La Diferenciación Molecular y Morfológica Entre Aphis Gossypii Glover

8/17/2019 La Diferenciación Molecular y Morfológica Entre Aphis Gossypii Glover

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La diferenciación molecular y morfológica entre Aphis gossypii Glover (Hemiptera, Aphididae) y especies anes, con especialreferencia al Medio Oeste de orteam!rica"

#esumen" El pulgón del algodón, Aphis gossypii, es una de las especies conmayor diversidad biológica de los pulgones; una especie polífagas en una

familia donde la mayoría son especialistas de acogida. Es de importanciaeconómica y pertenece a un grupo de especies estrechamente relacionadasque ha desaado la taxonomía de dos. !a investigación que aquí se presentapretende aclarar las relaciones taxonómicas y el estado de las especies dentrodel grupo A. gossypii en el medio oeste de Am"rica del #orte. !as secuenciasde la citocromo oxidasa mitocondrial $ %&'(), factor de elongación nuclear $*+%E$*+), y los genes del canal de sodio de tipo para nuclear %-&) se utili/aronpara diferenciar entre A. gossypii y especies relacionadas. Aphis monardae,previamente synonymised con A. gossypii, se restableció como una especievlida. !os anlisis logen"ticos apoyar la estrecha relación de los miembrosdel grupo A. gossypii nativa a Am"rica del #orte %A. forbesi, A., A. monardaeoestlundi, A. y A. rubifolii rubicola), Europa %A. nasturtii, A. urticata y A. -E0(), y

Asia %A. agrimoniae, A. clerodendri, A. glycines, A. gossypii, A. hypericiphaga, A.ichigicola, A. (chigo, A. sanguisorbicola, A. y A. sumire taraxicicola). !asespecies norteamericanas ms estrechamente relacionados con A. gossypii sonmonardae A. y A. oestlundi. !a cosmopolita A. gossypii y A. sedimentosidenticados en los EE.11. son gen"ticamente muy similares utili/andosecuencias &'( y E$*alfa, pero el gen -& muestra una mayor distanciagen"tica entre ellos. -e presenta un anlisis de la diferenciación biológica ymorfológica de estas especies.$ala%ras clave" ulgón, planta hu"sped, la morfología, la logenia, lasecuencia de divergencia, #ovus estado.

&ntroducción"

Asociación vegetal antrión es a menudo uno de los principales caracteresutili/ados para distinguir entre especies de dos estrechamente relacionados.-in embargo, la asociación de acogida tambi"n puede ser una de lasprincipales fuentes de error de identicación de los dos hu"sped*alterna.Estos dos migran entre hosts taxonómicamente distantes, por lo generalentre le2osas y herbceas. roblemas taxonómicos se han creado cuando setransforma de pulgón primaria %3oody), plantas hu"spedes han sido tratadoscomo especie separada de las que se encuentran viviendo en secundaria%herbceo) o plantas hu"sped verano. Antrión alternancia ofrece unaoportunidad para que los dos para adquirir nuevos hu"spedes y puede seruna clave para la rpida diversicación de algunos grupos de dos %Eastop$45$, 0ixon $456, von 0ohlen y 7oran 8999), lo que conduce a comple:os deespecies difíciles de distinguir. !a evolución de Aphis, el mayor do g"nero porun margen, se asocia con la rpida diversicación de las angiospermasherbceas %eie $44<).

El grupo Aphis gossypii contiene especies de importancia económica ytaxonómicamente problemticos, con A. gossypii Glover en sí es el de mayordiversidad biológica y por lo tanto taxonómicamente difícil %=lac>man y Eastop8995). ?iene muchas diferentes plantas hu"sped primario y secundario yexhibe ambos ciclos de vida y holocyclic anholocyclic %@ring $4, =lac>man y



Eastop de 899<, 7argaritopoulus et al., 899<). -u comple:idad taxonómica estatestiguada por sus B8 sinónimos disponibles, incluyendo las especies nativasde Am"rica del #orte, Aphis monardae 'estlund %avret 89$B). Eastop y illeCis !ambers %$45<) establecieron esta sinonimia sin comentarios. !agos %8995)encontró que A. monardae es distinto morfológicamente de A. gossypii ytratada como una especie vlida. #o hay esp"cimen tipo de A. monardae se

podrían encontrar en el tiempo, y no hay evidencia molecular o biológicoestaba disponible para apoyar esta decisión. !a investigación que aquí sepresenta contiene tanto la evidencia molecular y biológica, así como unexamen de material recogido por 'estlund de Monarda spp.

