MEMORIA DE PRÁCTICAS EN EMPRESA

Hospital Santa Bárbara (Soria)

� Laboratorio de Bioquímica clínica � Laboratorio de Microbiología y bacteriología

ALUMNA: Laura Tavero Pérez, 5º Biología

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MEMORIA DE PRÁCTICAS EN EMPRESA

Hospital Santa Bárbara (Soria)

� Laboratorio de Bioquímica clínica � Laboratorio de Microbiología y bacteriología

Denominación de la práctica: “Funcionamiento de un Laboratorio de

Bioquímica clínica”

� Toma, recepción e identificación de especimenes � Procesado informático de peticiones, datos demográficos e informes de

laboratorio. � Clasificación y procesado de muestras. Centrifugación. � Validación de resultados y emisión de informes analíticos. � Control de calidad. � Laboratorio de urgencias. � Gasometría-Oximetría y equilibrio ácido-base. � Osmometría � Autoanalizadores. Espectrometría de absorción molecular UV-Vis. � Enzimoinmunoanálisis. Electroquimioluminiscencia. � Electroforesis. Inmunofijación.Inmunoturbidimetría. Nefelometría. � Inmunofluorescencia.Fluorescencia polarizada. � Electrodos selectivos. � Espectrometría de reflectancia. � Microscopía. Sedimento de orina. Cámaras de recuento de células.

Finalidad: Que el alumno conozca las técnicas y métodos para el análisis de enzimas, metabolitos, lípidos, iones, minerales, proteínas, marcadores cardiacos, óseos, tumorales, hormonas, vitaminas, autoanticuerpos, IGs, fármacos, recuento de células en líquidos biológicos y sedimento de orina, así como su importancia en el diagnóstico clínico.

1. FASE PREANALÍTICA DE LAS DETERMINACIONES BIOLÓGICAS ( 1-6 JULIO)

� Observación de extracción de muestras de sangre. Las enfermeras

recepcionaban el volante en el que el facultativo había señalado los parámetros biológicos a analizar/ perfil de análisis determinado. Cada

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volante venía con etiquetas con código de barras para identificar al paciente. Según las peticiones, y el tipo de muestra (suero, plasma) la sangre era almacenada en tubos con tapones de diferentes colores para su posterior análisis. La sangre se extraía mediante un sistema de extracción al vacío BD vacutainer.

Las enfermeras preguntaban siempre al paciente cómo se llamaba con el fin de evitar errores.

� Tratamiento de la muestra. Centrifugación y alicuotación. Introducción de datos en SIL.Área de Bioquímica general.

El área de bioquímica general es una parte del laboratorio de bioquímica cuya función es llevar a cabo el estudio y la medida de un menú de determinaciones útiles en el diagnóstico y seguimiento de diferentes enfermedades. Las muestras de rutina (sangre y orina/orina de 24h sobre todo) debían ser procesadas para su posterior análisis. Las de sangre debían ser centrifugadas para obtener el suero, y las de orina también si se requería revisar el sedimento (mediante URYSYS, UFC, y microscopio) Cada muestra tenía adherida una etiqueta con su código de barras, y que debía ser leída por el programa PSM. Este programa también indicaba si se requería alguna alícuota

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para análisis adicional y te emitía un duplicado de la correspondiente etiqueta. Además, permitía imprimir listas de trabajo, con el fin de controlar las muestras y conservación de las que no son procesadas en el día) Las auxiliares de enfermería asumían estos roles. Las auxiliares administrativas, por su parte, iban introduciendo en el SIL (Sistema informático de laboratorio) el formulario de petición analítica (Nombre y datos demográficos del paciente, pruebas que se le piden, nombre del doctor, diagnóstico, etc) Las pruebas se pueden solicitar individualmente o por perfiles o protocolos según figura en el formulario de petición analítica. Mi trabajo en esta fase se limitó a observar la coordinación y reparto de tareas de personal y a ayudar a las auxiliares a pasar las muestras de orina por el PSM y alicuotar. En cuanto a las orinas: -Orinas de una micción: Tras pasarlas por el PSM, se pasaban por Urysis, UF, y se centrifugaban las seleccionadas para observación del sedimento al microscopio. Para las microalbuminurias (MAU) se seleccionaba una alícuota y se pasaba por el modular P. - Orinas de 24h: Se determinaba el volumen total y se alicuotaba. Posteriormente se podía pasar por el modular P, o acidificar CaP y pasarla por el modular P (según indicara el PSM). El objetivo de este análisis es determinar la cantidad de sustancias excretadas/día: proteínas, glucosa, sodio, calcio,etc. Si se pedía también se pasaban por el nefelómetro (Área de proteínas) Las muestras de sangre podían venir en tubos de 10 ml (tapón amarillo), 6 ml (tapón azul) y 4 ml, según los parámetros a analizar y el aparato que los analizase (Modular P, Modular E, o los dos). Todas las muestras de sangre se centrifugaban para obtener el suero excepto las de EDTA hb glicosilada.

