Herramientas Moleculares

Enzimas de Restricción

Clonación Molecular

Sistema Modificación-Restricción !  Sistema inmune para la contra patógenos en bacterias,

protegiéndolas del ataque de DNA foráneo (ej.: bacteriófago).

!  R: endonucleasa (corte ADN).

!  M: modifica al DNA por metilación (metilasa)

!  Cada enzima de restricción tiene una metilasa asociada.

!  Ambas enzimas reconocen la misma secuencia de bases. La metilasa metila una base determinada siempre dentro de la secuencia de reconocimiento, mientras que la endonucleasa puede cortar dentro de la secuencia de reconocimiento o fuera de ella, dependiendo del tipo de enzima.

!  La metilación en las dos hebras del DNA evita que la Enzima de Restricción pueda cortar la molécula de DNA. Este mecanismo es empleado por las bacterias para proteger a su propio DNA genómico y plasmídico del ataque de sus propias Enzimas.

!  También llamadas endonucleasas de restricción.

!  1962: “Tijeras Moleculares” descubiertas en bacterias.

!  Las bacterias tienen un sistema inmune enzimático que reconoce ADN foráneo y lo destruyen.

!  3,000 enzimas han sido identificadas, alrededor de 200 tienen propiedades únicas y muchas de ellas han sido purificadas y están disponibles comercialmente.

Enzimas de Restricción

Propiedades de las enzimas de Restricción

Cortan enlace fosfodiéster del material genético a partir de secuencias de 4 a 12 pb que reconocen.

Secuencias de reconocimiento

! Cada enzima de restricción siempre corta a la misma secuencia de reconocimiento.

! Una enzima siempre produce el mismo patrón de bandeo en una región de ADN específico (fingerprint)

! Muchas enzimas de restricción reconocen secuenciad palíndromes:

!  5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’

CCCGGGGGGCCC

SmaI

GGTACCCCATGG

KpnI

Extremos cohesivos

! Muchas enzimas de restricción producen cortes escalonados.

! El corte escalonado produce una porción de ADN de hebra simple o “extremo cohesivo”

! ADNs de diferente fuente puede ser fácilmente ensamblado en extremos cohesivos compatibles.

EcoRI

HindIII - OH 3’

Extremos romos

AluI

HaeIII

! Algunas enzima cortan el ADN en la base opuesta o complementaria.

! Estas enzimas dejan extremos romos sin dejar regiones de hebra simple.

Nomenclatura de las enzimas

Según su origen: 1.  Tres letras que corresponden al nombre

científico del microorganismo (Género y especie) 2.  2º La cepa o estirpe si la hubiese. 3.  3º Número romano, para distinguir

endonucleasas aislada de una misma especie. 4.  Ejemplos:

-  EcoRV: Escherichia coli, cepa RY13, quinta enzima descubierta.

-  HindIII: Haemophilus influenzae serotipo d, tercera enzima descibierta.

Algunas enzimas de restricción:

Enzima Organismo del que deriva Secuencia blanco (cut at *) 5' -->3'

BamHI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C

EcoRI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C

HindIII Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T

NdeI Neisseria denitrificans CA* TATG

PstI Providencia stuartii C T G C A * G

SmaI Serratia marcescens C C C * G G G

TaqI Thermophilus aquaticus T * C G A

XmaI Xanthamonas malvacearum C * C C G G G

Tipos de enzimas de restricción (sistema R-M)

Tipo I:

! En la misma enzima tienen 2 subunidades para la restricción, 2 subunidades para la modificación (metilación) y una subunidad para el reconocimiento.

! Tanto la metilación como el corte requieren de ATP.

! El corte se da a alguna distancia del lugar de reconocimiento.

! Poco valor para manipulación genética.

Tipo II: !  No tienen actividad metilasa, solamente tienen

actividad de endonucleasa.

!  No requieren de cofactores como ATP por lo que su uso es más sencillo.

!  El lugar de reconocimiento generalmente es simétrico y cortan al DNA en el lugar de reconocimiento.

!  Requieren Mg 2+ como cofactor

Tipo IIs: !  Son parecidos a los del tipo II, pero la

restricción ocurre en lugares del DNA alejados del lugar de reconocimiento, por lo que su uso en ingeniería genética también es reducido.

Tipo III: !  Tienen lugares de reconocimiento simétricos,

pero se parecen en lo demás a los sistemas del tipo I, por lo que son poco útiles.

!  Requieren ATP como cofactor importante.

Aplicaciones de las enzimas de restricción

! Mapeos de restricción.

! Fragmentación de ADN para electroforesis y Southern Blot.

! Clonación molecular: “ADN Recombinante”.

Definición:  “Molécula  de  ADN  lineal  o  circular,  que  se  replica  independiente  del  cromosoma  y  que  con9ene  genes  ú9les  pero  no  necesarios  para  la  

supervivencia  celular”.      

Ocurrencia:  -­‐  Procariotas  (bacterias  y  archeas).  -­‐  Eucariotas  (protozoos,  levaduras,    plantas).  

Tamaño:  100  a  400.000  pb  (1  a  400  Kb).        

PLÁSMIDOS  

Representa<vidad:    "  1  copia  (plásmidos  grandes).  "  Hasta  100  copias  (plásmidos  pequeños).  

Replicación:  "  Requiere  maquinaria  celular.  "  El  número  de  copias  es  regulado  por  el  inicio  de  replicación.  