En Europa, existen aproximadamente 89 especies de dos morfológicamentesimilares a A. gossypii %-troyan $4DB, eie $4D<). arios estudios utili/andomitocondrial, nuclear, y polimorsmo de longitud de intrón en el canal de sodiode tipo para %-&) genes han logrado cierto resolución discriminar A. gossypii yotras especies de Aphis %&oeur dFacier et al. 8995, oottit et al. 899D, &occu//aet al., 8994, &arletto et al. 8994b, @im et al., 89$9a, @oma/a>i et al., 89$9,avret y 7iller 89$$). En Am"rica del #orte, los estudios morfológicos muestran

que las especies del grupo A. gossypii pueden ser mal identicados confacilidad %oegtlin et al., 899B, !agos 8995). !a discriminación de las especiesestrechamente relacionadas con A. gossypii es de particular importanciadebido a la reciente introducción en Am"rica del #orte del do de soya, A.glycines 7atsumura %oegtlin et al., 899B). Esta especie es obligadamenteholocyclic y heteroica, alimentndose de so:a, Glycine max %!.) 7err., &omohu"sped secundario, y en Rhamnus spp como hu"sped primario. Aphis gossypiitambi"n se ha informado de coloni/ar la so:a en Am"rica del #orte %=lac>man yEastop 8995), y aunque su coloni/ación en la so:a es poco comGn en el nortecentral de los Estados 1nidos, algunas muestras de insectos de so:arecolectadas desde Alabama, Heorgia, @ansas, !uisiana, y 7ississippi sólocontenía A. gossypii o una me/cla de ambas especies %observación personal,

(llinois #atural istory -urvey %-#(-) registros de recolección de insectos).Estas colecciones sugieren que A. gossypii puede ser ms comGn en la so:a enlas regiones del sur. #o hay registros de la exótica A. nasturtii @altenbach sealimentan de semillas de so:a, y los intentos de la cultura A. nasturtii en la so:ano tuvieron "xito %0avid Cagsdale, comunicación personal); -in embargo, estaespecie comparte el hu"sped primario, Rhamnus spp., con ambas A. glycines yA. gossypii.

#osotros aquí dilucidar la relación logen"tica de las especiesmorfológicamente cerca de A. gossypii y el estatus taxonómico de A. monardaeen el medio oeste de Am"rica del #orte.

Materiales y m!todos"

Colecciones de áfdos: !os dos fueron recogidos de sus plantas hospedantesprimarios y I o secundarios de diferentes lugares de &hina, rancia, (talia,

Japón, Espa2a y los EE.11., con la mayoría del material procedente del 7edio'este de los EE.11. &uando sea posible, se recogieron los dos vivos y se hacriado en la planta hu"sped para la maduración de ninfas nales. !os adultosse conservaron en etanol al 4K y se almacenaron a *89 L & hasta laextracción de A0# y la preparación del portaob:etos del microscopio. &olección



de datos con nGmeros de comprobantes para obtención de muestras deinsectos (#- se presentan en -upl el material $.

Morología: portaob:etos de microscopio Archivo se prepararon usando lat"cnica descrita por i>e et al. %$44$). !os individuos fueron seleccionados delas mismas colonias que las seleccionadas para la extracción de A0#. !as

fotografías de las muestras y mediciones montadas fueron tomadas con unacmara digital !eica 07 8999 y soft3are -'? B,< %instrumentos dediagnóstico, (nc). !os anlisis de varian/a de caracteres de diagnóstico, talescomo la distancia desde la base del tercer segmento antenal a la primerasensorio secundaria, la relación de las longitudes de la terminalis processus yla base del segmento antenal sexta, y la relación de las longitudes de lasifGnculo y la cauda, se ensayaron usando J7, versión 5 %-A- (nstitute (nc.,&ary, &arolina del #orte, $4D4*8995). !a identicación de especies de materialmontado desli/ante hecho por el primer autor, utili/ando las teclas publicados%'estlund $DD5, Hillette $485, ottes y rison $46$, almer $48, @ring $4,&oo>, $4DB, oegtlin et al., 899B) y con autoridad identicó especímenes en lascolecciones de insectos del -#(- y la 1niversidad de 7innesota. (denticación

de las muestras de diapositivas montadas, se hi/o referencia a los dos decolonias compa2eros utili/ados en los anlisis moleculares.

a extracci!n de A"#$ amplifcaci!n por %CR y secuenciaci!nM 0os o tresespecímenes por colonia se secuenciaron individualmente. 7uestrasindividuales fueron aplastadas en un tubo de microcentrífuga de $, ml y elA0# se extra:o y se puricaron usando el N(Aamp, A0#7icro>it %N(AHE# (nc.,alencia, &A). El gen mitocondrial citocromo oxidasa %&'() se amplicó en dosfragmentos superpuestosM fragmento Fcon el cebador directo &$*J*$5$D ycebador inverso &$*J*8B$$ interno; %-imon et al., $44B) %!agos et al 89$8). 6Ffragmento con cebador directo interno &$*#*894 %!agos et al. 89$8) y elcebador inverso ?!8*#*69$B %-imon et al. $44B). El factor de elongación gennuclear $*+ %E$*+) se utili/aron los siguientes cebadoresM E6 %!agos et al89$8.) O E8 %alumbi $44<). El polimorsmo de la longitud de un intrón en -&se secuenció usando los cebadores Aph$6 y Aph$ %&arletto et al. 8994a).

?odos los cebadores fueron sinteti/ados por (nvitrogen P &orporation%&arlsbad, &A). &C utili/ado puCe?aq P Ceady*?o*Ho P &C de 9,8 ml perlas%HE ealthcare 1@) me/clado con 89 l de agua de calidad para &C, $ l decebadores y C a $9 m, y 6 l de solución de A0# genómico. El protocolotermociclador utili/ado para amplificar &'( y E$*+ fue deM 4 L & 8 min %4 L69 L &; 6; 69 & 58 L & $89s) B9x. ara -&, que eraM 4 L & 6 min %4B L & <9 LBs, &, 58 L & <9s) B9x. !os productos de &C se corrieron en un gel deagarosa al $K durante B9 min a 49 , y se visuali/aron con HelHreen colorantede cidos nucleicos %=iotium (nc, &alifornia, EE.11.). !a mayoría de los

productos de la &C se puricaron usando N(Aquic>Q >it %N(AHE# (nc.). !osproductos de &C que incluían la co*amplicación de las bandas no especícasse puricaron en gel utili/ando Rymoclean P >it de recuperación de A0# en gel%Rymo Cesearch, EE.11.). !a concentración de los productos de &C se midióutili/ando un espectrofotómetro #ano0rop Q #0*$999 %?hermo isher-cientic, Silmington, 0E). !os productos de &C se secuenciaron en ambasdirecciones utili/ando 6 l de una me/cla de =ig0yeQ ?erminator v6.$, v6.9dH? =ig0ye ?erminator y tampón en una relación de 8M $M $, respectivamente,$,< l de cebadores de cebadores 8 m, diferentes cantidades de A0#, y $ l de



sulfóxido de dimetilo %07-') %-igma*AldrichQ, -t !ouis, 7'). !as reacciones desecuenciación se reali/aron utili/ando el siguiente protocoloM 4< L & 8 min %4 L& 89; 9 L & s; <9 L & 8B9s) 8x. !as reacciones de secuenciación selimpiaron usando erformaQ 0?C 1ltra placas de 4< pocillos %Edge*=iosystems, Haithersburg, 70) y se e:ecutan en A=( 6569 en el &entro @ec>%1niversidad de (llinois en 1rbana*&hampaign). !a secuencia de datos en bruto

fueron examinados y ensambladas utili/ando -equencher B.5 %Hene &odes&orporation, Ann Arbor, 7(). !as secuencias fueron alineados con &lustal T%versión 8.9, 8995; !ar>in et al., 8995). -e identificaron tres intrones en E$*+ yutili/ados en este estudio. !as secuencias de nucleótidos fueron depositados enHen=an> %-uppl. $ de material). 0istancias por pares se obtuvieron usandoA1 B.9b$9 basado en el @imura modelo de dos parmetros %-3oUord 899$).

!a secuencia de la &'( A. gossypii neotipo esp"cimen %H14$B5) y 8secuencias de E$*+ de Aphis spp. %Especialmente las de especiesestrechamente relacionadas con A. gossypii) fueron recuperados de Hen=an>ME19$4D<5, E19$4D<4, E19$4D5$, E19$4D58, E19$4D56, E19$4D5B,E19$4D5, E19$4D5<, E19$4D5D, E19$4D54, E16D49B, E16D495,

E16D4$$, E16D4$, E16D4$<, E16D4$5, E16D48B, E16D48<,E16D485, H18965 y H18965<.

