La regolazione della trascrizione nei procarioti - unicz.it · repressore lac perchè la sua...

Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

La regolazione della trascrizione nei procarioti


La regolazione della trascrizione

• Un gene regolatore codifica una proteina che controlla la trascrizione legandosi a uno o più siti specifici sul DNA

– i siti bersaglio si trovano di solito (ma non sempre) subito a monte del gene bersaglio della regolazione.

• Il promotore ed il terminatore che segnano l’inizio e la fine di una unità di trascrizione sono tipici esempi di sequenze cis-agenti.

Concetti di base• Sequenze cis-agenti

– le sequenze cis-agenti non vengono convertite in nessuna altra forma, ma funzionano direttamente in situ nel DNA, e hanno efffetto esclusivavemte sul DNA (o RNA) al quale sono fisicamente legate

• Sequenze che codificano per prodotti trans-agenti– un gene è una sequenza di DNA che codifica per un prodotto diffusibile. Il prodotto può essere una proteina

(nella maggioranza dei casi) o un RNA (nel caso dei geni che codificano per tRNA o per rRNA). il concetto cruciale è che il prodotto del gene diffonde dal sito di sintesi per agire altrove.

• Geni strutturali– codificano per proteine (o RNA). I geni strutturali codificano per una enorme varietà di proteine, tra cui sia

proteine strutturali vere e propie che enzimi con attività catalitica.• Geni regolatori

– codificano per proteine la cui funzione è di regolare l’espressione di altri geni.


Regolazione negativa• La regolazione negativa è il modo

classico di regolare l’espressione genica nei batteri

• Nella regolazione negativa una proteina repressore impedisce ad un gene di essere espresso.

• Nello “stato basale” il gene è espresso grazie al riconoscimento diretto del suo promotore da parte della RNA polimerasi.

• Vicino al promotore c’è un altro sito cis-agente, chiamato operatore, che il sito bersaglio del repressore.

• Quando il repressore lega l’operatore, la RNA polimerasi non può iniziare la trascrizione e di conseguenza, non c’è espressione genica.


Regolazione positiva • La regolazione positiva viene utilizzata anche dai batteri, ma è la maniera di gran lunga più frequente con cui gli eucarioti regolano l’espressione dei loro geni.

• Un fattore di trascrizione è necessario per aiutare la polimerasi ad iniziare la trascrizione.

• Nello stato basale il gene è inattivo e la polimerasi non può iniziare la trascrizione al promotore.

• Uno o più fattori trans-agenti hanno il loro sito bersaglio nelle vicinanze del promotore, ed il loro legame permette alla polimerasi di iniziare la trascrizione.

• In entrambi i tipi di regolazione, delle proteine trans-agenti riconoscono delle sequenze cis-agenti.

Queste proteine riconoscono sequenze molto corte, in genere meno di 10 paia di basi (la polimerasi copre 70 paia di basi, ma le sequenze cruciali per il riconoscimento sono i due esameri).

Una differenza importane tra l’organizzazione genica dei procarioti e quella degli eucarioti è che i geni dei batteri sono organizzati in gruppi (clusters), mentre quelli degli eucarioti sono singoli. Il raggruppamento dei geni permette il controllo coordidato dei geni raggruppati da un solo promotore.


L’operone

• Un caso tipico è il gruppo (cluster) dei 3 geni strutturali lac, lacZYA. Il gruppo di geni è trascritto in un singolo mRNA policistronico da un singolo promotore regolato.

• Le proteine del gruppo permettono al batterio di metabolizzare i β-galattosidi (es. lattosio)– lacZ codifica per la β-galattosidasi, che divide i β-galattosidi in zuccheri semplici

• per esempio il lattosio è scisso in glucosio e galattosio, che viene poi ulteriormente metabolizzato– lacY codifica per la β-galattoside permeasi, che trasporta i β-galattosidi nella cellula– lacA codifica per la β-galattoside transacetilasi, un enzima che trasferisce un gruppo acetilico

dall’acetil-CoA ai β-galattosidi.• L’intero sistema, compresi gli elementi che controllano l’espressione genica, forma una unità

di regolazione che si chiama operone. L’attività dell’operone è controllata dai geni regolatori, le cui proteine interagiscono con le sequenze cis-agenti del promotore.

• La trascrizione dei geni lacZYA è controllata da una proteina regolatrice sintetizzata dal genelacI. Il gene lacI si trova vicino ai geni strutturali, ma è una unità di trascrizione indipendente con il propio promotore e terminatore

– codificando per un prodotto diffusibile potrebbe essere ovunque anche su un’altra molecola di DNA

I geni strutturali dei batteri sono spesso organizzati in gruppi (clusters) contenenti geni che codificano per proteine le cui funzioni sono collegate.


L’espressione dei geni lac è controllata da un repressore

• Il repressore agisce legandosi ad un operatore(Olac) situato al’inizio del gruppo di geni lacZYA. L’operatore si trova in questo caso tra il promotore ed i geni strutturali.

• Quando il repressore si lega all’operatore, impedisce alla RNA polimerasi di iniziare la trascrizione al promotore.

• L’operatore si estende dalla posizione -5 alla posizione +21 dell’unità di trascrizione. Quindi la sequenza dell’operatore si sovrappone alla sequenza della parte destra del promotore.

I geni lac sono controllati da regolazione negativa: sono trascritti a meno che non vengano spenti da una proteina regolatrice. Il prodotto del gene lacI è chiamato repressore lac perchè la sua funzione è di impedire l’espressione dei geni strutturali. Ci sono ≈10 repressori in una cellula batterica normale.


