Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, Vol. 10, No. 1, January 2005 ( C 2005)

DOI: 10.1007/s10911-005-2542-5

La supervivencia de las células madre mamarias en suspensión Cultura: Implicaciones para la Biología de Células Madre y Neoplasia

Hay evidencia creciente de que una variedad de neoplasias incluyendo cáncer de mama puede resultar de la transformación de las células madre y progenitoras normales. En el pasado, el aislamiento y la caracterización de las células madre mamarias ha visto limitado por la falta de sistemas de cultivo adecuadas capaces de mantener estas células en un estado indiferenciado in vitro. Recientemente hemos descrito un sistema de cultivo en el que las células madre y progenitoras mamarios humanos son capaces de sobrevivir en suspensión y producir colonias esféricas compuestas de ambas células madre y progenitoras. Observación reciente de que las células madre adultas de otros tejidos también pueden conservar la capacidad de crecimiento en condiciones independientes de anclaje sugiere un mecanismo común subyacente.

Proponemos que este mecanismo implica la interacción entre la vía de señalización Wnt canónica y E-cadherina. La vía de Wnt se ha implicado en la auto-renovación de células madre normales in vivo. Además, hay evidencia de que la desregulación de esta vía en la glándula mamaria y otros órganos puede jugar un papel clave en la carcinogénesis.

Thus, the development of in vitro suspen- sion culture systems not only provides an important new tool for the study of mammary cell biology, but also may have important implications for understanding key molecular pathways in both normal and neoplastic stem cells.

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Introduccion

El aislamiento y la caracterización de las células madre y progenitoras específicos de tejido ha ganado impulso debido a las importantes ideas que su estudio puede proporcionar en el desarrollo normal y ESIS carcinogénesis. Las células madre adultas se definen por su capacidad de auto-renovación y diferenciación en linajes de células presentes en un tejido específico (1,2). Auto-renovación asegura la propagación del compartimento de células madre, que funcione. En muchos órganos, las células madre se dividen lentamente dan lugar a un tránsito, la amplificación de la población de células progenitoras que proliferan activamente en respuesta a señales específicas. Estas células indiferenciadas son multipotentes y generan los progenitores linaje restringido que posteriormente se someten a la diferenciación terminal (3). Mientras que las células madre

mamarias aún no se han aislado y caracterizado, su existencia in vivo en ratones se demostró inequívocamente por su vez sostiene la morfogénesis, la reparación de tejidos y el mantenimiento. Diferenciación genera las células especializadas que forman cada órgano y aseguran su normalidad

En órganos pueden, las células madre se dividen lentamente dan lugar a un tránsito, la amplificación de la población de células progenitoras que proliferan activamente en respuesta a señales específicas.

Estas células indiferenciadas son multipotentes y generan los progenitores linaje restringido que posteriormente se someten a la diferenciación terminal.Mientras que las células madre mamarias aún no se han aislado y caracterizado, su existencia en ratones ONU vivo se demostró inequívocamente por estudios de trasplante en serie

estudios de trasplante en serie (4,5). La evidencia de la existencia de células madre mamarias adultas y las estrategias empleadas por su aislamiento y caracterización fueron revisados a fondo en varios trabajos recientes (6,7). El objetivo de esta revisión será en el desarrollo de métodos para el cultivo de la mamaria células madre / progenitoras adultas y el potencial de la aplicación de estos sistemas en biología de células madre.

PROPAGACIÓN IN VITRO DE células madre normales en cultivo en suspensión.

Lo ideal sería que las células madre se purifican por aislamiento directamente a partir de tejido para evitar los artefactos introducidos por la manipulación in vitro (2). La purificación de las células madre se basa en encontrar un número de rasgos morfológicos y moleculares, incluyendo antígenos de superficie, que las distinguen de todas las otras células en el tejido de interés (8). La mayoría de los protocolos de enriquecimiento de células madre / purificación se basan en células activadas por la clasificación por fluorescencia (FACS) o inmuno magnética clasificación y utilizan conjuntos de anticuerpos contra proteínas de la superficie celular. Cuando no se conoce la firma molecular, que es el caso para las células madre mamarias, la tarea de aislar las células madre implica un proceso tedioso de la detección de un gran número de marcadores putativos para identificar los que co-segregar con atributos funcionales de stemness .

Como definición de trabajo mínimo, estos atributos incluyen auto-renovación y capacidad de generar progenie diferenciada. En la generación in vivo de un tejido funcional es la prueba definitiva de la "troncalidad" de cualquier marcador candidato. Sin embargo, el cribado gran número de marcadores candidatos en ensayos in vivo de trasplante en el fin de encontrar la firma de células madre es poco práctico. Por otra parte, hasta hace poco, la falta de un sistema de cultivo que al-mínimos para la propagación de los progenitores mamarias en un estado indiferenciado ha impedido la prueba de auto-renovación in vitro.