- Tubo de 6ml (tapón azul): Se analizaban en el modular E/ Screening prenatal/ Determinación de vitamina D en cobas 411/ o se enviaban a laboratorios externos.

- Tubos de 10ml: Se pasaban por el modular P/ Se introducían en rack amarillos si se debían analizar en el modular P y luego en el E/ Se pasaban al Integra si se quería medir la osmolaridad/ Mod E semanal (SCC fertilidad), o se introducían en el nefelómetro/ o se enviaban a laboratorios externos.

- Tubos EDTA: Medir PTH en cobas 411/ laboratorios externos. - Tubos EDTA Hb glicosilada

Si se debe pasar por los dos modulares, la muestra deberá colocarse en un rack amarillo. Ambos modulares comparten tubo de 10 ml para todas las determinaciones salvo: hormonas tiroideas, PSA, vitamina B12 y ácido fólico.

2. MODULAR P-S (7-12 JULIO) Es un sistema modular analítico, que realiza bioquímica de suero y orina fundamentalmente. El principio de medida es el análisis fotométrico, fotometría de absorbancia (módulo P) y los electrodos selectivos de iones (módulo S)

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Analiza fundamentalmente: Glc, Urea, creatinina, urato, CHO, HDL, LDL,TAGs,Bilirrubina total, bilirrubina directa, AST, ALT, fosfatasa alcalina, gamma GT, amilasa pancreática, lipasa, LDH, colinesterasa, CK, proteínas totales, Ca2+,fosfato, FR ( Mediante Inmunoturbidimetría), PCR-hs (Inmunoturbidimetría), ASLO (Inmunoturbidimetría), APO B (Inmunoturbidimetría), MAU ( inmunoturbidimetría) ALB-plus, prot LCR. Mediante potenciometría indirecta se medían: K+,CL-Na+ en orina y suero. Para garantizar la calidad de las medidas, se emplean controles de calidad, patológicos y normales, y se registran sus medidas, asegurándose de que no sobrepasen por exceso o por defecto las 2SD de la media. En caso de que los controles se desvíen se procede a calibrar el aparato mediante un calibrador que permitirá trazar una nueva recta de calibración con el fin de minimizar el sesgo en las medidas analíticas. También se debe calibrar cuando se cambie de lote de reactivo. Se deben revisar los controles de cada parámetro a analizar y registrarse las incidencias en un cuaderno. Todo el modular está controlado mediante un sistema informático, que permite el seguimiento de las muestras desde que las introduces en el modular. Además, existen reglas C.A.R para los siguientes parámetros: Bilirrubina directa (la prueba se crea automáticamente cuando la bilirrubina total es mayor a 1,1 mg/dl), LDLc ( si los triglicéridos son mayores de 200 mg/dL) y ApoB ( cuando LDLf o LDLc son menores o iguales a 160 mg/dL) La validación, adición o rechazo de pruebas y la impresión de los resultados la lleva a cabo el facultativo. Durante esos días me ocupé junto a una técnico de laboratorio de adecuar las muestras de suero al análisis (eliminación de coágulos que podrían interferir en la medida directamente por obstrucción de las pipetas automáticas, y rechazo de muestras inadecuadas), de introducir los tubos en racks y en el modular, y de su puesta en marcha. La técnico también se encargaba, además de controlar los reactivos del aparato, de la limpieza del modular al final del día, y de programarlo para que automáticamente realizara el mantenimiento previo a la rutina del día siguiente. 3. LABORATORIO DE URGENCIAS (13-19 JULIO)

El laboratorio de urgencias lleva a cabo entre otras cosas las determinaciones de parámetros que requieren de forma inmediata un resultado. Tal es el caso de las gasometrías, cuyos resultados se envían directamente a la consulta del médico desde el sistema informático de urgencias. Son las técnicos y no las auxiliares administrativas las en cargadas de introducir manualmente los datos del formulario de petición analítica. Se analizan sangre, orina, LCR, líquido ascítico, líquido pleural y sinovial fundamentalmente. Para el recuento leucocitario y de hematíes en LCR se utiliza la cámara Fush- Rosenthal, y para el recuento celular en el resto de los fluidos biológicos, se emplea la cámara de Neubauer mejorada.

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El gasómetro mide el equilibrio ácido base y los gases en sangre. También algunos electrolitos. La sangre arterial se emplea para valorar el estado de oxigenación, y no la venosa (esta última serviría para valorar el estado del equilibrio ácido base únicamente). La sangre arterial se extrae con preferencia de la arteria radial. La facultativa especialista me proporcionó una vasta cantidad de material sobre el tema de las gasometrías, cómo evitar errores en las medidas debidos a malas extracciones, conservación o transporte inadecuados; equilibrios ácido base y principios de medida, y también PNTs. Se me facilitó abundante material sobre diabetes, marcadores cardiacos, significado clínico de los parámetros bioquímicos más habituales,etc. Esquematizando, los parámetros bioquímicos que se monitorizan en urgencias y los principios de medida son los siguientes:

- De Bioquímica general: Mediante fotometría de absorbancia. COBAS INTEGRA PLUS URGENCIAS.

- Iones: Electrodos selectivos. - PCR: Inmunoturbimetría - Fármacos: Polarización de fluorescencia. COBAS INTEGRA PLUS 400.

1. Antiepilépticos: Carbamacepina, fenitoina,fenobarbital, valproico. 2. Antibióticos: Vancomicina, tobramicina 3. Antiaritmicos: Digoxina. 4. Paracetamol cuantificado.

- Gases:pO2, Glucosa y lactato: Amperometría - Hb y sus fracciones: Espectroscpía de absorción - PH, iones ( Na+, K+, Cl-) Calcio iónico, PCO2: Potenciometría directa. - DAU (drogas de abuso en orina):Inmunoensayo de fluorescencia competitiva.

1. Cocaína 2. Benzodiacepinas 3. THC 4. Opiáceos 5. Anfetaminas/ metanfetaminas 6. Antidepresivos tricíclicos, 7. Barbitúricos 8. Paracetamol ( Identificación cualitativa solamente)

- BHCG, procalcitonina, mioglobina, troponina, pro-BNP,PTH:

Electroquimioluminiscencia En urgencias también había un osmómetro que media la osmolalidad del suero, plasma u orina mediante el descenso del punto de congelación. Las tareas de microbiología en urgencias se reducían básicamente a test para detección de mononucleosis infecciosa y brucelosis (No pude ver ningún análisis de este tipo) Durante mi estancia en el laboratorio de urgencias realicé observaciones de muestras de sedimento de orina al microscopio junto con la especialista. En esas muestras se había introducido previamente una tira multirreactiva que era leída por Urysis 1800. Los

