La PCR en Temps Réel_ppt

Laboratoire de Pharmacologie-ToxicologieINRA TOULOUSE

La PCR en temps rel.Choix damorces et analyse des rsultats

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anvi

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7

Pascal MARTIN : [email protected]

Plan

La PCR en temps rel pour la mesure de lexpression des gnes

Principes de base

Le choix des amorces de PCR

La mise au point dun dosage en SYBR Green

Les choix mthodologiques pour lanalyse des rsultats

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7

UR

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7La PCR en temps rel pour la mesure de lexpression des gnes

Mesurer lexpression dun gne = mesurer labondance des transcrits produits par ce gne un instant donn

Abondance relative (units arbitraires) ou abondance absolue (nombre de copies ou g/L)

En pratique, la quantification relative est la plus utilise en raison de la difficult quil y a construire une courbe de calibration absolue (lutilisation de plasmides ou de produits de PCR est dangereuse).

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Etapes initiales :OrganeCellulesTraits vs non traits

Sauvage vs transgnique

ARN total ADNcExtraction ARN Transcription inverse

Dosage

Dosage au spectrophotomtre (A260nm) : pas dvaluation dune potentielle dgradation diffrentielle des ARNs

Transcription inverse : pas dvaluation des diffrences potentielles defficacit de transcription inverse

IL EST NECESSAIRE DE CALIBRER NOS DONNEES PAR RAPPORT A UNE QUANTITE QUI EST CONSTANTE ENTRE LES DIFFERENTS ECHANTILLONS DARN INTACT.

Contrle endogne = gne de mnage = housekeeping gene

UR

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Je calibre Je ne calibre pas

2 botes de cellules identiques (A et B). ARNA non dgrad, ARNBdgrad 50%. RTA et RTB efficaces 100%. (gne X)A=20, (gne X)B=10. (-actin)A=200, (-actin)B=100

(gne X)A / (-actin)A = 0.1

(gne X)B / (-actin)B = 0.1

(gne X)A = 20

(gne X)B = 10

Idem mais cette fois-ci efficacit RTB=50% => (gne X)B=5 et (-actin)B=50

Je calibre Je ne calibre pas

(gne X)A / (-actin)A = 0.1

(gne X)B / (-actin)B = 0.1

(gne X)A = 20

(gne X)B = 5

Cycle number

Fluo ~ DNA quantity

Exponentialphase

Linearphase

Plateau phase

Not detected

UR

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Principes de base

Cycle number

Exponentialphase

Linearphase

Fluo ~ DNA quantity

Principes de base

UR66, janvier 07

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Principes de base

Ctthreshold

Rn = ROX normalized signal ROX normalized baseline signal

Nombre de cycles

Baseline

Rn

Nombre de cycles

Distance = 1 cycle

Dilutions au 1/10me => 3.32 cycles de distanceUR66,

janv

ier 0

7

Principes de base

UR

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7

Principes de base

1) laccumulation de la fluorescence est proportionnelle laccumulation du produit de PCR qui nous intresse => notion de spcificit, choix des primers

2) Lefficacit de PCR doit tre la mme dans les diffrents chantillons

3) Le seuil utilis dans les analyses doit tre fix de manire couper toutes les courbes de PCR au niveau de la phase exponentielle afin dtre sr que le CT est bien reprsentatif du nombre initial de copies de lARN et pas de diffrences de cintique entre les PCRs

Peirson SN et al., NAR, 2003

UR

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7

Principes de base1) laccumulation de la fluorescence est proportionnelle

laccumulation du produit de PCR qui nous intresse => notion de spcificit, choix des primers

En SYBR Green, si mes amorces font des dimres, si jamplifie un ou des produits de PCR non spcifiques ou bien si jamplifie de lADN gnomique, je ne sais plus ce que reprsente concrtement lintensit de fluorescence en ordonne (mon produit de PCR? Des dimres de primers? Un autre amplicon? Un peu de tout a?)

