LABORATORIJSKA

DIAGNOSTIKA V TROPIH

Mag. Elizabeta Božnar Alič, univ. dipl. biolog, spec. med. biokemije

UKC Ljubljana, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo

Vsebina predavanja

Laboratorijska diagnostika parazitov v krvi

- svetlobna mikroskopija

- hitri testi

- posamezni paraziti (malarija)

Laboratorijska diagnostika parazitov v blatu

- metode

- posamezni paraziti

WHO priporočila

Pri vseh bolnikih s sumom na malarijo je potrebno

pred začetkom zdravljenja okužbo potrditi z

mikroskopskim pregledom

(krvni razmaz/gosta kaplja)

ali s hitrim testom.

Ciljano/racionalno zdravljenje.

Laboratorijska diagnostika malarije

Svetlobna mikroskopija

Fluorescentna mikroskopija

Hitri testi

Serološke preiskave

PCR

Povzročitelj- Plasmodium sp.

Praživali (Protozoa)

Razred trosovci (Sporozoa)

Zapleteno razmnoževanje: izmenjujeta se nespolna (shizogonija) in spolna faza razmnoževanja (gametogonija)

Za zaključen razvojni krog potrebuje 2 gostitelja:

- sesalci, ptice (vrstna specifičnost)

- samica komarja iz rodu Anophels sp.

Razmnoževalni ciklus

GAMETOGONIJA

SPOROGONIJA

SHIZOGONIJA

SHIZOGONIJA

Svetlobna mikroskopija - 4 faze

1. Odvzem vzorca krvi ob pravem čas

2. Priprava krvnega razmaza in goste kaplje

3. Barvanje

4. Pregled pod mikroskopom

Metoda svetlobne mikroskopije:

- malo opreme/malo reagentov

- zelo odvisna od natančnosti, izurjenosti in znanja

mikroskopista (subjektivnost, artefakti)

Odvzem vzorca krvi

Kdaj: eritrocitni del razvoja parazitov (mrazenje, vročina, potenje,…)

Odvzem vzorca krvi:

- Venska kri (antikoagulant EDTA)-iz vene v komolčnem pregibu

- Kapilarna kri- palmarna površina sredica ali prstanca, ali lateralni del pete (otroci mlajši od enega leta)

Ponavljanje odvzema

(vsakih 6-8 ur/3 dni, oz. za

spremljanje terapije na 24,

48 in 72 ur)

Priprava krvnega razmaza

Razmaz mora biti

primerno tanek

Enakomerno

razporejen po celi

širini objektnega stekla

Končati se mora z

rahlo zaokroženim

repom

Krvni razmaz

Ime in

priim

ek

Priprava goste kaplje

Kapljo krvi razmažemo

v krogu na površino

1,5 do 2 cm2

Preparat sušimo na

zraku najmanj 1 uro

Barvanje -krvni razmaz

Barvanje po Pappenheimu:

- May-Grünwald: koncentrirana raztopina

- Giemsa: 2-5 % raztopina (redčimo s fosfatnim puferom pH 6,8 (komercialno pripravljen) ali vodo s čim bolj nevtralnim pH -7,0)

Postopek:

- May-Grünwald: 5 minut

- odlijemo, speremo z vodo

- Giemsa: 15 minut

- odlijemo, speremo z vodo

Barvanje-gosta kaplja

Preparat predhodno zelo dobro posušimo (najmanj 1 ura)!!!

Raztopina Giemsa: 2-5 % raztopina (redčimo s fosfatnim

puferom pH 6,8 (komercialno pripravljen) ali vodo s čim bolj

nevtralnim pH -7,0)

Postopek:

- Giemsa: 20-30 minut

- odlijemo, pazljivo speremo z vodo

Nepravilno obarvan krvni razmaz

Krvni razmaz, gosta kaplja

Gosta kaplja je 30-krat bolj

občutljiva metoda kot krvni razmaz!

Krni razmaz

Manjša občutljivost

Določitev vrste

Določitev parazitemije

(spremljanje uspešnosti

zdravljenja; če je to uspešno

pade parazitemija za 50 %

v 24-ih urah)

Artefakti

Gosta kaplja

30-krat bolj občutljiva

metoda kot krvni razmaz

(nizka parazitemija!)

Težje razlikovanje vrst med

seboj

Hemoliza E poškodba

parazitov

Artefakti

Lažno pozitivni rezultati: ostanki barvila, deli razpadlih celic, trombociti,

bakterije, glive.