Hemos desarrollado un sistema de cultivo, basado en el trabajo previo en la biología de células madre neurales, que supera esta incapacidad de los sistemas anteriores para mantener y propagar células madre y progenitoras mamarias.

En 1992 Reynolds y Weis publicaron un estudio en el que mostraron que las células neuronales aisladas de la zona subventricular de embriones de rata pueden proliferar en cultivo en suspensión, generando clonalmente colonias esféricas, que ellos llamaron neuroesferas (9). Un análisis clonal de neuroesferas demostró que el 20% de estas células, la proliferación in vitro en respuesta a EGF y bFGF estimulación, eran capaces tanto de auto-renovación y diferenciación a lo largo de múltiples linajes, las características definitorias de las células madre (10). Dos años más tarde, el mismo grupo demostró que neu- ral células madre / progenitoras de animales adultos tienen la misma capacidad de propagar in vitro como neuroesferas (11).

Desde entonces, numerosos estudios que utilizan células derivadas de o bien el sistema nervioso central o periférico, a partir de tejido embrionario y adulto mostraron que la capacidad de generar neuroesferas in vitro pondiente lates con el número de células madre en el tejido de origen (12-14) . Implantado en el sistema nervioso de un animal huésped, neuroesferas generan células que auto renuevan, así como diferenciar y contribuyen a los diversos compartimientos celulares del receptor cerebro de ani- mal (12,13).

Por lo tanto, estas células son capacidades ble de auto-renovación y diferenciación multilinaje, tanto in vitro como in vivo. Este sistema experimental ha sido una herramienta muy útil en la biología de las células madre neurales. Fue utilizado como un modelo in vitro para el desarrollo temprano (15,16), para identificar los factores que intervienen en la determinación del destino celular y desentrañar las vías de señalización activos en las células progenitoras tempranas (17-19) tallo y. Una serie de estudios utilizaron este sistema para el perfil transcripcional comparativo con el fin de identificar la expresión del gen cambia de autorrenovación y diferenciación subyacente específica linaje (20-23).

Estos estudios demostraron éxito del injerto, la migración al sitio de la lesión y diferenciación de las células derivadas de esfera en neuronas funcionales con grados variables de recuperación conductual y anatómica. Estos resultados hacen que el caso para el uso potencial de estas células progenitoras, propagadas in vitro en cultivo en suspensión, en la reparación de tejidos dañados en vivo. La cultura neurosphere también se utiliza rutinariamente ahora para evaluar el enriquecimiento de células madre en los experimentos usando células Sort- ing para la identificación de marcadores de células madre (12,13). Formación Neurosphere también se utilizó para evaluar el tamaño de la población de células madre en el tejido neural de los ratones genéticamente manipulados en los experimentos con el objetivo de investigar el papel de los genes tales como BMI (23), PTEN (27), LIF y Notch (28,29) en la auto-renovación.

mammospheres no adherentes

Recientemente hemos adoptado el cultivo en suspensión como una estrategia para el enriquecimiento y la propagación in vitro

La supervivencia de las células madre mamarias en cultivo en suspensión de células madre / progenitoras mamarias humanas (30). Basado en el modelo de neuroesferas, la hipótesis de que una pequeña población de células mamarias con propiedades de células madre sería capaz de sobrevivir y proliferar en ausencia de fijación a un sustrato exógeno.

Hemos desarrollado un sistema de cultivo en el que las células epiteliales mamarias humanas, aisladas de mammoplasties de reducción, se cultivan sobre un sustrato no adhesivo en medio libre de suero en presencia de EGF y / o bFGF. Bajo estas condiciones, la gran mayoría de las células se someten a "anoikis."

Este término se aplica específicamente a la apoptosis de las células no transformadas que se produce en ausencia de anclaje a un sustrato. La hipótesis de que anoikis era una característica de las células diferenciadas, pero que las células madre podría sobrevivir en condiciones independientes de anclaje.

Consistente con esta hipótesis, se encontró que aproximadamente cuatro de cada 1.000 células recién aisladas son capaces de sobrevivir y proliferar, y formar esferoides multicelulares. Hemos denominado estos esferoides "mammospheres" en virtud de su parecido con neuro esferas cultivadas a partir de células neuronales primarias. Como es el caso para neuroesferas, hemos demostrado que mammospheres son altamente enriquecido en las células no diferenciadas, como se demuestra por la capacidad de las células individuales aisladas de mammospheres para generar colonias EAGE multilingüismo cuando se cultivan en presencia de suero en un sustrato de colágeno que promueve su diferenciación (Fig. 1 (a)).

