La Proteomica nelle Malattie Renali Cattedra e Clinica Nefrologica Ospedale Clinicizzato SS....
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La Proteomica nelle
Malattie Renali
Cattedra e Clinica Nefrologica Ospedale Clinicizzato
SS. Annunziata, Chieti
Mario Bonomini
Università degli Studi
“G. d’Annunzio”
Chieti - Pescara
La proteomica è la Scienza Omica che studia il proteoma (insieme di
PROTEine espresse dal genOMA). Essa comprende una serie di tecniche
che permettono identificazione, quantificazione e caratterizzazione di un
set globale di proteine e peptidi presenti in un campione biologico.
La proteomica è la Scienza Omica che studia il proteoma (insieme di
PROTEine espresse dal genOMA). Essa comprende una serie di tecniche
che permettono identificazione, quantificazione e caratterizzazione di un
set globale di proteine e peptidi presenti in un campione biologico.
PROTEOMICA
L’approccio proteomico alla identificazione delle proteine non richiede
ipotesi a priori circa quali proteine possano essere presenti e permette la
simultanea analisi di tutte le proteine presenti anche in miscele
complesse.
L’approccio proteomico alla identificazione delle proteine non richiede
ipotesi a priori circa quali proteine possano essere presenti e permette la
simultanea analisi di tutte le proteine presenti anche in miscele
complesse.
L’analisi proteomica consente anche di evidenziare singole isoforme
proteiche e modificazioni proteiche post-traslazionali.
L’analisi proteomica consente anche di evidenziare singole isoforme
proteiche e modificazioni proteiche post-traslazionali.
• Proteomic technologies are being used with increasing frequency in the renal community.
• Proteomic studies are most directed at finding markers of disease progression, diagnosis, or responsiveness to therapy.
Ambiti di applicazione della Proteomica in Nefrologia
• Fisio(pato)logia renale• Nefropatie glomerulari• CKD• AKI• Nefrolitiasi• Uropatia ostruttiva• Trapianto renale• Emodialisi• Dialisi peritoneale• Tossicità uremica• Tossicità farmacologica
PROTEOMICA TISSUTALE
L’analisi proteomica del tessuto renale può
essere impiegata per identificare quali proteine
sono presenti, per confrontare l’abbondanza
proteica tra zone tissutali o condizioni, e per
analizzare modificazioni post-traslazionali.
L’analisi proteomica del tessuto renale può
essere impiegata per identificare quali proteine
sono presenti, per confrontare l’abbondanza
proteica tra zone tissutali o condizioni, e per
analizzare modificazioni post-traslazionali.
http://www.hkupp.org
DatabaseKidney Glomerulus 2DGE-LC-Based Proteomics 2DGE-Based Proteomics Proximal Tubule Distal Tubule Collecting Duct Rat IMCD Rat IMCD Phosphoprotein Others Transcriptomics & Proteomics
NEJM 2009
2011
2013
PROTEOMICA URINARIA
3.0 10.0non linear pH10.03.0 non linear pH
Mappa urina soggetto normale
Cortesia G. Candiano, Ospedale Gaslini, Genova
Naturally Occurring Human Urinary Peptides for Use in Diagnosis of Chronic Kidney Disease
Studio mediante elettroforesi capillare+spettrometria di massa di campioni urine di 230 pazienti con CKD e 379 soggetti sani
Identificazione di 273 potenziali biomarcatori associati a CKD e creazione di un modello di classificazione basato su tali markers (frammenti di collagene, proteine ematiche, proteine rene-specifiche)
Successiva validazione “in cieco” del modello in 110 pazienti affetti da CKD
Dimostrata superiorità del modello vs. creatininemia
Good et al, Molecular & Cellular Proteomics, 2010
Peptide patterns distinguishing patients with CKD
from Healthy Controls
Source proteins and peptide distribution of CKD biomarkers
www.humanproteinpedia.org; accession number HuPA_00670
Urinary Proteomics in Diabetes and CKD
“A panel including 65 urinary biomarkers correctly identified diabetic nephropathy from diabetes without compromized renal function (97% sensitivity and specificity), and patients who were microalbuminuric at sampling and progressed toward overt diabetic nephropathy over 3 years.
….Many of the biomarkers were fragments of collagen type I, and quantities were reduced in patients with diabetes or diabetic nephropathy.
….Analysis of the urinary proteome may allow early detection of diabetic nephropathy and may provide prognostic information.”
Rossing et al, JASN 2008
RILEVANZA FISIOPATOLOGICA DEI BIOMARCATORI URINARI PROTEOMICI DI CKD
I frammenti del collagene urinari, riflettendo il fisiologico turnover della matrice extracellulare, non sono semplici prodotti di degradazione; essi possono essere indicativi di processi fisiopatologici e fornire informazioni malattia-specifiche in un singolo test diagnostico
CKD
↓ degradazione matrice extracellulare
↑ fibre collagene insolubili
↑ matrice extracellulare e alterazioni strutturali
perdita di funzione e fibrosi
RILEVANZA FISIOPATOLOGICA DEI BIOMARCATORI URINARI PROTEOMICI DI CKD
Alterazioni della matrice extracellulare riflesse attraverso il proteoma urinario, possono rappresentare uno stadio precoce nel processo patologico della CKD e antagonizzare il patologico accumulo di matrice extracellulare può rappresentare un nuovo valido approccio terapeutico.