Lažno negativni rezultati: nižja je parazitemija več je lažno negativnih

rezultatov; slabo poznavanje morfologije parazitov.

Napake pri določitvi vrste: zamenjava P. vivax/P. ovale.

Mikroskopiranje-razvojne oblike

Gametocit Shizont

Trofozoit - zgodnji Trofozoit - pozni

Mikroskopiranje-določitev vrste,

parazitemija

Oblika eritrocita (okrogel, ovalen)

Velikost eritrocita (mladi, zreli, stari)

Prisotnost granulacij v eritrocitu

Oblika trofozoitov

Število trofozoitov v eritrocitu

Število kromatinskih zrn (jedr) v trofozoitu

Število merozoitov v shizontu

Oblika gametocitov

Določanje parazitemije: % okuženih eritrocitov; spremljanje uspešnosti zdravljenja ( na 24, 48, 72 ur po uvedbi terapije)

Negativen rezultat: pregled najmanj 300 v.p./1000x

MIKROSKOP: 1000-kratna (imerzijska) povečava

Vrste plazmodijev

Plasmodium falciparum

Plasmodium vivax

Plasmodium ovale

Plasmodium malariae

Plasmodium knowlesi

Plasmodium falciparum-trofozoiti-razmaz

Okuži vse razvojne

stopnje eritrocitov

(visoka parazitemija)

Več prstanov v enem

eritrocitu

Parazit -2 jedra

Paraziti na robu

eritrocita

Plasmodium falciparum-gosta kaplja

Plasmodium falciparum-gosta kaplja

Plasmodium falciparum-shizonti

V periferni krvi ni shizontov (zreli imajo 18-28

merozoitov).

Nahajajo se v kapilarah notranjih organov in

kostnem mozgu, kjer tudi dozorijo.

Plasmodium falciparum-gametociti

Plasmodium vivax-trofozoiti

Napade le mlade eritrocite, okuženi eritrociti so povečani.

Zgodnji trofozoit: ima nežno citoplazmo in zavzema cca 1/3 eritrocita.

Pozni trofozoit: velik, z izrazito ameboidno citoplazmo, centralno vakuolo, v

eritrocitu so prisotne drobne rožnate Schüffnerjeve granulacije.

Plasmodium vivax-zrel shizont

Zrel shizont ima 14-22 merozoitov.

Nezreli shizonti

Plasmodium vivax-gametocit

Plasmodium vivax-gosta kaplja

Plasmodium ovale-trofozoit

Napade le mlade eritrocite, okuženi eritrociti so povečani, lahko imajo tudi

ovalno obliko in so nazobčani.

Zgodnji trofozoit: ima nežno a izrazito citoplazmo.

Plasmodium ovale-zrel trofozoit

Zrel trofozoit: je ameboidne oblike, v eritrocitu so prisotne drobne rožnate

Schüffnerjeve granulacije.

Plasmodium ovale-shizont

Zrel shizont ima 4-12 merozoitov.

Plasmodium malariae-trofozoiti

Napade le stare eritrocite, zato so okuženi eritrociti manjši.

Trofozoiti: imajo obliko sovjega očesa ali traku, ki poteka preko

celega eritrocita.

Plasmodium malariae-shizont

Zrel shizont ima 6-12 merozoitov.

Povzetek morfoloških značilnosti

P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae

okužba eritrociti vseh starosti mladi eritrociti mladi eritrociti stari eritrociti

trofozoiti

Schüffnerjeve

granulacije

NE DA DA NE

shizonti v periferni krvi jih ni

14-22

merozoitov

4-12

merozoitov

6-12

merozoitov

gametociti srpaste

oblike

okrogle

oblike

okrogle

oblike

okrogle

oblike

Artefakti: gosta kaplja, razmaz

Artefakti: trombociti, ostanki barvila, deli razpadlih

celic, smeti,…

Artefakti: razmaz

A: gametocit

P. falciparum

B: artefakt

C: trofozoit P. malariae

D: artefakt

Artefakti-krvni razmaz

Artekakti-gosta kaplja

Hitri testi za dokaz malarije

Imunokromatografski testi: za izvedbo ne potrebujemo

dodatne opreme (T hranjenja, zračna vlažnost)

Dokaz malarijskih antigenov s pomočjo monoklonskih

protiteles (HRP-2, aldolaza, pLDH)

Majhna količina krvi (5-15 µL)

Rezultat: v 5 do 20 minutah v obliki obarvane črte na

testnem traku ali ploščici

Interpretacija rezultatov (navodila proizvajalca!)