&l análisis flogen'tico: 7odeltest 6,5 %osada y &randall, $44D) se utili/ó paraseleccionar el modelo de sustitución de nucleótidos de me:or a:uste. &on:untosindividuales de secuencias de genes fueron anali/ados utili/ando 7r=ayes6.$.8 %uelsenbec> y Conquist 8996) para e:ecutar anlisis bayesiano. ara elanlisis individual, se llevaron a cabo cuatro cadenas. El nGmero degeneraciones era .999.999 con una quemadura*in de 89 rboles y frecuenciade muestreo de $99 generaciones con tipos iguales a gamma variable como unmodelo de sustitución de nucleótidos. Rhopalosiphum maidis %itch)%AphidinaeM Aphidini), y (yadaphis tataricae Ai/enberg y helianthicola)roleucon %'liva) %AphidinaeM 7acrosiphini) fueron seleccionados como gruposexternos.

%ulg!n de la *iología: 0os cmaras de crecimiento se utili/aron para examinardiversos aspectos de la biología de A. monardae, A. gossypii, y A. sedi@altenbach, con el n de discernir las diferencias en su ciclo de vida. !asplantas experimentales se hicieron crecer en un invernadero en macetas de$8,5 cm de dimetro y aislados en $6, por $6, por 88, pulgadas :aulas. 1nacmara se :ó a $8 L & y fotoperiodo corto %D!M $<0), condiciones que activarnel desarrollo de morfos sexuales. !as colonias de A. monardae en Monardafstulosa !., A. sedimentos en (ylotelephium telephium %!.) .'hba, y A.gossypii en Cucur*ita pepo ! . y Rhamnus cathartica !. fueron expuestos aestas condiciones durante periodos de tiempo prolongados. !as muestras de

A. monardae y A. sedi se recogieron en una base semanal de las plantashospedadoras enumeradas arriba y examinados para detectar la presencia demorfos sexuales. En las :aulas de muestras semanales A. gossypii se tomaronde C. cathartica.

!a cmara = se :ó en 8B L & con iluminación constante %8B horas) paramantener colonias y antrión ensayo de planta especicidad de las tresespecies mencionadas anteriormente. !os siguientes experimentos sereali/aron en la cmara =M una planta stulosa Monarda infestadas con A.



monardae se colocó en una :aula con una planta de &. pepo libre de pulgón yse de:ó durante varias semanas. -e hi/o un examen cada dos semanas de lasplantas de &. pepo para determinar si A. monardae les había coloni/ado. 1naplanta de Cucur*ita pepo infestadas con A. gossypii se colocó en una :aula conlibre de pulgón 7. fstulosa y . telephium y se de:ó durante varias semanas.0os veces por semana se hi/o un examen de 7. fstulosa y . telephium para

ver si A. gossypii les había coloni/ado. 1na planta (ylotelephium telephiuminfestada con A. sedi se colocó en una :aula con libre de pulgón &. pepo y sede:ó durante varias semanas. 0os veces por semana se hi/o un examen de &.

pepo para ver si A. sedi había transferido a ellos. 1n rbol completo de C.cathartica infestadas con A. gossypii se aisló en un 8 por 8 por 8 metros a rasde :aula en mayo del 89$$, sobre la base de las Hran:as del -ur de la1niversidad de (llinois %-upl. $) material. !a temperatura osciló entre $9 y 88 L&, httpMII333.is3s.illinois.eduIatmosIstatecliIcu3eatherI. *ulgón libre de &.

pepo, . telephium y Glycine max fueron colocados en la :aula paradocumentar la posibilidad de infestación de estos hu"spedes secundarios encondiciones ambientales naturales

#esultados"An'lisis logen!tico

1n total de $<9 secuencias &'( de 8D especies, de $66 secuencias de E$*alfade 6< especies, y $6 secuencias de &- a partir de < especies se utili/aron eneste estudio. 0espu"s de la alineación y la exclusión de los sitios de loscebadores, $.849, $.95D y 596 pb para los países de origen, E$*+ %incluidaslas lagunas e intrones) y -& se utili/aron en el anlisis, respectivamente. &'(secuencia de divergencia entre especies del grupo de especies A. gossypiivarió de 9,9DK %entre A. gossypii y A. -E0() a 6,9BK %entre A. gossypii y A.monardae). !a divergencia de secuencias de A. glycines y A. nasturtii%compartiendo una planta hospedera de invierno con A. gossypii), en

comparación con las especies del grupo gossypii, varió de ,8K %entre A.gossypii y A. glycines) al <,45K %entre A. nasturtii y A. sedi) %?abla $).

!as divergencias de secuencia de E$*+ y -& se presentan en la ?abla 8. Engeneral, las secuencias &'( eran ms conservadas de E$*+, que a su ve/ eranms conservadas de -&.

a%la " Cango de @imura 8 armetro pares divergencia de secuencias inter eintraespecíca %K) para las secuencias de &'(.

a%la *" Cango de @imura 8 armetro pares divergencia de secuencias inter eintraespecífica %K) para E$*+ y las secuencias de &-.



!os cladogramas utili/ando &'( %igura $) y E$*+ %igura 8) mostraron un altonivel de acuerdo. El anlisis &'( apoya la monolia de un grupo de especies%clade A) en relación con A. gossypii, incluyendo A. glycines, A. nasturtii, y ungrupo aGn ms estrechamente relacionados que se consideran miembros de laA. gossypii comple:a %&lade CE). 0entro de un clado varios grupos apoyadosM&lade de A. ru*iolii %?homas) y A. ru*icola 'estlund %M $,99); &lado ( de A.nasturtii y A. urticata Hmelin %M $,99); &lado = de A. glycines con la A.gossypii comple:a %M 9,44). El comple:o A. gossypii es en sí bien apoyado%&lade 0, M 9,44), e incluye dos gruposM El clado E de A. gossypii y A. sedi %M

9,44) y &lade de A. oestlundi Hillette, A. monardae, y varios posibles nuevasespecies.

El dendrograma inferida por 7r=ayes utili/ando E$*+ %igura 8) es congruentecon el de &'( para algunos taxones se ha mencionado anteriormente %clade A,M 9,44), aunque la falta de resolución impedido la recuperación de uncomple:o A. gossypii monol"tico 7edio 'este. !a estrecha relación de A.nasturtii y A. urticata se apoya con rme/a %&lado H, M $,99) como es clado =%M 9,44). 1n clado en el anlisis &'( es polifil"tico en el anlisis E$*+ eincluye las especies asiticas A. ichigicola -hin:i y A. ichigo -hin:i %clado , M9,45); A. glycines y A. sanguisor*icola ?a>ahashi %&lade E, M 9,4D). &lado & noest bien apoyado y presenta polytomies de especies estrechamenterelacionadas con A. gossypii:



+igura " &ladograma dedu:o de basa en el anlisis de la &'( con 7r=ayes. !os valoresde apoyo %posterior probabilidades) estn por deba:o de las ramas. #o se presentanvalores por deba:o de 9,4. nombres de las especies son seguidos por lugar de larecolección %EE.11.M A! %Alabama), &olorado %&olorado), (o3a %(o3a), (! %(llinois), E#%(ndiana), @- %@ansas), !uisiana %!uisiana), 7isuri %7isuri), 7# %7innesota), 'hio %'hio),0a>ota del -ur %0a>ota del -ur), Sisconsin %Sisconsin)), y el nGmero de haplotipos.



+igura *" &ladograma dedu:o de basa en el anlisis de E$*+ con 7r=ayes. !os valores

de apoyo %posterior probabilidades) estn por deba:o de las ramas. #o se presentanvalores por deba:o de 9,4 nombres de las especies son seguidos por lugar de larecolección, el nGmero de haplotipos y g"nero de la planta hu"sped.



+igura " Celaciones inferidas utili/ando el gen -& basado en el anlisis con 7r=ayes.!os valores de apoyo %posterior probabilidades) estn por deba:o de las ramas.#ombres de las especies son seguidos por el lugar de la recolección %EE.11.) y elnGmero de haplotipos.

A. sedi, A. oenotherae 'estlund; los taxones asiticos A. egomae -hin:i, A.sumire 7oritsu, A. taraxacicola %=Vrner), y A. clerodendri 7atsumura; y laespecie A. monardae y A. oestlundi de Am"rica del #orte.

El gen -& era difícil para amplicar y por lo tanto sólo adquirió secuencias deseis taxones. El cladograma bayesiano utili/ando -& %igura 6) muestra dos

grupos apoyados fuertementeM A. monardae %clade A, M 9,4<) y el grupocompuesto por A. sedi, sp.8 Aphis y A. gossypii %subtipo =, M $.99 ).

+igura -" abitus imgenes de morfos sexuales montados en portaob:eto de un Aovípara de A. monardae . macho de A. monardae / ovípara de A. sedi, y vivíparospteros de 0 A. gossypii 1 A. gossypii + A. gossypii G A. sedi H A. glycines & A.monardae 2 A. nasturtii 3 A. oestlundi.