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datos que proporcionaba la tira (Nitritos, presencia de leucocitos, de hematíes, proteinuria,pH) debían ser contrastados mediante el análisis del sedimento al microscopio. Aprendí a distinguir los elementos que en ellas se hallaban y las patologías que sugería la presencia de cada uno de ellos: Leucocitos, eritrocitos, células epiteliales, cilindros hialinos, granulosos, mucosos, bacterias, hongos, uratos, diversos tipos de cristales.. Además me leí un libro con ilustraciones para aprender a diferenciar los elementos presentes en orinas normales y patológicas que me proporcionó la especialista. También se realizan curvas de glucosa, sobre todo a mujeres embarazadas de 24-28 semanas para detectar diabetes gestacional (curva de 50 g de glucosa, a la hora debe tener una glucemia menor a 140 mg/dl) o para personas obesas y otras con riesgo a padecer diabetes mellitus tipo 2. Si la glucemia en ayunas (basal) es superior a 126, no se realizan las curvas a las embarazadas: Directamente se la diagnostica de Diabetes gestacional. Tras una carga oral de 75g de glucosa, a las dos horas, la glucemia debe ser inferior a 200. Se proporciona una carga oral de glucosa de 100 g a las personas con antecedentes familiares de diabetes: Si la basal es mayor de 105, ya sería patológica. Los rangos de normalidad serían tras una hora de administrar la carga oral de 100 g, tener < 190, a las 2h < 165, a las 3 horas, tener < 200. También se me facilitó abundante información sobre la diabetes y las curvas de glucosa.

4. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ( 20 Julio-2Agosto) 4.1 Sección de orinas (Urocultivos) En esta sección se llevaba a cabo el análisis de las placas en las que las auxiliares habían sembrado previamente muestras de orina. Las placas que se empleaban con mayor frecuencia eran AGAR SANGRE y URI. Las de agar sangre servían para realizar un contaje de colonias aproximado del microorganismo que estaba causando la infección. De esta forma, si las colonias se extendían por toda la placa, el contaje era >100.000 ufc/ ml; si el crecimiento confluía en la parte superior, 10.000-100.000 ufc/ml ; y si aparecían colonias aisladas en la sección superior, < 10.000 ufc/ml. Si aparecía más de un microorganismo, la muestra se desechaba por contaminación y se pedía una nueva muestra. El medio URI permitía diferenciar tipos de microorganismos; las colonias aparecían de distinto color. Si existía alguna duda sobre la identidad de los microorganismos se realizaban pruebas: De la Coagulasa, oxidasa, catalasa, indol, tinciones Gram y observación de la morfología al microscopio. Posteriormente se realizaba un antibiograma, con el fin de determinar las resistencias a antibióticos de la cepa que estaba causando la infección y aconsejar al médico la prescripción del medicamento más apropiado. Había que coger un poco de la colonia con una torunda y diluirla en la cantidad de agua apropiada para obtener una turbidez de 0.5 Mc farland. Enseguida se extendía con la torunda por toda la placa, y se aplicaban los discos con antibióticos con un dispensador. Se medía el diámetro del halo de inhibición al día siguiente para determinar la magnitud de la sensibilidad.

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Antes de tomar cualquier determinación se revisaba exhaustivamente el historial de infecciones urinarias del paciente, y se consideraba si estaba bajo tratamiento, ingresado.. En la sección de orinas también se analizaban placas con semen, de pacientes con prostatitis u tras afecciones. Para la detección de micoplasma y ureaplasma se empleaba una placa especial, Mycobiotic. Pude observarlas al microscopio. UROPATÓGENOS: FRECUENTES: E.Coli, S.saprofiticus,Enterococcus, Proteus mirabilis, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa. E.Coli era el microorganismo que causaba la mayor parte de las infecciones de orina, se veía rosa en el Uri. Había que realizar una tarjeta de identificación para determinar la cepa, y un antibiograma en disco placa. Proteus spp eran indol positivo, excepto P.mirabilis, que era indol negativo. Si eran indol positivo había que realizar una tarjeta de identificación (tecnología similar a la del API, solo que con más pruebas y monitorizado) RAROS, INFRECUENTES: Citrobacter, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Serratia ssp, Staphylococcus aureus, Corynebacterium urealitycum. S.aureus era coagulasa+ y betahemolítico. UROPATÓGENOS DUDOSOS: S.agalactiae, acinetobacter spp, Stenotrophomonas maltophilie,Pseudomonas. Los estreptococos eran PYR negativos (otra prueba de identificación), excepto el Streptococcus pyogenes que era positivo; los enterococos eran PYR positivos también. Se realizaban también pruebas de aglutinación para ver si era un estreptococo tipo B (como S.agalactiae) o A. FLORA HABITUAL URETRAL/GENITAL : Staphylococcus coagulasa negativos, (excepto S.saprofiticus), Streptococcus alfa hemolíticos, Corynebacterium spp (excepto C. urealyliticum), Bifidobacterium spp, Lactobacilos, Gardnerella vaginalis. También realicé test de filamentación en levaduras; se incubaba durante > 3 horas un extracto de la levadura en suero de embarazada (presumiblemente sana, sin infecciones) y luego se hacía una preparación en fresco y se observaba en el microscopio a X40. Si filamentaba, se trataba probablemente de Candida albicans. Si no, se realizaba una tarjeta de identificación.

4.2 Sección de HECES (Coprocultivos) Las muestras de heces eran sembradas por las auxiliares, primero se pasaban a medio líquido (selenito), en el podían crecer salmonella y shigella, y luego a medio sólido, placas de HEKTOEN.

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En Hektoen, se podían distinguir colonias rojas (Lactosa +) que no eran patógenas y colonias lactosa negativas que eran patógenas y debían someterse a un TSI.(Klieger) El TSI indicaba si la bacteria fermentaba la lactosa y la glucosa (todo amarillo,ácido) si sólo fermentaba la glucosa (parte de abajo amarilla, arriba roja), si producia gas o se veían depósitos negros de hierro. El proteus reaccionaba de manera parecida a la salmonella. También en Hektoen podían detectarse bacterias productoras de sulfhidrico, que reaccionaban con el Fe generando precipitados negros. Se pasaban a ASAP. ASAP era un medio para Salmonella( lactosa negativas y productoras de SH2), que se basa en la actividad de la enzima esterasa propia de las salmonella. En ASAP se podían cultivar más enterobacterias, como E.Coli enteropatógenas (lactosa+), shigella (lactosa -). Si se confirma el diagnóstico de salmonella, se ha de aglutinar para ver qué tipo de salmonella es, se debe hacer un tipaje. Había un medio sólido para la detección de Campylobacter (provocan diarreas), que llevaba carbón. Se incubaba a 42ºC durante dos días, en condiciones de anaerobiosis. También había otro medio para Yersinia, que son manitol positivo y se ven como colonias rojo neutro. En McConkey se podían distinguir microorganismos no enterobacterias: Vibrios (parahemolítico y cholerae) que son lactosa negativos; aeromonas oxidasa positivas, y Plesiomonas. En heces también se determinaba la presencia de parásitos: Fasciolas (trematodos), nematodos, cestodos y oxiuros como enterobius vermicularis (mediante parche anal se conseguían los huevos) Durante mi estancia tuve la oportunidad de probar un nuevo método para la obtención de parásitos, COPROPACK®. Los parásitos que observé al microscopio fueron: Entamoeba coli (con muchos núcleos), hymenolepis nana (con protuberancias que la diferencian de la H.diminuta) y blastocystis hominis (con una gran vacuola central) Presencia de virus: Rotavirus y adenovirus mediante test que detecta el antígeno principal. Toxina de C.difficile: Se realiza por inmunocromatografía. La prueba detecta el ag y la toxina. Pero es menos sensible para la toxina, de modo que si ésta no se detecta se cultiva y se intenta de nuevo. Antígeno de H.pylori: Produce úlceras gástricas. 4.3 Otros cultivos. Se analizaban exudados de heridas, frotis vaginales, exudados óticos.. - Heridas y abcesos: Se empleaban las placas agar sangre (crece de todo excepto haemophilus), agar chocolate, y MConkey, (selectivo de bacilos gram negativos, las sales biliares inhiben a los gram+) El H.haemophilus requería los factores V y X, no accesibles en el medio agar sangre. El H,influenzae requería solamente el factor V. Teniendo en cuenta los requisitos, se hacían ensayos para ver que tipo era ( En un sector de la placa se colocaba factor V y en el otro extremo X; en el medio los dos factores, y se veía si crecía o no. Se realizaba también un cultivo secundario en caldo de tioglicolato, se veía la turbidez. Después se pasaban a placa (cultivo secundario) El S.aureus crecía en ese medio de forma especial:”cielo estrellado” y era claramente distinguible.

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Si la prueba de la catalasa daba positiva y la coagulasa negativa, se realizaba un cultivo en Muller Hinton , con novobiocina. Si es resistente a la novobiocina, se trata de Staphylococcus saprofiticus. -Frotis vaginales: Se empleaban placas agar chocolate, Saboureaud (crecen levaduras, posteriormente se realiza un test de filamentación para ver si es Candida albicans) y medio para Neisseria (detección de gonococos) La presencia de lactobacillus (se veían como verdosos) en cantidades moderadas era indicativo de flora vaginal sana. La presencia de S.agalactiae se debía considerar especialmente en embarazadas, ya que en exceso podía causar daños al feto. Habia un medio específico para la detección de S.agalactiae, se veían naranjas. 4.4 Sección de micobacterias Su detección y aislamiento se realizaba en un departamento separado, que era esterilizado con Rayos UV. Se siembran esputos, previa recontaminación selectiva con sosa y acetilcisteína para eliminar todo lo demás. También líquido pleural. Se sigue un protocolo determinado de siembras y resiembras, en medio líquido y en medio sólido (Lowenstein Jensen), y se revisan los tubos durante al menos dos meses, 3 veces por semana, para ver si ha habido crecimiento. La tinción preferida es Auramina-rodamina , y se mira a 200x en el microscopio de fluorescencia. Son ácido alcohol resistentes, y se pueden teñir también mediante la tinción Ziehl Nielssen, se observarán bacilos rojos, que se apilan formando como una cuerda. En auramina –rodamina se veían bacilos dorados al microscopio de fluorescencia. 4.4 Sección de hemocultivos Se incubaba el suero de los pacientes en frascos para aerobios/anaerobios y se observaba si había crecimiento. Se detectaba la producción de color, cambios en la D.O,..Luego se pasaban a placa. 4.5 Serología En esta sección no trabajé nada, ni me explicaron nada, solo dieron unas cuantas pinceladas. Detectaban infecciones agudas (presencia de grandes concentraciones de IGM) Eran ensayos ELISA. Los sueros se guardan durante más de 8 años. De esta forma se puede determinar cuándo contrajo el paciente un VIH, por ejemplo. Por PCR se medía la carga viral (VIH) y hepatitis C. También se podía trabajar con el papiloma. Detectaban también brucelosis. Pude observar rickettsias al microscopio de fluorescencia. 5. LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. Orinas. (3-6 julio) Tras haber sido registradas por el PSM, las orinas debían introducirse en racks y en el aparato URISYS 2400 para su análisis. El fundamento de medida de este aparato era la fotometría de reflectancia. Determinaba la cantidad de leucocitos,

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nitritos,pH orina, eritrocitos, densidad, y las proteinurias. El aparato seguía unas reglas CAR que le permitía hacer determinaciones adicionales. Seleccionaba las orinas con alguna patología para que se analizara por UF, citómetro de flujo, que medía la FSC (luz dispersa), la fluorescencia y la impedancia. Este aparato originaba una lista de orinas que debían ser centrifugadas para observar el sedimento al microscopio. El facultativo podía añadir/ eliminar orinas de la lista tras analizar los resultados emitidos por la máquina. 6. SECCIÓN DE PROTEÍNAS (9-13 julio) - Proteinogramas: Se hacían proteinogramas de suero, de orina de 24h y de LCR.

Se veían 5 o 6 fracciones (según el material que se use); cada una de ellas contiene una o más proteínas. Detecta cirrosis, síndrome inflamatorio agudo, gammapatías..

1. Albúmina 2. Alfa1 antitripsina, alfa 1 quimiotripsina 3. Alfa lipoproteínas, haptoglobulinas, ceruloplasmina, Gc globulina, alfa2

macroglobulina 4. Trasferrina, hemopexina, beta lipoproteína, C3 del complemento ( Esta

C3 puede constituir una única fracción)

Primero se hacía una electroforesis del suero; se añadían 10µl en cada uno de los pocillos de la peineta; tenía capacidad para correr 15 sueros a la vez. El aparato realizaba todos los pasos. Posteriormente se introducía el gel en otro compartimento del aparato para que leyera las bandas y obteníamos los proteinogramas. Se revisaban los patrones de bandas en el gel y se realizaban inmunofijaciones de los sueros con bandas anómalas, para determinar el tipo exacto de inmunoglobulina: Tipo de cadena ligera e isotipo.