L’operone lac può essere indotto• In assenza del substrato, l’operone è trascritto ad un

livello basale molto basso.• La trascrizione comincia appena il substrato è aggiunto

– i livelli dello mRNA lac aumentano rapidamente fino ad un livello dettato dal bilanciamento tra la sintesi dell’RNA e la sua degradazione

• l’RNA lac è estremamente instabile, con una emivita di 3 min

• La trascrizione cessa non appena il substrato è rimosso, in breve tempo tutto il mRNA lac è degradato ed il contenuto cellulare ritorna a livello basale.

• La traduzione dell’RNA lac produce β-galattosidasi– l’enzima compare 2-3 minuti dopo l’agginta del substrato,

e in breve ci sono ≈5000 copie dell’enzima per batterio• nelle condizioni appropiate, la β-galattosidasi può

rappresentare fino al 5-10% delle proteine totali del batterio– se il substrato è rimosso dal mezzo di cultura, la sintesi

dell’enzima cessa con la stessa rapidità con cui era iniziata• l’enzima è più stabile dell’RNA, quindi rimane più a lungo.

• Le molecole che inducono la sintesi di enzimi in grado di metabolizzarle si chiamano induttori.

La sintesi di un enzima in risposta alla comparsa di un substrato specifico si chiama induzione (in assenza di β-galattosidi, non c’è necessità di β-galattosidasi, e il batterio contiene <5 copie dell’enzima).


L’attività del repressore è controllata dall’induttore a basso peso molecolare

• Quindi una componente diversa dall’enzima riconosce l’induttore.

• La componente che è regolata dall’induttore è il repressore lacI.

• In assenza dell’induttore, il repressore è legato all’operatore ed i geni lacZYA non sono espressi.

Solamente il substrato o una molecola molto simile può agire da induttore. L’attività di induttore non dipende dall’interazione con l’enzima. Alcuni induttori assomigliano agli induttori naturali dell’operone lac, ma non sono metabolizzabili; per esempio, l’isopropiltiogalattoside (IPTG) non lega la β-galattosidasi, ma è un induttore molto efficiente. Le molecole che inducono l’espressione genica ma non vengono metabolizzate si chiamano induttori gratuiti.


• Quando viene aggiunto l’induttore, il repressore si stacca dall’operatore e la trascrizione ha inizio.

• La struttura dell’operone permette una regolazione coordinata: tutti i geni sono (o non) espressi assieme.

• Se l’operatore è represso, come fa l’induttore a entrare nel batterio?

• Livello basale e diverso sistema di trasporto

• Le caratteristiche essenziali del circuito di controllo risiedono nelle duplici proprietà del repressore:

– può impedidire la trascrizione;– può riconoscere l’induttore.

• Il repressore ha due siti di legame:– uno per l’operatore;– uno per l’induttore.

L’attività del repressore è controllata dall’induttore a basso peso molecolare

Quando l’induttore lega il suo sito, esso cambia la conformazione del repressore in maniera tale da influenzare l’attività del sito di legame all’operatore: controllo allosterico.


Lo stesso repressore può agire su più siti

• Il repressore trp controlla 3 gruppi di geni dispersi:– un operatore nel gruppo di geni trpEDBCA controlla la sintesi del triptofano

dall’acido corismico;– un operatore controlla il gene aroH, che codifica uno dei tre enzimi che catalizzano la

reazione iniziale della biosintesi dei tre amminoacidi aromatici;– infine il gene regolatore trpR è represso dal suo prodotto, il repressore trp. Quindi il

repressore riduce la propia sintesi. Questo circuito di controllo è un esempio di controllo autogeno.

• Una sequenza conservata di 21 paia di basi (operatore) è presente in ciascuna delle tre regioni sulle quali agisce il repressore trp. Tra i nucleotidi conservati ci sono i punti di contatto del repressore trp.

Il repressore lac agisce solo sull’operatore del gruppo di geni lacZYA. Alcuni repressori controllano invece geni strutturali dispersi nel genoma, legandosi a più di un operatore.


Gli operatori possono trovarsi in posizioni diverse rispetto ai promotori

• Anche nel caso di operatori riconosciuti dallo stesso repressore, la posizione non è sempre la stessa rispetto al promotore:– nel gene trpR un operatore si estende da -12 a +9;– nell’operone trp l’operatore occupa le posizioni da

-23 a -3;– nel gene aroH si trova più a monte, tra -49 e -29.

• In alcuni casi l’operatore si trova a valle del promotore (come nell’operone lac).

• In altri casi l’operatore si trova a monte del promotore (come nell’operone gal).

La capacità dei repressori di agire su operatori le cui posizioni sono così diverse rispetto ai promotori suggerisce che ci sono delle differenze nei dettagli del mecanismo di repressione, ma il comune denominatore è che viene impedito alla RNA polimerasi l’inizio della trscrizione al promotore.


Regolazione positiva e negativa

• I gene sotto controllo negativo sono espressi salvo essere spenti da un repressore

– sicurezza: se il regolatore è inattivato, il batterio non perde enzimi essenziali.

• Per i geni sotto controllo positivo l’espressione è posibile solo in presenza dell’attivatore

– anzichè interferire con l’attivazione, il regolatore è essenziale perchè essa avvenga

– il regolatore si chiama attivatore– di solito l’attivatore supplisce ad

una carenza del promotore, per esempio una cattiva sequenza di consenso a -35 o a -10.

• Gli operoni sono definiti anche inducibili o repressibili.

lacI

rtpR

La regolazione della trascrizione nei procarioti - unicz.it · repressore lac perchè la sua...

Documents

Transcript of La regolazione della trascrizione nei procarioti - unicz.it · repressore lac perchè la sua...