*Incompa<bilidad:  Ocurre  cuando  dos  plásmidos  no  pueden  mantenerse  estables  en  la  misma  célula,  porque  la  replicación  de  uno  interfiere  con  la  del  otro.    *  Episomas:  Algunos  plásmidos  pueden  integrarse  en  el  cromosoma.  

PLÁSMIDOS  

               Clasificación  de  Plásmidos    

1.  Por  su  habilidad  de  transferirse  a  otras  bacterias    

1.1  Plásmidos  conjuga<vos:  Estos  plásmidos  se  transfieren  a  otras  bacterias  a  través  de  un  pili  sexual.    

Conjugación  

Conjugación:  Importancia  

•  Bacterias  Gram  -­‐    − Resistencia  an9microbianos  − Diseminación  rápida  

•  Bacterias  Gram  +    − Producción  de  factores  de  adherencia  − Resistencia  an9microbianos  

"  Gran  tamaño  (100  kb)  "  Bajo  número  de  copias  (1/2  x  célula)  "  Se  transfiere  por  si  mismo.  "  repE  codifica  para  la  prot.  de  replicación  RepE.  "  RepE  se  une  al  origen  de  replicación  (oriS)  e  inicia  la  

replicación  del  plásmido.    "  RepE  se  une  al  promotor  de  repE  ac9vando  la  transcripción.  

Plásmido  F  

 Pili  Conjugación    

Organización  plásmido  F  

               Clasificación  de  Plásmidos      

1.  Por  su  habilidad  de  transferirse  a  otras  bacterias    

1.2  No  conjuga<vos  Plásmidos  que  no  se  conjugan.  Algunos  pueden  conjugar  pero  con  la  ayuda  de  otros  plásmidos  conjuga9vos.  .    1.3  Movilizables:  Con9enen  sólo  algunos  genes  requeridos  para  la  transferencia.  Éstos  pueden  parasitar  a  otros  plásmidos,  transfiriéndose  con  alta  frecuencia  en  presencia  de  uno  conjuga9vo.    

2.  Clasificación  de  Plásmidos    

2.1  Fer<lidad-­‐(Plásmido  F).  Plásmidos  conjuga9vos  y  que  con9ene  todos  los  genes  necesarios  para  este  proceso.    2.2  Resistencia-­‐(Plásmido  R)  

 Con9enen  genes  que  otorgan  resistencia  a  an9bió9cos  u  otros  compuestos  .    2.3  Plásmidos  Col:  

       Con9enen  genes  que  codifican  para  colicinas  (proteínas  que  matan  a  otras  bacterias).    

 2.4  Plásmidos  degrada<vos.  

 Genes  que  9enen  relación  con  la  diges9ón  de  sustancias  químicas  complejas  como  tolueno  o  ácido  salicílico.    

2.5  Plásmidos  de  Virulencia.    Genes  de  virulencia.  

 2.6  Plásmidos  de  adicción.  

 Genes  Toxina-­‐An9toxina.    

Herramientas Moleculares

CLONACIÓN MOLECULAR

26

# Clonamiento: Proceso para producir poblaciones de individuos genéticamente idénticas. # Clonamiento Celular: Producir células genéticamante idénticas

Clonamiento

Clonación Molecular

# Se refiere al proceso de aislar una secuencia de ADN de interés, insertarlo en un plásmido o vector de clonación y obtener múltiples copias de ella en un organismo (generalmente procariota) por acción de la DNA polimerasa.

Vector de clonación

# Molécula pequeña de ADN que puede replicarse de manera autónoma en un huésped (células bacterianas o de levaduras).

# Los vectores se utilizan para clonación porque pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales de ADN sean incorporadas en su material genético.

Características de los vectores de clonación

Tipos de vectores de clonación

# Plásmidos # Bacteriófagos (Fago lambda) # Cósmidos # Fásmidos (fagémidos).

# Cromosomas Artificiales: #  Bacmidos (bacterias). #  YAC (Levaduras).

PLÁSMIDOS Moléculas de ADN generalmente circular extracromosomal que se replican indepedientemente del DNA cromosómico. Pueden contener un tamaño de inserto no superior a 20 Kb.

Los plásmidos naturales pueden conferir a las bacterias las siguientes características: #  Resistencia a antibióticos, metales pesados, UV. #  Degradación de productos del petróleo #  FACTORES DE VIRULENCIA:

- Toxinas: E. coli enteropatogénica - Factores de adherencia: pili en E. coli

- Adhesinas - Hemolisinas - Bacteriocinas - Efectores de virulencia. #  Control del metabolismo de lactosa, rafinosa, citrato,

galactosa, xilosa. #  Fijación del nitrógeno.

Un plásmido natural puede ser:

1) Conjugativos

2) No conjugativos

Bacteriófagos (Fago Lamda)

Es un virus bacteriófago, cuya región central del genoma es prescindible y se puede sustituir por un inserto de ADN. Tamaño de inserto 10- 15 kb. Se forma un multímero que luego se utiliza para rellenar cápsides del fago mediante empaquetamiento in vitro.

Cósmidos Son vectores híbridos entre el fago H y un plásmido. Se pueden replicar en una bacteria o empaquetarse como un fago. Tamaño de inserto hasta 45 kb. Se remueve casi todo el ADN del H y se deja sólo las secuencias que actúan como señales de empaquetamiento (cos). Casi todo se rellena con el inserto que queremos clonar. Se replican a modo de plásmido

Fásmido

Son vectores que combinan las características de un fago filamentoso y un plásmido y contienen tanto el origen de replicación del fago como del plásmido.

Cromosomas artificiales: Bácmidos y YACs: Se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos.