-A1,3/ B8,16/ DR3,5 RECEPTOR HLA-A3,9/ B7,16/ DR5,8 PADRE
HLA-A1,19/ B5,B8/ DR3,5 HERMANO
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EJEMPLO R: HLA-A2, 9; B5, 44; DR5, 6
MADRE HLA-A3,9; B5,8 ; DR4,5 HNO1. HLA-A2,3; B5,8; DR4,8 HNO2. HLA-A2,9; B5 ; DR5,8 HNO3. HLA-A2,3; B8, 44; DR4,6
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COMPATIBILIDAD (MATCH) E INCOMPATIBILIDAD (MISMATCH)
RECEPTOR : HLA A1,2 ; B5,8 ; DR1,3 ;
DONANTE 1: HLA A2,9 ; B8 ; DR1,3DONANTE 2: HLA A2,9 ; B8 ; DR3DONANTE 1 MATCH : 1A 1B 2DR MM : 1A 0B 0DRDONANTE 2 MATCH : 1A 1B 1DR MM : 1A 0B 0DR
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UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1.UN EJEMPLO (1)
CLASE II POR SSP BAJA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1*PACIENTE 23, 24 49, 62 04, -HERM. A 23, 24 49, 62 04, -HERM. B 23, 24 49, 62 04, -MADRE 23, 32 49, 60 04, -PADRE 24, - 62,- 04, -
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UTILIDAD DE TIPIFICACION DE DRB1.UN EJEMPLO (2)
CLASE II POR SSP ALTA RESOLUCION LOCUS A* LOCUS B* DRB1*PACIENTE 23, 24 49, 62 0405, 0407HERM. A 23, 24 49, 62 0404, 0407HERM. B 23, 24 49, 62 0405, 0407MADRE 23, 32 49, 60 0404, 0405PADRE 24, - 62,- 0404, 0407
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Antigenos y alelos
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Antigenos y alelos
HLA-DR HLA-DR
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COMPATIBILIDAD DONANTE RECEPTOR
MEDIBLE EN DISTINTOS NIVELES DE RESOLUCION DE ANTIGENOS HLA
EN DISCUSION EL NIVEL AL CUAL EL MATCH HLA ES BENEFICIOSO
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INMUNOGENICIDAD HLA MM PERMITIDOS MM PROHIBIDOS B7 en RECEPTOR A1 FENOTIPO RECEPTOR DR6: a-A10, A11, A19, B35 OTROS : Cw, DQ, DP
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SENSIBILIZACION
PRESENCIA DE
ANTICUERPOS ALOREACTIVOS
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CONSECUENCIAS DE LA SENSIBILIZACION
Menor posibilidad de trasplante (XM positivo)
Mayor tiempo en lista de espera
Sobrevida menor del injerto renal
HIPERSENSIBILIZADO (50%, 60%, 75%, 80%)
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ANTICUERPOS ANTI-HLA
RECHAZO HIPERAGUDO DEL INJERTO
RECHAZO AGUDO HUMORAL
DAÑO CRONICO DEL INJERTO
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CADA MOLECULA HLA PUEDE TENER MUCHOS DETERMINANTES ANTIGENICOS DIFERENTES
![Page 40: LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Dra Susana Elgueta Miranda.](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022012817/5665b4961a28abb57c926fec/html5/thumbnails/40.jpg)
ANTICUERPOS ANTI-HLA ANTIGENOS HLA SON ANTIGENOS T DEPENDIENTES RESPUESTA PRIMARIA IgM RESPUESTA SECUNDARIA IgG PRODUCCION DE CELULAS DE
MEMORIA
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VIAS DE SENSIBILIZACION
EMBARAZOS
TRANSFUSIONES
TRASPLANTES (ANTICUERPOS NATURALES)
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Detección de anticuerpos anti-HLA y especificidad
Metodología CDC ELISA Citometria de flujo Detección por luminex
(LABSCREEN®)
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Detección de anticuerpos anti-HLA por CDC
Panel de células (congeladas) PRA ( panel reactive antibody)
Paneles diseñados para asegurar una cobertura máxima de antígenos
Porcentaje de anticuerpos a-HLA 0% 100%
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Anfígenos son purificadas de líneas de células transformado por EBV.