Mammospheres primarios contienen ocho veces más bi-linaje de células progenitoras que las células mamarias humanas recién cultivadas. Mammospheres secundarias y posteriormente pasajes consisten en virtualmente.

Fig. 1. mammospheres se componen de células madre / progenitoras. Células sembradas a densidades clonogénicos puede mammosphere derivados de: (a) la auto renovarse, (b) generar colonias mixtas que contienen células de todos los tres tipos de linaje mamarias (immunostained con marcadores específicos de linaje, ductal epitelial-ESA, marrón; mioepiteliales-CD10, púrpura ; alveolar, beta-caseína-rojo) (c) generar estructuras complejas en cultivo 3D Matrigel, (d) generar excrecencias-alveolar ductales in vivo.

78 Dontu y Wicha aliado 100% progenitores unipotentes. Además, la mayoría de los progenitores bipotentes son capaces para generar colonias de la ATE que contienen los tres linajes de la glándula mamaria de adultos, mioepiteliales, epitelio ductal, y las células epiteliales alveolares

También hemos demostrado que mammospheres contienen células capaces de generar clonalmente estructuras funcionales complejos en sistemas de cultivo 3D reconstituyó en Matrigel (Figs. 1 (c) y 2).

Auto-renovación de una población celular dentro de mammospheres se demostró utilizando un ensayo en el que las células individuales de mammospheres son capaces de generar esferas de segunda generación y posteriores (Fig. 1 (b)). Hemos demostrado que mammospheres se generaron por clonación usando retroviral marcado. Además, hemos demostrado que mammospheres derivados de estas células a pases también tienen múltiples potencial de diferenciación potente. These results resem- ble those reported for neurospheres (10,31) and are consistent with a model in which the mammosphere- forming cell represents a mammary stem cell which undergoes limited self renewal and then gives rise to mammary progenitors still capable of multi-lineage differentiation (32). Clonal experiments in which spheres were grown from single cells and single mam- mospheres were passaged, suggest that one or two self-renewal divisions are involved in the formation of a single mammosphere

Este número limitado de divisiones de auto-renovación está de acuerdo con la mayoría de los estudios con células madre adultas, que indicar que la expansión de la población madre adultas no se produce fácilmente ex vivo, presumiblemente debido a las divisiones celulares asimétricas cinéticas que dan lugar a una gran número de progenitores y células diferenciadas y un pequeño número fijo de células madre. Our findings indicate that mammary stem cells are contained in the small pop- ulation of cells that are anchorage independent and survive suspension culture to proliferate and differ- entiate into mammary progenitor cells (30).

Para determinar si la capacidad de las células para formar mammospheres se correlaciona con el enriquecimiento en células progenitoras, hemos probado la capacidad de formación de esferas de la población lateral (SP) de las células epiteliales mamarias (30). SP representa una subpoblación de células capaces de exclusión de colorantes, tales como rodamina y Hoechst, debido a la expresión de proteínas transportadoras, tales como BCRP (proteína de resistencia de cáncer de mama pro-) y glicoproteínas P (33). Se ha demostrado que la fracción de SP hematopoyéticas y células neurales contiene la repoblación de células madre a largo plazo (34).

Este fenómeno también ha sido recientemente demostrada para las células mamarias de ratón con propiedades SP, que puede regenerar la glándula tras el trasplante (35). En nuestro estudio SP y no-SP población tinción de las células no cultivadas fueron separadas por FACS y se colocan en cultivo en suspensión. Sólo las células contenidas en la fracción SP eran capaces de la formación de mammosphere en cultivo en suspensión así como la generación de colonias multilinaje sobre sustratos de colágeno (30).

Con el fin de evaluar la composición celular de esferas mamográficas utilizamos inmunotinción con marcadores específicos para las células mamarias diferenciadas de epitelio luminal (ESA, Muc1, citoqueratina 18) y mioepiteliales linajes (CD10, ASMA, citoqueratina 14, al- pha 6 integrina) . Algunos de estos marcadores fueron iden- tificado en estudios previos como asociadas con células bi-potentes progenitoras (ESA, alfa 6 integrina) (36,37) o madre mamarias / células progenitoras (citoqueratina 5). Mammospheres contenían células positivas para alfa 6 integrina, citoqueratina 5 y CD10, la ESA y citoqueratina 14 (30).

ER y PR expresión también fue detectable mediante inmunotinción en mammospheres y en colonias generados a partir de mammospheres sembraron en un sustrato de colágeno. Una subpoblación de las células ER positivos también fue positiva para el marcador de proliferación Ki67 ación, lo que indica que estas células pueden dividir in vitro. Después de 5-7 días de cultivo en una expresión de ER sustrato colágeno ya no se detectó, lo que sugiere que es downregulated durante diferenciadas ación in vitro (observaciones no publicadas).

