La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine incontournable pour l’imagerie du vivant

Exemples d’applications à l’étude du développement végétal

Biologie Cellulaire

François Roudier

Equipe Différenciation et Identité Cellulaire

Aequorea victoria : ”l’inventeur” de la GFP

La GFP : une protéine fluorescente par transfert d’énergie

La GFP : une structure en lanterne et un fluorophore protéique auto-catalytique

- 238 aa (26 kDa), N- et C-terminal accessibles

- Forte stabilité : résiste à 65C, à pH entre 5,5-12,2, 8M urée, 1% SDS, protéases (2j)

De la GFP sauvage à la GFP “améliorée”

Un outil versatile pour l’étude du vivant…

Plusieurs mutations ont été introduites pour :

- Optimiser l’expression de la protéineUsage optimal des codons et élimination d’un intron cryptique (20X plus de protéine)Maturation du fluorophore (4X plus vite)

- Modifier les propriétés spectrales de la protéinePic d’excitation unique à 490 nmBrillance (X6)

La GFP : une protéine non toxique pour des méthodes de visualisation non invasives

Variants de la GFP et autres protéines fluorescentes

CFP GFP YFP (DsRED) RFP

Discosoma striata

Des protéines fluorescentes avec différentes propriétés spectrales

Une plante modèle: Arabidopsis thaliana

Embryon

Adulte

Zygote

PlanteAnimal

Le développement végétal est essentiellement post-embryonnaire et résulte de l’activité constante des méristèmes

Organogenèse et Croissance indéterminée

L1L2L3MMZPZPfeuilleprimordiumZCméristème

plantuleArabidopsis

adulte

Méristème apical

Méristème racinaire

Les méristèmes contiennent les cellules souches et sont organisés en domaines fonctionnels

Exemples d’application de la technologie GFP à l’étude du développement des plantes

- Profil d’expression d’un gène

Localisation subcellulaire

Interaction protéine-protéine (FRET)

pPromoteur:GFP (fusion transcriptionnelle)

- Etude fonctionnelle d’une protéine pPromoteur:CDS::GFP(fusion traductionnelle)

Mouvement

- Biosenseurs

Cell types in the Arabidopsis root meristem

lateral root cap

columella

cortexepidermis

stele endodermis

quiescent center (QC) cortex/

endodermis initial

Division asymétrique

Le méristème racinaire : une organisation dépendante de divisions stéréotypées des cellules souches

Wild type

corend

scarecrow(scr)

cor+end

short-root(shr)

cor

Deux mutants déficients dans la mise en place et la différenciation de l’endoderme

Expression de SCR dans la racine

GFP gene

Promoteur SCR

ARN GFP

Protéine GFP

GFPpSCR

QC

endodermis

cortex

c/e initiale

Localisation de la protéine de fusion SCR::GFP

SCR gene

ARN

SCR::GFP

Promoteur SCR

GFP

QC

endodermis

cortex

c/e initiale

pSCRGFPSCR

(Complémentation du mutant scr)

QC

endodermis

cortex

c/e initialeQC

endodermis

cortex

c/e initiale

SCR est nécessaire pour la mise et place et la différenciation de l’endoderme dans la racine

pSCRGFPSCRGFP

pSCR

GFPpSHR

GFPSHRpSHR

st

en

coep

inqc

st

en

coep

inqc

SHR contrôle la mise et place et la différenciation de l’endoderme dans la racine de façon non cellule-autonome …

… La protéine SHR bouge de la stèle vers l’endoderme !

pSCR:GFPPlantules in vitro

Récolte pointe racinaire (15000)

Digestionparoi

Triage par fluorescence des protoplastes GFP+

Extraction ARNAmplification

Marquage des sondes

Hybridation

Puce Affymetrix ATH125K gene arrays

Analyse du transcriptome de l’endoderme racinaire

300 000 protoplastes

Collection de marqueurs spécifique d’un type cellulaire

Pericycle

Endo-dermis

Lateral rootcap

Epidermis

QC

Endo+Cortex

Le méristème apical caulinaire

Le méristème apical caulinaire : Une zonation fonctionnelle pour la croissance, l’organogenèse et auto-maintien

ZC

ZM ZMZM

Auto maintien

Tige

Organes latéraux

Feuille

Jeune feuille

Primordium

P

Le méristème apical caulinaireUne organogenèse dynamique et structurée

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Vue d’avion

Cinétique sur 65h

Acquisition toutes les 2h30

SHOOT MERISTEMLESS LEAFYAINTEGUMENTA

CLAVATA3 ATML1

CLAVATA1 CUP-SHAPED COTYLEDONSWUSCHEL

Marqueurs moléculaires des zones fonctionnelles et identités cellulaires du MAC

pANT:GFP, un marqueur de l’initiation et de la mise en place des primordia foliaires

pANT:GFP

Coloration vitale + pANT::GFP

Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération

T = 0h

T = 48h

pANT:GFP

T = 24h

T = 32h

après le recrutement : prolifération cellulaire

Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération

P7P4

P5P3

P6P2

P1

Phyllotaxie : initiation des primordia en 3D

P0Une disposition en spirale prédictible

Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs

Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs

Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs

L’auxine, une phytohormone transportée de façon polarisée,

est impliquée dans le contrôle de la phyllotaxie

Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs

AIA-H++

Sen

s d

u

TP

A

AIAH

PINPIN

AIAH

AUXAUX

Transporteur d’influx(membrane apicale)

Transport polarisé de l’auxine (AIA): Localisation des transporteurs à l’aide de FPs

pAUX1:AUX1::YFPAUX1::YFP

pPIN1:PIN1::GFP

Transporteur d’efflux(membrane basale)

1

2

3

1

2

3

1

2

3

Auxine

Modèle du contrôle de la phyllotaxie par PIN1 et des flux d’auxine (DR5:GFP)

(pDR5 : 9 x AuxREs)

pDR5:GFP Un senseur transcriptionnel de l’auxine

P0

P1P2

P3

Gradients locaux d’auxine par pompage

Interaction entre deux protéines

D AAD

1- Compatibilité spectrale des fluorochromes

2- Proximité moléculaire des fluorochromes

Mesure de l’interaction entre deux protéines par"Fluorescence Resonance Energy Transfert » (FRET)

GFP RFP

Co-localisation de deux protéines…

Application de la technology FRET au vivant :la protéine caméléon, un biosenseur du calcium

Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans

Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans

[Ca2+] forte

[Ca2+] faible

YFP/CFP élevé

(FRET max)

YFP/CFP faible

(peu de FRET)

[Ca2+] nulle

CFP séparée de YFP

(pas de FRET)

Excitation 440 nm

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Exemples d’application de la technologie GFP

- Profil d’expression de gènesLocalisation subcellulaire

Interaction protéine-protéine(FRET)

- Etude fonctionnelle de protéines Mouvement

- Biosenseurs

Limites :- Sensibilité (difficile de détecter les gènes faiblement exprimés)- Ajout d’une protéine (encombrement, environnement bio)- Panoplie de FPs encore limitée

Quelques limites

LHP1::GFP

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Début de floraisonTransformation de la lignée

germinale

Sélection des transformants à partir des graines

Principe de transformation génétique stable chez les plantes

Eta

pes

de

déve

lopp

emen

t

Assises cellulaires

In situ “digitale” des différents types cellulaires de la racine