Detección de IgG o IgM – depende en el anticuerpo secundario que usan.
Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e identificación
de especificidad de los anticuerpos.
Detección de anticuerpos anti-HLA por ELISA
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Detección de anticuerpos anti-HLA por FlowPRA™
Antígenos purificados acoplados a microperlas que pueden ser detectadas en un citómetro de flujo.
Detección de anticuerpos IgG, IgM o IgA Detecta sólo Ac a-HLA Determinación de %PRA e
identificación de especificidad de los anticuerpos.
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CDC
ELISA
FlowPRA
Menor sensibilidad
Mayor sensibilidad
Sensibilidad en detección de anticuerpos anti-HLA
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CROSSMATCH (PRUEBA DE REACCION CRUZADA XM)
Pesquisa de anticuerpos anti HLA en el suero del receptor, contra los antígenos del donante
DISTINTOS METODOS:CDC: distintas células, tiempos de
incubación, lavados, etc.CITOMETRIA FLUJO: mayor
sensibilidad
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IMPORTANCIA DE XM POSITIVO
DEFINIR ESPECIFICIDAD
DE LOS ANTICUERPOS
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SENSIBILIZACION Y TRASPLANTE RENAL
ANTICUERPOS anti-HLA
ANTICUERPOS anti-NO HLA
• ANTIGENOS MENORES DE HISTOCOMPATIBILIDAD
• AUTOANTICUERPOS
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XM (+) CONTRAINDICACION Tx
XM (- ) BAJO RIESGO
CAMBIO DE CONCEPTO
ANTIGUO ESCENARIO
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ANTICUERPOS Y CROSSMATCH
ANTICUERPOS (–) XM (–)
ANTICUERPOS (–) XM (+)
ANTICUERPOS (+) XM (+)
ANTICUERPOS (+) XM (–)
![Page 54: LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Dra Susana Elgueta Miranda.](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022012817/5665b4961a28abb57c926fec/html5/thumbnails/54.jpg)
TOMA DE DECISION
DEFINIR RIESGO
EXITO FRACASO
![Page 55: LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Dra Susana Elgueta Miranda.](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022012817/5665b4961a28abb57c926fec/html5/thumbnails/55.jpg)
Risk assessment for antibody-mediated rejection
Crossmatch result: IgG HLA-specific antibodies
Contra High risk Intermediate Low risk indicated
Current positive
Cytotoxicity
Flow cytometry
Historical positive
Cytotoxicity
Flow cytometry
Current and historical negative
Cytotoxicity
Flow cytometry Transplantation 2004, 78(2): 186
![Page 56: LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Dra Susana Elgueta Miranda.](https://reader030.fdocuments.net/reader030/viewer/2022012817/5665b4961a28abb57c926fec/html5/thumbnails/56.jpg)
TIPOS DE DONANTES
DONANTE VIVO
DONANTE CADAVERICO
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ORGANIZACIÓN PROGRAMA TRASPLANTE
HISTOCOMPATI-BILIDAD. I.S.P. Estudio DC Selección R
CORPORACION TXPesquisa, procuramientoCoordinación
CENTROS CENTROSTRASPLANTES PROCURA
LAB. VALDIVIARegional
MINSALFONASA
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LISTA ESPERA D.CADAVER ABO ABO HLA-A,B,DR HLA-A,B,DR
PRA ESPECIFICIDAD XM LT-LB
HISTOCOMPATIBILIDAD Y TRASPLANTES
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RELACION INJERTO/RECEPTOR
HUESPED RECHAZA INJERTO
INJERTO RECHAZA HUESPED
TOLERANCIA
INMUNOSUPRESION
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¡ G R A C I A S !