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Las orinas de 24h debían ser concentradas en un aparato antes de sufrir electroforesis. - Inmunofijación: Se realizaban 3 diluciones: ½: 50µl suero + 50 µl de colorante; otra de 1/6, y otra de 1/3. Se dispensaban 10µl de la solución en los pocillos: 1: Libre 2: ELP: Dilución ½ 3: IgG: Dilución 1/6 4: IgA: Dilución 1/3 5: IgM: Dilución 1/3 6: Kappa: Dilución 1/3 7: Lambda: Dilución 1/3 8: Libre. Se seguían las instrucciones del programa; se añadían antisueros (25 µl en cada pocillo excepto en el ELP, que se añadían 40µl de fijador.. Con papel secante se retiraba el exceso de reactivo. El programa del aparato realizaba todos los procesos: Secado, lavado, coloración, decoloración, etc.. Finalmente detectabamos en el gel el tipo de banda que era. Nefelómetro: Cuantifica, da la cantidad de Ig A, M, G, prealbúmina, C3, C4, orosomucoide, B2 microglobulina, kappa y lamba en suero; kappa y lambda en orina, alf1 microglobulina en orina, IgG en orina,.. Para la identificación de bandas anómalas, se empleará la inmunofijación. 7. MODULAR E (16-20 julio) Es un aparato que realiza determinaciones mediante inmunoensayos de electroquimioluminiscencia (ECLIA) Principio del test: Es una técnica sándwich en la que distinguimos los siguientes pasos:

- 1ª Incubación: 50 microlitros de muestra, un anticuerpo monoclonal biotinilado anti-X (siendo X la sustancia a determinar) y un anticuerpo monoclonal especifico anti-X marcado con quelato de rutenio forman un complejo sándwich.

- 2ª Incubación: Después de incorporar las micropartículas recubiertas de estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por interacción entre la biotina y la estreptavidina.

La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan temporalmente a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo Procell. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción electroquimioluminiscente cuya emisión de luz se mide directamente con un fotomultiplicador. Los resultados se obtienen mediante una curva de calibración generada por el sistema a partir de una calibración de dos puntos y una curva máster incluida en el código de barras del reactivo. 7.1 Parámetros que analiza este modular:

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- Metabolismo: Vitamínico: B12, ácido fólico (ambos en suero), 25OH Vit D3( En plasma EDTA) Óseo: PTH intacta (plasma, EDTA)

- Oncología AFP, CEA,CA15-3,CA19-9,CA72-4,CA125,NSE,CYFRA, SCC, betaHCG, Tpsa, FPSA, S-100. (Marcadores tumorales)

- Hormonas: Tiroides: TSH,FT4, FT3,TPO Fertilidad:BHCG, FSH,LH,Prolactina,pool PRL,18beta estradiol, progesterona, testosterona total, DHEAS, cortisol.

- Screening prenatal: Medida de determinaciones útiles para el cálculo de riesgo bioquímico que puede tener un feto de padecer trisomía del 21, defectos en el tubo neural y algún otro tipo de cromosomopatías. Se mide la AFP (alfafetoproteína) y la suma de la hormona gonadotropina coriónica humana intacta más la subunidad beta de la misma (HCG+beta). Se introducen los datos de la embarazada en un programa: Delphin®: Edad, semanas de gestación, si es diabética, fumadora,..y según eso y los valores de AFP y HCGbeta nos da el riesgo de tener un hijo con síndrome de Down o defectos en el tubo neural (para este último se consideran los valores de AFP).