Hemos encontrado recientemente que, cuando se trasplantan en la almohadilla de grasa mamaria limpiado de NOD / ratones SCID, mammospheres generado excrecencias limitados con las características morfológicas y celulares de la estructura alveolar humano una mamario ductal (Figs. 1 (d) y 2). Tan sólo 500 mammospheres trasplantados (10,000-25,000 células) generaron crecimientos salidas, en ausencia de fibroblastos humanos. Mejora de injerto se obtuvo mediante el uso de mammospheres combinados con fibroblastos mamarias humanas, como se describe por Kuperwasser et al. (38). Se requerirá titulación experimentos ción para determinar el enriquecimiento absoluta en la actividad de reconstitución de las células de la glándula mammosphere derivada.

Hemos utilizado el sistema de cultivo mammosphere para delimitar las vías de señalización implicadas en la especificación de destino celular de las células madre / progenitoras mamarias, como Notch y Sonic Hedgehog (32). Ensayos de ING US- para auto-renovación y diferenciación in vitro que desarrollamos con este sistema, que mostraron que la señalización Notch regula las decisiones del destino celular en la glándula mamaria en varias etapas de desarrollo distintas. Renovación Notch activación aumenta auto de células madre mamarias, así como la actuación sobre la supervivencia de las células madre mamarias en cultivo en suspensión 79 Fig. 2. (a)

Estructura ductal alveolar desarrollado plenamente crecido en Matrigel a partir de una mammosphere secundaria, inmunotiñeron con marcadores específicos de linaje (células mioepiteliales se tiñen de color rojo con rojo CD10-Texas y células epiteliales ductales se tiñen verde con ESA-FITC) (b) Igual que a, mayor magnificación.

(ck) mammospheres generan crecimientos en la almohadilla de grasa mamaria despejado. Tinción Todo el montaje (rojo carmín) y H & E secciones de tejido a través de una almohadilla de grasa mamaria de ratón: sin despachar [(c) y (f)], se aclaró, no implantado [(d), (g)], aprobado e implantado con mammospheres derivados de células epiteliales mamarias humanas [(E), (h), (k)]. La inmunotinción utilizando específica humana de anticuerpos ESA - sección de tejido a través de

una glándula mamaria de ratón (i), la glándula mamaria humana (j), el ratón se aclaró la grasa-pad implantados con mammospheres humanos (k). 80 células progenitoras Dontu y Wicha para promover la adopción de la mi- destino celular mioepiteliales en un paso posterior, durante la diferenciación. De Sonic hedgehog también vía parece tener un papel en la regulación de auto-renovación de las células madre mamarias, probablemente también interactuar con la vía de Notch.

Con base en las observaciones de que las células madre embrionarias, así como al menos dos tipos de células madre / progenitoras a partir de tejido neural y el tejido mamario, tienen la capacidad de sobrevivir y proliferar en una manera independiente de anclaje, se especula que el cultivo en suspensión podría ser utilizado como un método para aislar células madre adultas / progenitoras de otros tejidos. De hecho esto fue confirmado recientemente en el caso de la piel (39), cardíaca (40), y las células madre del oído interno (41) que ha generado el mismo tipo de colonias esféricas en cultivos en suspensión, compuestas de células con propiedades funcionales madre y progenitoras flotante.

Células madre del cáncer y esferas TUMORALES

Nosotros y otros han propuesto recientemente un modelo en el que la carcinogénesis mamaria es impulsado por células madre tumoral derivadas de mutado madre adultas o células progenitoras (7,42). Este modelo se basa en el concepto ampliamente aceptado que el cáncer surge a través de una serie de mutaciones que pueden ocurrir durante muchos años. Dado que las células madre adultas están dividiendo lentamente, células de larga vida con una alta capacidad de proliferación, que son capaces de acumular las múltiples mutaciones que se producen durante la carcinogénesis (1,42). La exposición a agentes que dañan durante largos períodos de tiempo, pueden acumularse y propagar las mutaciones inducidas por los agentes tóxicos genotipos.