Hitri testi za dokaz malarije

KOMBINACIJA ANTIGENI VRSTA KI JO LAHKO DOLOČIMO

samo Pf Anti Pf HRP-2 spec. Okužba s P. falciparum

samo Pf Anti Pf pLDH spec. Okužba s P. falciparum

Pf in Pan Anti Pf HRP-2 spec. + anti Pan

pLDH spec. (ko-spec. za P.f., P.v.,

P.o., P.m.)

Okužba s P. falciparum in razlikovanje

P. falciparum okužbe od ne P.

falciparum okužbe

Pf in Pan

Anti Pf HRP-2 spec. + anti Pan

aldolaza spec. (ko-spec. za P.f., P.v.,

P.o., P.m.)

Okužba s P. falciparum in razlikovanje P.

falciparum okužbe od ne P.falciparum

okužbe

Pf in Pan

Anti Pf pLDH spec. + anti Pan

pLDH spec. (ko-spec. za P.f., P.v.,

P.o., P.m.)

Okužba s P. falciparum in razlikovanje P.

falciparum okužbe od ne P.falciparum

okužbe

Pf in Pv Anti Pf HRP-2 spec. + anti Pv pLDH

spec.

Razlikuje P. falciparum okužbo od P.

vivax

Vse vrste Anti pan pLDH spec. (ko-spec. za P.f.,

P.v., P.o., P.m.)

Vse okužbe s Plasmodium sp.

Pf, Pv in Pan Anti Pf HRP-2 spec. + anti P. vivax

pLDH spec + anti Pan pLDH spec.

(ko-spec. za P.f., P.v., P.o., P.m.)

Razlikuje P. falciparum okužbo od P.

vivax, zazna ne P. falciparum in P. vivax

okužbo

Lažno + rezultati:

HRP-2 antigen lahko

ostane prisoten v

krvi še do 28 dni po

zdravljenju

Lažno – rezultati:

- nizka parazitemija

- delno imuni pacinti z

nizko parazitemijo

Hitri testi

Ne omogočajo zanesljive določitve vrste

plazmodijev

Ne omogočajo določitve parazitemije in niso

primerni za spremljanje terapije

Niso nadomestilo za krvni razmaz, so le zamenjava

če le tega ni mogoče izvesti

Kadar je hitri test negativen se še vedno

priporočata izvedba krvnega razmaza in goste

kaplje

Trypanosoma sp.

Bičkar (Protozoa, Flagellata)

Za človeka patogeni podvrsti: Trypanosoma brucei gambiense in

T. b. rhodesiense (spalna bolezen)

Prenašalci so hematofagni insekti: muha Glossina sp. (ce-ce

muha) in roparske stenice

V krvi se nahaja v tripomastigotni obliki (12-35 μm)

Lab. diagnostika: krvni razmaz, gosta kaplja

JEDRO BIČEK

ONDULIRAJOČA MEMBRANA

BAZALNO ZRNO

Trypanosoma sp.

Artefakti

Filarije

Nitasti helminti (gliste), ki živijo v limfnih žilah, bezgavkah,

podkožju, vezivnih tkivih

Samice so dolge nekaj cm, samci so za polovico krajši

Nedozorele ličinke (mikrofilarije) se pojavijo v krvi, limfi in

podkožju

Pomemben je čas vzorčenja

Krvni razmaz, gosta kaplja

Gledamo pod manjšo

povečavo (200x, 400x),

v gostejšem delu preparata

Mikrofilarije

Vmesni gostitelji oz. prenašalci so različne žuželke

(komarji, obadi, muhe, mušice)

Ličinke-mikrofilarije so velike od 250 do 300 μm

Filarije

Wuchereria bancrofti (elefantijaza)

Brugia malayi (elefantijaza)

Loa loa

Mansonella perstans

Slonovica

Srpasto celična anemija

Hemoglobinopatija

Mutacija v genu za sintezo Hb (veriga β) - HbS

Homozigoti in dvojni heterozigoti

HbS slabo topen-obarjanje-nastanejo polimerizirani

vlaknati agregati, ki spremenijo obliko in lastnosti

eritrocitov, ti dobijo obliko srpa (drepanociti) in

postanejo togi

Življenska doba teh E je skrajšana- ekstravaskularna

hemoliza, nastane kronična hemolitična anemija

Srpasto celična anemija

Črevesni paraziti

V tropskih in subtropskih predelih velik zdravstveni

problem

Razširjenost je velika

Slabe socialnoekonomske razmere

Slabe higienske razmere

Glavne skupine:

- praživali: amebe, bičkarji,…

- ploščati črvi: metljaji in trakulje

- valjasti črvi: gliste

Paraziti v blatu

Pregled nativnega vzorca blata

Objektno steklo: blato suspendiramo v fiziološki

raztopini, pokrijemo s krovnim steklom in

mikroskopiramo pod 200 in 400-kratno povečavo

Paraziti v blatu-metoda koncentracije

Metoda flotacije (naplavljanja)

Koncentrirana (nasičena) raztopina NaCl

Razvojne oblike-Protozoa

Protozoa (enoceličarji): bičkarji, trosovci, korenonožci

Trofozoit: aktivna, vegetativna oblika, ki se giblje

Cista: mirujoča, odporna oblika

Razvojne oblike-Helminthes

Ploščati črvi: trakulje, metljaji

Valjasti črvi: gliste

Razvojne oblike: jajčece, ličinka

Entamoeba hystolitica

Protozoa, Sporozoa

(debelo črevo-razkroj tkiva, krvava driska, vir okužbe-človek, okužba z vodo, hrano, dotikom)

Vegetativna oblika Cista

Giardia lamblia

Protozoa, Flagellata (driska, duodenum, zg. del tankega črevesa, fekalno-oralni prenos prenos)

Ciste 1000x Ciste 400x

Shistosoma mansoni

Plathelminthes, Trematoda

Razširjen v osrednji Afriki

Metljaj živi v kapilarah

debelega črevesa

Jajčeca iščemo v blatu

Vmesni gostitelji so vodni

polži

Vstop v telo preko kože

Shistosoma haematobium

Razširjen v Afriki in

bližnjem vzhodu

Vmesni gostitelj je polž

Človek se okuži z ličinkami

v vodi; te vstopijo v telo

preko kože

Metljaj živi v venah okoli

sečnika

Jajčeca s trnom iščemo v

urinu

Ascaris lumbricoides

Človek edini gostitelj

Glista je razširjena je povsod

po svetu

Človek se okuži z jajčeci iz

nezavarovanih človeških

iztrebkov (pitna voda,

zelenjava, hrana…)

Preprečevanje onesnaženja

vode, živil in zemlje s človeškimi

iztrebki

V blatu iščemo značilna jajčeca

Trichuris trichiura

Človek je edini gostitelj

Odrasla glista živi v

slepem in debelem

črevesu

Način okužbe:

z umazano vodo,

hrano in umazanimi

rokami

Strongyloides stercoralis

Odrasle gliste (2 mm) živijo

v sluznici tankega in

debelega črevesa

Samica odlaga jajčeca, ki se

v razvijejo v ličinke in se

izločajo z blatom

Človek se okuži z ličinkami ki

živijo v vodi/zemlji in

prehajajo v telo preko kože

(kri, pljuča, sapnik,

požiralnik, črevo)

Ancylostoma duodenale/ Necator

americanus

Razširjena v tropih in

subtropih

Odrasle gliste (8-13 mm)

živijo v sluznici tankega

črevesa, kjer sesajo kri

(anemija)

Človek izloča jajčeca z

blatom

Okužba poteka skozi usta

ali preko kože (filariformna

ličinka-zemlja onesnažene z

iztrebki)

Za ustrezno diagnozo je potrebno

Sum na okužbo s paraziti (podrobna anamneza o hrani, ki jo je užival preiskovanec; o socialno-ekonomskih razmerah,…).

Odločitev o vrsti ustreznega vzorca.

Zadosti pogosto odvzeti vzorci.

Ustrezna metoda.

Poznavanje patogeneze, razmnoževalnega ciklusa in morfologije razvojnih oblik posameznega zajedavca.

Artefakti

Ascaris lumbricoides Artefakt

Artefakti

Artefakt Ascaris lumbricoides

Artefakti

Artefakt

Jajčece Fasciola hepatica

Jajčece Ascaris lumbricoides

SPORE GOB

SPORA GOMOLJIKE

CELICA PELODA

ALGA

SPORA GOBE

SPORA GOMOLJIKE

RASTLINSKA CELICA

SPORA GLIVE

ELEMENT RASTLINSKEGA IZVORA

JAJČECE PRŠICE

JAJČECE GLISTE

RASTLINSKI MATERIAL

ELEMENT RASTLINSKEGA IZVORA

JAJČECE PRŠICE

RASTLINSKI MATERIAL

NN IZVOR