Hay determinaciones que no se realizan a diario, sino una vez a la semana: Es el caso de la FSH,LH,PRL,18beta estradiol, pool PRL, progesterona, testosterona,DHEA-S y cortisol. Se guardan en la nevera a -20ºC hasta que se proceda a su análisis. 8. ÁREA DE INMUNIDAD Y ALERGIAS (23-25 julio) Se realizaba la determinación de autoanticuerpos, clave en el diagnóstico y pronóstico de la patología autoinmune: lupus eritematoso sistémico(LES),esclerodermia, artritis reumatoide,..etc Por ejemplo, la presencia de anticuerpos antiDNAds en pacientes con LES suele estar relacionada con la actividad de la enfermedad, particularmente en nefritis. Las metodologías empleadas eran las siguientes:

- Enzimoinmunosensayo cuantitativo en fase sólida - Enzimoinmunoensayo cualitativo en tira - Inmunofluorescencia indirecta (IFI) - Microscopía de fluorescencia

Lo primero que se realizaba era la determinación de anticuerpos antinucleares (ANA ) por ELISA. Hay un punto de corte establecido; si se supera, se continúa el estudio de ANA empleando células Hep-2 y técnica IFI. Para asegurarse de que los anticuerpos son de media y alta avidez (con implicaciones en patología) se emplea IFI con sustrato de Crithidia luciliae (Se detectan anticuerpos antiDNAds) Se realizan diversas diluciones de la muestra en distintos pocillos (todo está automatizado). Si ELISA es positivo y por IFI el suero es negativo se ha de realizar un análisis de Ag específicos por inmunoensayos; podría presentar anticuerpos contra la histidil tRNA sintasa (JO1) u otras.

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Puede ser positivo para AMA (anticuerpos antimitocondriales) o ASMA (anticuerpos antimúsculo liso); para su detección se emplea tejido triple de riñón-hígado-estómago de rata (RHE) Al microscopio de fluorescencia pueden distinguirse diferentes patrones de fluorescencia (mixto,moteado,nucleolar,etc) que guardan correlación con algunas patologías autoinmunes. Estas pueden ser resultado de autoanticuerpos antiDNA,anticentrómero, antimitocondrias,etc.

Estas pruebas aportan datos al clínico sobre el pronóstico de la enfermedad y ayudan a su diagnóstico (junto con más análisis) También se detectaban anticuerpos contra el citoplasma de neutrófilos, pANCA y C-ANCA Se asocian con vasculitis. Los antígenos asociados con el patrón C-ANCA (proteinasa 3) y P-ANCA (mieloperoxidasa) se hallan en los gránulos azurófilos de los neutrófilos. Detección de la Enfermedad celíaca (Intolerancia al gluten): Causada por autoanticuerpos tipo IgA contra la TGA y contra la gliadina. Por ELISA. También se estudian síndromes antifosfolípidos: Ac IgG /M anticardiolipina, antibeta2 glicoproteína,etc. Detección de anticuerpos anti CCP: Ayuda al diagnóstico en artritis reumatoide. En el área de alergias se realizaban screening, mediante INMUNOCAP: Alergias a alimentos,polvo,hongos,etc. Los antígenos del aparato se desconocen, la casa no facilita los datos.

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9. VALORACIÓN PERSONAL DE LAS PRÁCTICAS. Mi valoración global es positiva. He podido observar la dinámica de trabajo en un hospital y ahondar en todas las fases en que se divide un análisis clínico: La preanalítica, la analítica y la post-analítica (validación) - La atención por parte del personal ha sido aceptable, teniendo en cuenta el volumen de trabajo diario que tienen que afrontar. Prácticamente no ha habido seguimiento por parte del tutor. - La realización de tares manuales ha sido reducida y se ha concentrado en su mayor parte en el área de microbiología (realización de tinciones, antibiogramas, pruebas de identificación de microorganismos, resiembras, identificación de colonias patógenas en medio cromogénico..) en parte porque en el laboratorio de bioquímica está todo muy automatizado. He podido realizar también diversas observaciones de orinas al microscopio óptico con toda libertad y he aprendido a diferenciar los elementos que pueden presentar: Cilindros, hematíes, leucocitos, cristales de urato, de oxalato, células de vías bajas..Y también he podido observar muestras al microscopio de fluorescencia ( detección de autoanticuerpos, observación de rickettsias y bacilo tuberculoso)con el que no había tenido contacto durante la carrera. A mi juicio, el aprendizaje no ha sido tan práctico como deseara, pero al fin y al cabo ha resultado formativo.