Estas células madre o progenitoras transformadas pueden a su vez convertirse en "las células madre del cáncer", que mantienen o adquirir propiedades funcionales presentes en las células madre normales, incluyendo la capacidad de autorrenovación y diferenciación. Las mutaciones acumuladas en el "cáncer de células madre" interrumpen el estricto control de estas funciones de células madre, en última instancia conduce a la

desregulación de la auto-renovación, que impulsa el proceso de tumorigénesis, y para la diferenciación aberrante, que genera la heterogeneidad celular encontrado en los tumores. La existencia de las células madre del cáncer se demostró por primera vez en neoplasias hematológicas y, más recientemente, en los tumores sólidos (43-46). En un comentario anterior analizamos con más detalle las características funcionales compartidas por las células madre normales y células cancerosas, como la capacidad de auto-renovación, capacidad de diferenciarse, la telomerasa activa, la activación de anti vías de apoptosis, el aumento de la actividad de transporte de membrana, la independencia de anclaje y capacidad de migrar (4).

Comparando el perfil transcripcional de madre / células progenitoras tempranas con la de las células más diferenciadas del epitelio mamario, propusimos que la primera se asemeja más a la de las células de cáncer que el segundo. Esta observación sugiere una mentira circuitos moleculares comprensión que hace que las células transformadas con más facilidad que las células diferenciadas madre. Un acontecimiento clave en la transformación puede ser la desregulación de vías tales como la auto-renovación, que ya son activos en las células madre.

La evidencia directa de la existencia de las células madre del cáncer se proporcionó por primera vez por el trabajo del grupo de John Dick en neoplasias hematológicas (43). Ellos demostraron la presencia de una población de células madre de cáncer en las leucemias humanas, lo que representa una fracción muy pequeña de la población leucémica total, que era capaz de transferir la enfermedad a ratones inmunodeprimidos. Además, las células madre leucémicas compartieron la expresión de los marcadores fenotípicos con células madre hematopoyéticas normales. Basándose en estos estudios, propusieron que los diferentes fenotipos leucémicas el resultado de mutaciones particulares en poblaciones de células madre hematopoyéticas, lo que resultó en la diferenciación aberrante de estas células (43,47).

En colaboración con el grupo de Clarke presentamos recientemente evidencia de la existencia de las células madre del cáncer de mama hombre humano (45). La citometría de flujo se utilizó para separar subpoblaciones de células en base a su expresión de marcadores de superficie. Una subpoblación de células tumorales, con el fenotipo CD44 + CD24- lineage-, que posee características altamente tumorigénicas, era que identificó. El subconjunto tumorigénico, que representa una minoría de la población celular total dentro de un tumor, se definió por los mismos marcadores en la mayoría de los tumores examinados. Tan sólo 200 de estas células formado consistentemente tumores en ratones NOD / SCID.

En contraste, la mayor parte del tumor, que con- células contenidas con diferentes fenotipos de la superficie celular, no pudo formar tumores incluso cuando decenas de miles de células fueron inyectadas. Con el fin de determinar si este sistema experimental meramente seleccionado para un subconjunto altamente tumorigénico de las células, se analizó el fenotipo de tumores producidos en ratones NOD / SCID por las células tumorigénicas prospectivamente aisladas. Los resultados mostraron que la pequeña población de células tumorigénicas fue capaz de regenerar toda la heterogeneidad fenotípica encontrado en el tumor inicial.

Estos hallazgos apoyan un modelo de células madre de la carcinogénesis, en el que una pequeña población de células oncogénicas, con fenotipo definible, es capaz de dar lugar a más de supervivencia de las células madre mamarias en cultivo en suspensión 81 células oncogénicas, así como la popu tumor mayor - mento, sin propiedades oncogénicas. Por lo tanto, las células madre tumorigénicas, al igual que sus contrapartes normales, son capaces de someterse tanto auto-renovación y diferenciación.

La existencia de un fenotipo de células madre de cáncer en los tumores cerebrales También se ha sugerido por dos grupos que utilizaron en el cultivo in vitro de células tumorales cerebrales en suspensión, como neuroesferas (46,48). Singh y colaboradores utilizaron este sistema experimental para identificar células madre del cáncer de varios tumores cerebrales humanos

(46). Su estudio mostró una correlación entre la capacidad de auto-renovación de las células madre del cáncer, demostrado por la formación de la esfera, y la agresividad clínica de los tumores cerebrales de los que proceden estas células. También demostraron que estas células madre cer cánceres de tumores cerebrales tenían la capacidad de generar progenie diferenciada in vitro, similar al tumor a partir del cual se aislaron las células.

Más recientemente, han demostrado que las células madre del cáncer de cerebro, expresando la célula madre de CD marcador neuronal 133 son capaces de formar tumores en ratones NOD / SCID, mientras que CD 133 células negativas no (47) son. Por otra parte, cuando se inyectan en animales, células CD 133+ generaron tumores heterogéneos compuestos por dos CD 133+ y las células CD133-. Curiosamente, sólo CD 133+ células eran capaces de formar neuroesferas.