Cest un choix judicieux des amorces de PCR qui va me permettre dassurer la spcificit ncessaire

Remarque : en TaqMan, cest un choix judicieux de ma sonde TaqManqui va assurer la spcificit de quantification

UR

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7

Principes de base2) Lefficacit de PCR doit tre la mme dans les diffrents

chantillons

0,0E+00

2,0E+09

4,0E+09

6,0E+09

8,0E+09

1,0E+10

1,2E+10

0 5 10 15 20 25 30 35

E=2, X0=10E=2, X0=20E=1.95, X0=10

25 30

UR

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7

Principes de base2) Lefficacit de PCR doit tre la mme dans les diffrents

chantillons

Avec 95% defficacit de PCR, au bout de 26-27 cycles, on obtient deux fois moins de produit de PCR quavec une efficacitde 100%

On doit donc vrifier que lon a bien la mme efficacit de PCR entre les diffrents chantillons et essayer didentifier si certains chantillons ont une efficacit de PCR diffrente des autres.

UR

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Principes de base3) Le seuil utilis dans les analyses doit tre fix de manire couper

toutes les courbes de PCR au niveau de la phase exponentielle afin dtre sr que le CT est bien reprsentatif du nombre initial de copies de lARN et pas de diffrences de cintique entre les PCRs

High precision duringexponential phase

Variable plateau phase

96 Replicates

PCR

Pro

duct

Applied Biosystems David Favy

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Primer Express 2.0

UR

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7

Le choix des amorces de PCRSpcificit On ne veut amplifier que notre ADNc dintrt et pas un autre

ADNc. Cet aspect est fondamental, en particulier si on sintresse une famille multignique ou un transcrit alternatif prcis

Mme si notre chantillon dADNc est un peu contamin par de lADN gnomique, on aimerait que lamplification de ce dernier ne soit pas possible

On ne veut pas que nos amorces puissent sauto-amplifier en formant des dimres damorces

1

2

3

Outils 1

2

3

Connaissance de la squence et des squences qui prsentent des homologies. Connaissance du ou des transcrits tudis. GenBank, BLAST, Ensembl, PubMed, Multalin, Entrez

Choix des primers sur deux exons diffrents spars par un intron dau moins 1-2 Kb. Ensembl, Entrez, BLAST

Etude des primers sous Primer Express (Primer Test Document)

UR

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7


www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide

Un choix judicieux damorces ne peut se faire sans une solide connaissance de votre squence de dpart, 1

UR

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7

Le choix des amorces de PCRdes homologies que prsente cette squence avec dautres transcrits,

1

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/

+ ClustalW +ClustalX +etc

UR

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Le choix des amorces de PCRde lexistence de transcrits alternatifs ou de gnes cods sur le brin complmentaire1

www.ensembl.org/index.html

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7

Le choix des amorces de PCRADN gnomique et ADN complmentaire2

ADN gnomique

ADNc

ADN gnomique

ADNc

Cas o lon a que des introns de petite taille :

3-4 bases maxi, sinon

UR

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7

Le choix des amorces de PCR3 Absence de dimres de primers

5

3Loop-back

3-3 dimer3

3

5-5 dimer 5

5Pas dextension possible donc pas un problme

Toujours penser raliser toutes les combinaisons possibles :

sens/sens, antisens/antisens et sens/antisens

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7


OK OKOK, mais

UR

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7


OK NON

NON

UR

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7


Pas plus de G que de C (essayer le rverse complment)

UR

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7

Le choix des amorces de PCRAutres critres

Classement des amorces selon le critre de pnalit. Ce critre nest pas

comparable dune recherche damorces lautre.

Prsence de polymorphismes? Critique surtout pour les polymorphismes

situs en 3. Voir les bases de donnes

Parfois, il faut fixer la main lune des deux amorces. Dans ce cas, il

est critique de sassurer que son Tm est bien compris entre 58 et 60 et

quelle ne risque pas de former de dimres damorces.

jen oublie certainement mais dans la plupart des cas, rien ne vaut

les tests en tubes

UR

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7

Mise au point dun dosage en SYBR Green

1) Etude de la squence du gne tudier

2) Choix des amorces de PCR

3) Optimisation des concentrations damorces et

vrification de la spcificit

4) Ralisation dune courbe standard

5) Dosage des chantillons dintrt

UR

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7

Mise au point dun dosage en SYBR Green3) Optimisation des concentrations damorces et vrification de la spcificit

900/900900/300900/50900

300/900300/300300/50300

50/90050/30050/5050

90030050

Reverse Primer (nM)

Forw

ard

Prim

er (n

M)

Le Tm dune amorce dpend de sa concentration[50;900nM] ~ Tm + [0;4C]

UR66, janvier 07


Faible reproductibilit, CT tardifs

300/300 and 300/900 : OK valeurs de CT robustes

Plateau le plus lev (voir en chelle linaire + besoin de rplicats)

Rn

Le choix est guid par 1) le CT le plus prcoce possible, 2) la meilleure reproductibilit possible et 3) le plateau le plus lev possible

UR

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7


Sur la mme plaque de PCR, on mettra des contrles ngatifs (idalement des chantillons RT-, i.e. des ARN rverse transcrits en labsence de rverse transcriptase)On ralisera des courbes de dissociation pour vrifier 1) que lon a bien amplification dun unique amplicon, 2) que lon a pas de formation de dimres de primers et 3) que lon amplifie pas lADN gnomique dans les chantillons RT-. Idalement on fera aussi un contrle sur gel.

Fluo

resc

ence

Temperature (C)

-Derive

Temperature (C)

Fluo

resc

ence

Tm of PCR product

Primer dimers

UR

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7

Log (Co)

Ct

Slope is between -3.3 and -3.4 => Efficiency=100%

Slope is above -3.3 => maybe PCR inhibitors

Slope is below -3.4 => Efficiency0.99

Mise au point dun dosage en SYBR Green4) Ralisation dune courbe standard

UR

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7

Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatsLors de la phase exponentielle de la PCR, on a :

Xn = X0 . En

Xn = nombre damplicons au cycle n

X0 = nombre initial de transcrits = ce que lon souhaite connatre

E = efficacit de PCR comprise entre 1 et 2 (E=1 0% defficacit; E=2 100% defficacit)

E=2 => Xn = Xo x 2n

Xn+1 = Xo x 2n+1

= (Xo x 2n) x 2

Xn+1 = Xn x 2

Efficacit de 100% = on double le nombre de produit de PCR chaque cycle

UR

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7

Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatsLors de la phase exponentielle de la PCR, on a :

Xn = X0 . EnXn = nombre damplicons au cycle n


E = efficacit de PCR comprise entre 1 et 2

Le seuil est fix de manire couper les courbes de PCR au niveau de la phase exponentielle ET la fluorescence est proportionnelle au nombre damplicon

RCT = R0 . ECT

RCT = fluorescence slectionne comme seuil

R0 = fluorescence initiale


CT = fraction de cycle laquelle la courbe de PCR croise le seuil

UR

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7

Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatsRCT = R0 . ECT

RCT = fluorescence slectionne comme seuil

X0 = fluorescence initiale



R0 = RCT . E-CT

R0 = RCT . E-CT log(R0) = log(RCT)+log(E-CT)

log(R0) = log(RCT)-CT.log(E)log(RCT) est une constante (seuil fix). Si lefficacit de PCR est constante aussi, on peut poser log(RCT)=a et log(E)=b.

log(R0) = a b.CTDonc il existe un lien linaire entre le log de la concentration initiale et le CT. Cest ce que lon observe en faisant une courbe standard.

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Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatslog(R0) = log(RCT)-CT.log(E)

Avec le logiciel ABI PRISM, on dispose de lquation dans lautre sens :

log(R0) = a b.CT

Si on observe une pente de -3.32 avec cette quation, alors :

b = log(E) = 1/3.32

CT = a/b 1/b . log(R0)

E = 101/3.32 = 2

Avec lquation dans ce sens l, b = log(E) = pente de la droite de rgression, do E = 10pente de la droite de rgression

UR

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Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultats

Courbes standard

CT

Estimations individuelles des efficacits

Test de lhomognit des efficacits et estimation par la moyenne des estimations individuelles

1

2

3

4

La quantit qui nous intresse :

endo

ett

RR

0

0 arg O target reprsente notre gne dintrt et endo reprsente notre gne contrle endogne

On peut galement sintresser directement au ratio de cette quantitentre un groupe trait et un groupe contrle

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Courbes standard1

0 1 2 3 4 5 6 75

1015

2025

30

Target gene

Endogenouscontrol

s=-3.1052

s=-4.0368Ct is not constant

Log(Co)

Ct

Mthode qui permet de grer le cas o les PCR des gnes targetet endo nont pas les mmes efficacits

Mthode qui suppose que lefficacit de PCR pour un gne donn est toujours la mme dans les diffrents tubes (standards et chantillons en particulier).

On va estimer cette efficacit sur la courbe standard et appliquer cette efficacit toutes les donnes

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Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatsCourbes standard1

Pour chaque gne (target ou endo), la courbe standard va nous fournir les valeurs de a et b (ou a et b) telles que :

Pour chaque chantillon de concentration inconnue, on connat la valeur de CT. A laide des valeurs a et b (ou a et b) fournies par la courbe standard, on en dduit aisment les valeurs de log(R0) pour chaque chantillon

log(R0) = a b . CT

CT = a b . log(R0)

Il ne reste plus qu calculer pour chaque chantillon :

)log()log()log(0

000

target

targe

endo

endotRR

RR =

UR

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Ctt,T3

Ctt,T2

Ctt,T1

Ctt,C3

Ctt,C2

Ctt,C1

Cttarget

Cte,T3

Cte,T2

Cte,T1

Cte,C3

Cte,C2

Cte,C1

Ctendo

T3

T2

T1

C3

C2

C1

Sample

Qt,T3

Qt,T2

Qt,T1

Qt,C3

Qt,C2

Qt,C1

Qtarget

T3

T2

T1

C3

C2

C1

Sample

Standard curve target gene

Qt,T3/Qe,T3

Qt,T2/Qe,T2

Qt,T1/Qe,T1

Qt,C3/Qe,C3

Qt,C2/Qe,C2

Qt,C1/Qe,C1

Qtarget / Qendo

T3

T2

T1

C3

C2

C1

Sample

StatsStandard curve

endogenous control

Qe,T3

Qe,T2

Qe,T1

Qe,C3

Qe,C2

Qe,C1

Qendo

Courbes standard1

UR

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Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatsCourbes standard1

Avantages : Principe simple et comprhensible

Ralisation des courbes standard assez facile

Ralisation des calculs simple

Inconvnients : Ralisation de PCRs (env. 15-20) qui nont pas dintrt direct pour le chercheur (cot, temps, chantillons rares)

Problmes destimations si la gamme de concentration nest pas assez large, si on a peu de points ou si lchantillon de dpart prsente des inhibiteurs de PCR (gnes faiblement exprims, inhibition de PCR aux fortes concentrations,)

Hypothse forte : lefficacit de PCR est la mme dans tous les tubes

Impossibilit didentifier des chantillons prsentant une efficacit de PCR anormale

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7

Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatsCT2

RCT = R0 . ECT

RCT = fluorescence slectionne comme seuil = constante

X0 = fluorescence initiale



Pour le gne dintrt (target) :target

target target0. CTCT ETT =

Pour le contrle endogne (ref) : refref ref0

. CTCT ERR =

ref

target

ref

target

ref

target

0

0 . CTCT

CT

CT

EE

RT

R

T=En divisant ces 2 quations :

UR

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7


ref

target

ref

target

ref

target

0

0 . CTCT

CT

CT

EE

RT

R

T=

targetCTT

refCTRet Sont les seuils de fluorescence fixs pour le gne

dintrt et pour le gne de rfrence respectivement. Ces deux valeurs sont des constantes. Si on a fix le mme seuil pour les deux gnes, alors le rapport vaut 1.

1)(K .ref

target

ref

target

ref

target

0

0 === CT

CT

CT

CT

EE

RT

R

TO K est une constante

UR

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7


KEE

RT

CT

CT

=ref

target

ref

target

0

0 . (1)target

ref

target

ref

0

0 . CTCT

EEK

RT

=

Si Etarget = Eref = E alors,

(1)CTCTCT EKEK

RT == .. targetref

0

0 Avec CT = CTtarget-CTref

Si E = 2 (efficacit 100%) alors,

CTKRT = 2.

0

0On sait calculer T0/R0 une constante prs (et cette constante vaut 1 si le seuil de fluorescence est le mme pour target et ref)

s=-3.3352

s=-3.2965

Target gene

Endogenouscontrol

Ct reste constant

Log(Co)

Ct

Ct

Log(Co)

Relative efficiency plot

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0

-2.8

-2.6

-2.4

-2.2

Pente 0.1 pour le graphe defficacit relative

Corrlation minimum entre les courbes standard = 0.99


UR

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er 0

7

UR

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7


Mise en uvre :

1) On calcule 2-CT pour chaque chantillon (avec CT=CTtarget-CTref)

2) On calcule les moyennes et carts-types pour chaque lot dindividus

3) Eventuellement on divise ces moyennes (et les carts-types!!) par la moyenne du groupe contrle pour ramener ce groupe une moyenne de 1

4) On fait ses stats habituelles (il faut parfois transformer toutes les donnes en log pour homogniser les variances)

UR

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7


Avec CT = CTtarget-CTrefCTK

RT = 2.

0

0

Pour le groupe traits : traitCT

trait

KRT =

2.

0

0

Pour le groupe contrle : ctrolCT

ctrol

KRT =

2.

0

0

Donc :CTCTCT

CT

CT

control

trait ctroltraitctrol

trait

RTRT

===

2222 )(

0

0

0

0

UR

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7


CT

control

traits

RTRT

=

2

0

0

0

0

En pratique, ce calcul est bien adaptaux donnes apparies ou la comparaison de deux chantillons.

Cette mthode donne des rsultats surprenants quand on compare 2 groupes dchantillons

UR

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7


22.522.4RefCtrol3

22.521.2RefTrait4

1.014

1.00021.922.3TargetCtrol1



1.917

1.74121.919.8TargetTrait4



22.522.9RefCtrol1

22.522.3RefCtrol2

22.521.7RefTrait5

22.521.7RefTrait6

Ratio moyen

2-CTCT moyen ctrol

CTGneGroupeSample

2^-[(20.0-21.7)-(21.9-22.5)]

Daprs Livak KJ & Schmittgen TD, 2001

!!

UR

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er 0

7


Cest pourquoi je vous conseille dutiliser plutt la mthode du CT plutt que celle du CT

Pour en savoir un peu plus sur cette mthode (cas particulier de la comparaison de 2 chantillons, calculs des carts-types) :

UR

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Avantages : Calculs rapides et facilement automatisables

Les hypothses font que les courbes standard ne sont faites quune seule fois

Inconvnients : Hypothses trs (trop?) fortes : Etarget = Eref = 1

Approximations pouvant avoir des consquences importantes

Calculs assez compliqus. Plusieurs tapes des calculs ncessitent des hypothses qui ne sont pas toujours bien explicites et que lon a tendance oublier quand cette mthode est utilise en routine

Applicabilit limite

Impossibilit didentifier des chantillons prsentant une efficacit de PCR anormale

UR

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Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatsEstimations individuelles des efficacits3

Phase exponentielle : Xn = X0 . EnXn = nombre damplicons au cycle n



La fluorescence est proportionnelle au nombre damplicon

Rn = R0 . EnRn = fluorescence au cycle n

R0 = fluorescence initiale


Phase exponentielle :

log(Rn) = log(R0) + n . log(E)Passage au logarithme

UR66, janvier 07


log(Rn) = log(R0) + n . log(E)

Au cours de la PCR, lappareil enregistre la fluorescence Rn en fonction des cycles n

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25 30 35 40

log

0,001

0,01

0,1

1

10

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40

log(Rn)

n

droite de pente log(E) et dordonne

lorigine log(R0)

UR

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Le principal problme consiste choisir les points de mesure qui vont tre utiliss pour effectuer la rgression linaire.

Plusieurs solutions ont t proposes dans la littrature.

Le logiciel LinRegPCR (Ramakers C et al., 2003) permet une slection automatique des points ainsi que des ajustements manuels.

target

ref

target

ref

0

0 . CTCT

EEK

RT

=

A partir des droites de rgression, on a accs R0 et E ce qui permet de calculer aisment :

soit en utilisant les estimations R0 et T0, soit en utilisant les estimations des efficacits (un peu plus stables a priori)

UR

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7


Avantages : Pas de courbe standard ncessaire

Les estimations individuelles des efficacits permettent de reprer aisment des points aberrants prsentant des efficacits de PCR extrmes

Applicable dans tous les cas (en thorie au moins)

Inconvnients : Calculs compliqus. Ncessite un logiciel danalyse ddi.

En moyenne 4 6 points sont utiliss pour raliser les rgressions. Les estimations des pentes et des ordonnes lorigine sont donc peu prcises. Au moins avec LinRegPCR, cela gnre une variabilit considrable dans les donnes ce qui rend la mthode compltement inutilisable en pratique (sauf pour identifier des points aberrants).

UR

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Test de lhomognit des efficacits et estimation par la moyenne des estimations individuelles

4


Ide : les diffrentes estimations individuelles des efficacits de PCR sont peu prcises mais constituent des estimations non biaises de lefficacit de PCR relle qui est en fait la mme pour tous les chantillons

Mise en uvre :

1) Estimer les efficacits de PCR dans chaque tube (pour un gne donn)

2) Raliser un test pour vrifier quil ny a pas de diffrence significative entre les efficacits de PCR des diffrents groupes dchantillons

3) Utiliser la moyenne des efficacits de PCR estimes sur chaque courbe comme efficacit de PCR globale pour ce gne

4) En dduire T0 pour chaque chantillon

5) Suivre le mme processus pour le contrle endogne et en dduire les R0pour chaque chantillon

6) Calculer les T0/R0 et faire les stats appropries pour conclure

UR

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er 0

7

Choix mthodologiques pour lanalyse des rsultatsTest de lhomognit des efficacits et estimation par la moyenne des estimations individuelles

4

Problme : toujours le mme i.e. choisir les points de mesure qui appartiennent la phase exponentielle (pour fixer le seuil + estimer lefficacit de PCR)Ide (Peirson et al., NAR, 2003) : Prendre le max de fluorescence (Rmax) et estimer le min de fluorescence partir des valeurs sur les 10 premiers cycles de PCR (Rnoise). En dduire le point moyen (midpoint) situ entre ces deux extrmes.

0,001

0,01

0,1

1

10

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40

log(Rn)

n

Ce point correspond peu prs au milieu de la phase exponentielle. En prenant un facteur 10 de fluorescence de part et dautre de ce point, on slectionne les points situs dans la phase exponentielle (au minimum 3 points)

Rnoise

Rmax

Midpoint

UR

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anvi

er 0

7


4

Dfinition du Point moyen, un peu de calcul

Rmax

Rnoise

M

( )noisemaxnoise 21 RRRM +=

Mais on est en chelle logarithmique

( ))log()log(21)log()log( max noisenoise RRRM +=

=

noise

maxnoiselog)log( R

RRM

noise

maxnoise R

RRM =

UR

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anvi

er 0

7


4

Logiciel DART-PCR (Peirson et al., NAR, 2003)

Une fois que lon a estim les efficacits de PCR pour chaque courbe, on crit un modle danalyse de variance du type :

efficacit ~ groupe +

et si on a ralis chaque PCR en triplicat (technique), on peu crire un modle plus complet :

efficacit ~ groupe + chantillon/groupe +

On teste ainsi sil existe un effet groupe sur lefficacit de PCR et si (au moins) un chantillon au sein des groupes est diffrent des autres.

Si vous faites beaucoup de PCR en temps rel, attention la multiplicit des tests

UR

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anvi

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Avantages : Pas de courbe standard ncessaire

Les estimations individuelles des efficacits permettent de reprer aisment des points aberrants prsentant des efficacits de PCR extrmes

Lutilisation de la moyenne de ces estimations rend la mthode robuste

Applicable dans tous les cas (en thorie au moins)

Inconvnients : Calculs assez compliqus. Ncessite un logiciel danalyse ddi.

Le logiciel DART-PCR actuellement disponible oblige faire chaque PCR en triplicats et gre un maximum de 6 groupes et 32 chantillons au total.

Peut-tre bientt (ou pas) un package R


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Remerciements

Tous les utilisateurs de la PCR en temps rel qui sont venus discuter leurs manips et rsultats avec moi et mont permis de mieux comprendre comment marche cette technique.

Un bon site o trouver des logiciels pour analyser ses PCR : www.gene-quantification.de

La PCR en Temps Réel_ppt

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