Mullen et al, Curr Opin Nephrol Hypertens 2011
22 pazienti nefropatici con diabete tipo 2
Irbesartan 300 mg/die (n=11) Placebo (n=11)
Basal Basal2 years 2 years
Mischak H and Rossing P, Nephrol Dial Transplant 2010
STUDI CLINICI IN CORSO CON STRATIFICAZIONE DEI PAZIENTI IN BASE AD ANALISI DI PROTEOMICA URINARIA
ICU TRAINING SET• 30 pazienti ricoverati in ICU con FR normale, con raccolta
longitudinale di campioni urinari
• 16/30 successivo sviluppo di AKI (↑ creatininemia)
• Caratterizzazione e confronto del pattern peptidico urinario (elettroforesi capillare+spettrometria di massa) dei pazienti con AKI vs pazienti che hanno mantenuto FR normale
• Sensibilità 92%, specificità 90%
Kidney International (2010) 78, 1252–1262
Validazione risultati ICU training set
ICU VALIDATION SET• Studio di coorte di fase II, prospettico, in cieco
• 20 pazienti in ICU
• Il pattern peptidico urinario ha correttamente identificato 8/9 pazienti che hanno sviluppato AKI
ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELLTRANSPLANTATION VALIDATION SET
• 31 pazienti con trapianto (quale differente eziologia di AKI)
• In 13 sviluppo di AKI (sensibilità pattern peptidico urinario 94%, specificità 82)
Mass (Da) CE time (min) Protein Remarks
1439.66 29.82 a-1 antitrypsin
912.54 20.06
2080.99 20.20 Albumin
2356.16 19.52
2427.19 19.58
2540.28 19.68
2639.35 19.78
1081.66 20.73 b-2 Microglobulin
1399.59 28.53
2603.30 20.07
2716.38 20.19
1654.79 23.13 Collagen 1 a(I)
1737.78 31.00
1250.55 27.93
3359.57 31.90
2942.30 22.23
2007.94 22.10 Collagen 1 a(III)
1825.78 19.41 Fibrinogen a chain
1882.80 20.14
2559.18 19.41
Caratteristiche dei polipeptidi urinari inclusi nel pattern di marcatori AKI
RegulationRegulation
RegulationRegulation
DownDown
UpUp
Efficacia diagnostica precoce del pattern AKI urinario
sviluppo di un modello di identificazione di rigetto acuto,
basato su 14 biomarcatori urinari
validazione in cieco del modello: corretta diagnosi in 16/18
casi di rigetto subclinico e in 10/10 casi di rigetto clinico (gradi
Banff Ia/Ib)
Il modello è attualmente impiegato in uno studio multicentrico di fase III in corso in Germania
Diagnosis of subclinical and clinical acute T-cell-mediated rejection in renal transplant patients by urinary proteome analysis
Metzger et al, Proteomics Clin Appl 2011
Limitazioni ad un diffuso impiego clinico della Proteomica in Nefrologia
• Carenza di protocolli condivisi su raccolta e analisi campione biologico
• Studi di ridotte dimensioni campionarie
• Costi
• Necessità di personale tecnico specializzato
Iniziative volte a favorire l’applicabilità clinica della Proteomica in Nefrologia
• Standardizzazione metodi di raccolta e preparazione del campione biologico
• Disponibilità di ampi e aggiornati database
Database di Proteomica Urinaria Umana
Siwy et al, Proteomics Clin Appl 2011
Iniziative volte a favorire l’applicabilità clinica della Proteomica in Nefrologia
• Standardizzazione metodi di raccolta e preparazione del campione biologico
• Disponibilità di ampi e aggiornati database
• Studi multicentrici di validazione
• Studi con più adeguati disegni e dimensioni
• Attività collaborative nazionali e internazionali
Gruppo di Studio SINScienze Omiche
SOCIETÀ ITALIANA DI PROTEOMICA
It-HPP MithocondriaInitiative by the Italian Proteomics Association on a Mitochondria Integrated Biology Program, on Chronic Not Transmissible Diseases. Approved by the Human Proteome Project Consortium (September 2012)
International partnerISNAFF (www.isnaff.org) for Canada and USA,IFCC, cQQP commission, EU JPND,
Other National Societies SIN (ItPA GC, June 13th, 2012)SIRNA (Rome, Nov 2012)
In Nefrologia vi è stringente necessità di migliori markers diagnostici e terapeutici.
La Proteomica ha dimostrato in ambito nefrologico capacità di identificazione di nuovi set di biomarcatori, indicativi di progressione, diagnosi o risposta al trattamento.
La traducibilità clinica degli studi di Proteomica, iniziale e promettente (pur se a lento ritmo di crescita), presenta alcune limitazioni che ne hanno precluso un’ampia diffusione.
Le migliorate tecnologie e le attività in corso lasciano ragionevolmente ritenere un prossimo uso della Proteomica nella pratica clinica, più diffuso ed efficace.
CONCLUSIONI