Por lo tanto, como hemos demostrado previamente para el cáncer de mama, el modelo de células madre de la carcinogénesis también se aplica a los cánceres de cerebro.

¿Cómo las células madre EVITAR "anoikis" - un modelo teórico

Una cuestión fundamental es si la independencia anclaje de las células madre normales no es más que un fenómeno in vitro. ¿El mecanismo molecular responsable de esta propiedad también juegan un papel en el comportamiento de células madre in vivo? Vamos a especular más sobre esta última posibilidad y proponer un mecanismo que podría coordinar proliferación y la supervivencia du- rante diferenciación de células madre / progenitoras con la adhesión célula-célula y la integración en la arquitectura del tejido maduro. La supervivencia de las células individuales en cultivo en suspensión implica la supervivencia en la ausencia de interacción célula-matriz y interacciones célula-célula.

Interacciones célula-matriz

Nuestro análisis de mammosphere mostró la presencia de moléculas de la matriz incluyendo tenascina, decorina y laminina (30). Curiosamente, la decorina y tenascina están presentes en la glándula mamaria embrionaria, mientras que la laminina también está presente en la membrana basal de la glándula adulto, lo que sugiere que la formación de mammosphere puede recapitular algunos de los eventos que se producen durante el desarrollo embrionario y mamaria temprana in vivo. Parece que las células que escapan anoikis, representados principalmente por las células madre y las células progenitoras tempranas, posiblemente, sintetizar y matriz extracelular depósito, creando un nicho in vitro que apoya su supervivencia y la proliferación en suspensión.

Sin lugar a dudas, las interacciones-estroma epitelial también están involucrados en la generación del nicho del desarrollo de células madre in vivo. Recientes observaciones por grupo de Weinberg (38), así como la nuestra, demuestran que el estroma mamario potencia en gran medida el crecimiento y la diferenciación del epitelio mamario humano (a partir de fragmentos epiteliales y mammospheres) en ratones NOD / SCID.

Las interacciones entre las células mammosphere iniciadoras y su progenie y entre los componentes celulares y extracelulares de las esferas, dictan los tipos de divisiones (auto renovación vs. diferenciación) y el destino de la célula adoptadas por las células (linaje compromiso Ment). Queda por determinar en qué medida este comportamiento recapitula acontecimientos que ocurren en vivo. Uno podría especular que la señalización iniciada por las moléculas de la matriz se acopla conjuntos específicos de integrinas expresadas por las células progenitoras mamarias, pro- mover su supervivencia. Señalización a través de receptores de factores de crecimiento presentes en estas células, probablemente, también juega un papel importante en la supervivencia celular. La supervivencia de las células de RCE cánceres en los sitios de metástasis puede emplear mecanismos similares. Una advertencia importante de la extrapolación de datos in vitro a los

eventos en vivo se ha ilustrado recientemente en el sistema neuroesfera. En condiciones in vitro alterado la especificación potencial y destino de las células progenitoras neurales, la generación de células totipotentes, no vistos en vivo (49).

Interacciones célula-célula

Interacciones célula-célula son cruciales para la supervivencia de las células epiteliales, tanto in vitro como in vivo. Un componente importante de este proceso es E-cadherina (50). La pérdida de este mecanismo de adherencia es probablemente involucrados en la apoptosis masiva que se produce durante la involución mamaria, después de la lactancia (51).

Curiosamente, la resistencia de las células mamarias madre / progenitoras a la apoptosis durante la involución conserva las poblaciones que regeneran la glándula

82 Dontu y Wicha durante los embarazos posteriores. E-cadherina es un miembro de una familia de un solo paso transmembrana glicoproteínas que desempeña un papel en el establecimiento de células polarización dad y la morfología de los tejidos (50).

La principal do- extracelular de cadherina E interactúa homotypically con una molécula de E-cadherina en una celda adyacente. El dominio citoplásmica de E-cadherina está vinculada a la citoesqueleto a través de la interacción con las cateninas. Una interacción importante es con beta-catenina, una molécula en la vía de señalización Wnt canónica. La conexión entre la E-cadherina y la señalización de Wnt y su papel en el desarrollo normal de mama y ESIS carcinogénesis fue objeto de una revisión reciente excelente (52). Vamos a discutir este sentido desde la perspectiva de la carcinogénesis que resulta de dereg- autorrenovación ulated de las células madre o renovación auto adquirido por las células progenitoras tempranas. Beta-catenina está presente en dos localizaciones celulares.

