La GFP:Le cadeau de la méduse

I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)A. La découverte d’un chercheurB. Les protéines responsables de la fluorescence

II. Structure, Chromophore et MutantsA. La structure et le chromophoreB. La création des différents mutants

III. Les applications possibles de la GFPA. Les diverses applicationsB. Un vecteur d’expression fondamental

I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)

• Osamu Shimomura• 1960: Doctorat en chimie

organique à l’Université de Nagoya (Japon)

• Isole une protéine responsable de la brillance chez le mollusque Cypridina

• Frank Johnson (Université de Princeton, New Jersey)

• 1961: début des travaux sur une méduse bioluminescente

I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)• Aequorea victoria (« cristal jelly »)• Côtes du Nord-Ouest

du Pacifique• Organisme

bioluminescent• Particularité: émission

d’une lumière verte à la base de l’ombrelle (anneau)

• Travail sur 10 000 spécimens

I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)

• Protéine bioluminescente ou photoprotéine

• Inhibition réversible à certains pHOrganes lumineux (anneaux)

Extrait (pH 4)

Extrait (pH neutre)

Forte luminescence

Faible luminescence

Faible luminescence

Pas de luminescence

tampon pH4

filtration

NaHCO3

Eau de mer

soit Ca 2+

I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)

1962: extraction de 2 protéines

• Aequorine: 465 nm

- apo-aequorine (189 aa, 21KDa) - O moléculaire

- chromophore « coelenterazine » (423Da)

• GFP 508 nm

Pourquoi la méduse ne s’irradie que de vert?

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I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)

• 1969: aequorine AF-350(coelenteramine)

• 1972:

Dénaturation (urée + 2-mercaptoéthanol)

2-aminopyrazine

(Cypridina)

O2 O2O2

I. Découverte de la GFP et sa fluorescence

*Ca2+

O2Ca2+

Ca2+

Aequorine(coelenterazine)

Aequorine

CO2GFP

2XAequorine(coelenteramide)

Apoaequorine

I. Les premières avancées sur la GFP (in vivo)

GFP: réaction de fluorescence

• 1979: découverte du chromophore de la GFP et de sa structure

• 10 décembre 2008: Prix Nobel de Chimie

II. Structure, Chromophore et Mutants

• 238 Acides aminés, dont 3 formant le chromophore: la sérine 65, la tyrosine 66 et la glycine 67.

II. Structure, Chromophore et Mutants

• 11 Feuillets β, 4 hélices α, et une formation en baril.

II. Structure, Chromophore et Mutants

Structure tertiaireGFP

Chromophore

Cyclisation

Déshydratation

Oxydation

II. Structure, Chromophore et Mutants

• Premier mutant : le « Timer »

II. Structure, Chromophore et Mutants

• Autres mutants: les variantes de couleurs

II. Structure, Chromophore et Mutants

Utilisation: le multi-marquage

III. Les applications possibles de la GFP

• 2008: Prix Nobel de Chimie

• 1990: Insertion de la GFP chez E.coli

• 1988: Séquençage de la GFPMartin Chalfie

Expression de la GFP dans E.coli, sous lumière UV

III. Les applications possibles de la GFP

• Marquage cellulaire : Insertion du gène codant la GFP dans une cellule (transfection)

Tri des cellules (transformées ou non) par cytométrix en flux

III. Les applications possibles de la GFP

• Marquage moléculaire : Synthèse d’une protéine de fusion (protéine d’intérêt/GFP)

Suivi de la protéine de fusion par microscopie à fluorescence

III. Les applications possibles de la GFP

• Gène rapporteur : Synthèse d’une protéine possédant une activité connue et détectable (par exemple la fluorescence).Etude de l’efficacité de promoteurs spécifiques, et les facteurs influant sur l’expression d’un gène d’intérêt

• Vecteur de clonage : Expression et multiplication d’un fragment d’intérêt dans un hôte. Production à grande échelle de protéines (hormones de croissance par exemple)

EGFP

CMV

pUC ori

Kan

MCS

pEGFP – N1

Fragment d’intérêt

III. Les applications possibles de la GFP

SV 40 Poly A

III. Les applications possibles de la GFP

C. Elegans

C. Elegans produisant la protéine de fusion

MIAM !

III. Les applications possibles de la GFP

• Après insertion de la GFP et de ses mutants au sein de différentes bactéries

(Roger Tsien)