En asociación con la E-cadherina, que forma las uniones adherentes. En el citoplasma, beta-catenina está presente en un complejo con proteínas tales

como la poliposis adenomatosa coli (APC) y axina. Ante la falta de señalización de Wnt, catenina beta es fosforilada y específica para la degradación (53). Cuando se activa Wnt, en fosforilada translocación beta-catenina al núcleo, donde se une y activa los factores de transcripción TCF LEF, que entonces se activa una variedad de genes diana aguas abajo, incluyendo c-Myc y ciclina D1 (54,55). Recientemente se ha propuesto que el equilibrio entre la beta-catenina presente en las los adherentes junc- y que participen en la actividad transcripcional es controlada por el grupo de APC intracelular (56). Por otra parte, la evidencia de estudios de Drosophila indica que APC regula la orientación del cabezal y la división celular asimétrica (57).

Una correlación inversa entre la E-cadherina y la señalización de Wnt se ha observado en diversos tejidos y órganos, durante el desarrollo, así como en los cánceres (58). En algunos cánceres epiteliales humanos, las mutaciones de genes de cadherina E-Pro- señalización de Wnt mote, como se juzga por la detección de beta-catenina nuclear en el tejido tumoral (58). También se ha demostrado que la E-cadherina puede mediar la supresión del crecimiento por la inhibición de la señalización de beta-catenina, en una manera dependiente de la adherencia (59).

En las células epiteliales mamarias cultivadas, la inhibición de la E-cadherina agregación celular dependiente predispone a la muerte celular. En estudios in vivo, utilizando ratones transgénicos y el sistema de recombinasa Cre / lox, demostró que alve- diferenciación olar durante la lactancia es dependiente de la expresión de E-cadherina (60). Por otra parte, como se indicó anteriormente, la alteración de la adhesión celular E-cadherina-dependiente probablemente inicia el programa de apoptosis durante la involución mamaria. La interacción de la E-cadherina con beta-catenina parece Medi comió estos procesos. Además, estudios recientes proporcionan evidencia de un mecanismo inverso, beta-catenina / Lef1 supresión a saber nuclear mediada por E-cadherina expresión durante el desarrollo normal de los folículos pilosos en ratones (61). Los autores proponen que la regulación a la baja de la E-cadherina puede a su vez perpetuar la vía de señalización Wnt,

mediante el aumento de la piscina de la beta-catenina transcripcionalmente competente.

El equilibrio cambiante entre los niveles de E-cadherina y citoplásmico beta-catenina, bajo el control de la señalización de Wnt, podría remodelar las junc- celulares, coordinando la proliferación celular con adhe- sión de células durante la diferenciación. Especulamos que las células madre y progenitores tempranos, a diferencia de su progenie más diferenciado, no dependen de interacciones célula-célula para la supervivencia. En apoyo de esta hipótesis es la capacidad de una variedad de células madre / progenitoras para sobrevivir en cultivo en suspensión, como se discutió anteriormente. Por otra parte, las pequeñas células de luz mamarias (SLC), descritos por Smith y Chepko (62), cree que tallo o células progenitoras tempranas, polaridad falta y contactos de membrana especializadas con las células vecinas. La ausencia de las proteínas de unión brecha, incluyendo conexinas, en las células progenitoras mamarias se describió por Trosko et al. (63).

La utilización, el perfil transcripcional de mammospheres así como células diferenciadas derivadas de mammospheres, encontramos que E-cadherina se incrementa el nivel triple expresión diferenciación ing durante, mientras que los represores de la E-cadherina Caracol y Slug son downregulated de tres y dos veces, respectivamente (30). En ausencia de las uniones adherentes y E-cadherina, la mayor parte de la beta-catenina se localiza en el citoplasma. Señalización a través de los resultados de la vía Wnt en la actividad transcripcional de beta-catenina mediada que activa diferentes conjuntos de genes, lo que se traduce en la auto-renovación y diferenciación. El resultado probablemente depende de las señales que modulan la respuesta vía Wnt y las interacciones con otras vías implicadas en ficación destino especificado. Mientras se produce la diferenciación, la E-cadherina ex compresión aumenta progresivamente, adherens forman uniones y los mecanismos antiapoptóticos están regulados abajo. Nuclear beta-catenina y su actividad cional transcripción disminución (Fig. 3).

En consecuencia, las células diferenciadas no son capaces de migrar, dependen de la adhesión célula-célula para su supervivencia, proliferación y eRate menos. A favor de los cambios sion este gen escenario expresión inducida por la beta-catenina transactivación muestran upregulation de c-Myc, ciclina D1 (proliferación), estromelisina-1, MMP 7 y Twist (migración) y en la Fig. 3. Conexión Wnt-E-cadherina en células madre auto-renovación, la diferenciación y la carcinogénesis. Los niveles de beta-catenina transcripcionalmente activa y la membrana E-cadherina están inversamente correlacionados y cambian progresivamente durante la diferenciación. En respuesta a la señalización de Wnt, madre / progenitoras de células E-cadherina es downregulated, la catenina beta recién sintetizado se dirige hacia la piscina citoplasmática y se transloca al núcleo, donde se regula la auto-renovación. Durante la diferenciación, la expresión de E-cadherina aumenta progresivamente y beta-catenina es reclutado al sitio uniones adherentes, la disminución de la piscina de citoplasmática beta-catenina disponible para la actividad transcripcional

La activación anormal de los resultados de la señalización de Wnt en un aumento de la auto-renovación de las células madre o células progenitoras tempranas. Mutaciones posteriores pueden dar lugar a la iniciación y progresión del cáncer.

84 Dontu y Wicha en la regulación de la E-cadherina, Ephrin y BMP4. Además, Fujita et al. informaron que estos eventos están bajo la regulación hormonal, e implican el receptor trogen es- (64). Ellos mostraron que en la glándula mamaria expresión de E-cadherina está regulada por el receptor de estrógeno a través de MTA3, un componente de la / NuRD complejo represor transcripcional Mi-2 que es un inhibidor regulada ER de Snail, una represión sor de E- cadherina (64).

Durante la carcinogénesis un evento clave puede ser representado por una activación anormal de ING señalización Wnt, lo que resulta en un aumento de la auto-renovación de las células madre o células progenitoras tempranas. La vía de Wnt se ha asociado tanto con el desarrollo normal de la glándula

mamaria, desde las primeras etapas de la formación de anlage a la diferenciación terminal durante la lactancia (de 65-68). Además, la creciente evidencia apunta a un vínculo entre la señalización de Wnt y neoplasia mamaria (69-71). Por otra parte, parece que el papel de la activación de Wnt en la auto-renovación de células madre podría ser la base de su potencial oncogénico (72).

Un número de estudios han proporcionado recientemente evidencia de un papel directo de la señalización de Wnt en la auto-renovación de hematopoyéticas normales, epidérmico, y las células madre del intestino (73-76). El papel de Wnt de señalización en la auto-renovación de células madre mamarias fue sugerido por estudios recientes de Alexander et al. que utilizan ratones transgénicos para demostrar que la sobreexpresión de ligandos Wnt en el estroma mamario o activa beta-catenina en el epitelio mamaria conduce a un mayor número de células madre mamaria (77). Un vínculo directo entre la autorrenovación de vástago / células progenitoras y la carcinogénesis fue sugerido por el estudio de Li et al. que demostró en un modelo de ratón que la expresión de los componentes de la vía de señalización Wnt-induce preferentemente cánceres de mama derivadas de células progenitoras mamarias (70).

Mutaciones posteriores favorecidos por el aumento de la actividad proliferativa pueden ocurrir durante la iniciación y la progresión del cáncer. Sin embargo, algunos de los rasgos que confieren selectiva ventaja de crecimiento a las células cancerosas y contribuyen a la invasión y metástasis locales son atributos normales de las células madre. La observación de que los mecanismos epigenéticos pueden ser responsables de alteraciones tales como la pérdida de E-cadherina, durante la carcinogénesis es consistente con esta hipótesis.

CONCLUSIONES

En este artículo, hemos revisado el desarrollo de sistemas de cultivo basados en suspensión para la propagación de las células madre y progenitoras de la glándula mamaria, así como de otros órganos. La capacidad de las células madre normales, así como sus homólogos malignos, para sobrevivir en cultivo en suspensión sugiere un mecanismo molecular común que también puede tener importancia para el comportamiento de las células madre in vivo. Se discute la evidencia que sugiere que la vía de señalización Wnt y de las interacciones E-cadherina-beta-catenina puede jugar un papel clave en la auto-renovación de células madre normal y diferenciación, así como la supervivencia. Además, se está acumulando evidencia de que la desregulación de esta ruta desempeña un papel importante en una variedad de neoplasias, incluyendo cáncer de mama. Estas neoplasias, a su vez, puede ser accionado por un pequeño componente de células madre dentro de los tumores. Este componente de células madre, resistentes a los tratamientos convencionales, puede contribuir a la recaída después de la terapia. La inhibición de las vías, tales como la señalización de Wnt, puede por tanto llegar a ser una nueva estrategia terapéutica para dirigir selectivamente esta población de células sistant re-.

Agradecimientos:

Debo dar las gracias al Dr. Michael Clarke para ayudar- discusión ful, Dr. Kathleen Ignatoski, Dr. Suling Liu, el Dr. Ilia Mantle, y el Dr. Nam-shik Ahn para su revisión crítica de este trabajo. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones Nos. CA66233 y CA101860.