La evidencia %iológica"

0espu"s de cuatro semanas en condiciones de temperatura reducida y elfotoperíodo, las colonias de A. monardae criados en 7. fstulosa producenovíparas y los machos pteros %igura BA*=). Adems, se recogieron morfossexuales en el campo %7iddlefor> sabana, &ondado de !a>e) a principios de

octubre %-upl. $) material. Aphis sedi sobre . telephium produ:o ovíparas%igura B&) pero no se encontraron machos. ale diapositivas de ambasespecies son depositados en la colección de insectos (#- con los siguientesnGmeros de catlogoM A. monardae, $8.DD hasta $8.D<; A. sedi, y $$898*$$89D $$.4*$$.56. En la cmara A, no se encontraron morfos sexualesde A. gossypii despu"s de la exposición de dos meses a las ba:as temperaturasy la reducción de fotoperíodo y colecciones semanales sobre C. cathartica.

!os experimentos al aire libre situadas en las gran:as del sur de la 1niversidadde (llinois fueron evaluados despu"s de 8 días. A nales de los vivíparos A.gossypii se ve en . telephium y H. max pero no produ:o descendencia, sinembargo, alados que se movían a &. pepo sí produ:eron vivíparos pteros yalados. ale diapositivas se depositan en los nGmeros de colección de insectos(#-M $8D$*$8D5. !as colonias de A. gossypii criados en &. pepo sepusieron en una cmara de crecimiento = donde crecieron rpidamente.7aceta 7. stulosa se coloca en esta cmara y fueron coloni/adas por A.gossypii. !as plantas limpias de &. pepo que luego fueron expuestos en lamisma cmara a una colonia de A. monardae no fueron coloni/ados. 1nacolonia de A. sedi inició con fundatrices de . telephium fue expuesto a &.

pepo en cmara de crecimiento = durante varias semanas, pero los dos notransrió a establecer y en esta planta.

+igura 4" Anlisis de varian/a de caracteres morfológicos Gtiles para discriminar Aphisgossypii, A. monardae, y A. sedi. !a línea gris representa la mediana. El diamante grisrepresenta los medios y desviación estndar. 1n nivel de 4K indica una diferenciasignicativa. A distancia de la base del segmento antenal ((( a la primera sensoriosecundario %0=((() entre A. gossypii y la relación de A. monardae . longitud de procesosterminales %?) a la base del Gltimo segmento antenal . entre A. gossypii y A. sedi /relación de la longitud de sifGnculos %-() a la longitud de la cola de %&A) entre A .

gossypii y A. sedi.

/omparación de Aphis monardae y Aphis gossypii

En tanto el &'( y E$*+ anlisis, A. monardae se distingue fcilmente de A.gossypii %igura $ &lado H, igura 8 &lade 0). Aphis gossypii y A. monardaetambi"n son diferenciables morfológicamenteM $) los sifones de morfo pterosson ms oscuras en A. gossypii que en A. monardae, y 8) O rinarios secundariosen el segmento antenal ( son siempre ausente a nales de vivíparos de A.



gossypii, pero presente en A. monarda %-uppl. 8 de material). 1na tercera,novela de carcter morfológico, es la distancia desde la base del segmentoantenal ((( a la primera sensorial secundaria %0=((() en vivíparos alados tambi"nsepara "stas especies consistentes. En A. gossypii, los sensoria secundarias sedistribuyen uniformemente a lo largo del segmento %igura <=) pero no en A.monardae %igura <&). !os medios de la distancia desde la base del segmento

antenal ((( al margen basal de la primera sensorio secundaria de A . gossypii yA. monardae son 9,9< y 9,9D mm, respectivamente %igura A, ratio W $8,6,df W $, X9,999$). !as pruebas que avalan el aislamiento reproductivo de estaespecie es la presencia de ovíparas %igura BA) y los machos pteros de A.monardae %igura B=) sobre 7. fstulosa %(#- nGmeros de colección deinsectosM $$66*$$6BB y $8DD*$8D<, respectivamente), así como unasecuencia &'( divergencia de 8.5 a 6.BK entre A. gossypii y A. monardae %?abla$).

+igura 5" -egmentos antenales %((*() e:emplares de vivíparos alados A A. glycines .

A. gossypii / A. monardae, muestra la distancia desde la base del segmento antenal (((con el primer sistema sensorial secundaria, 0=((( 0 A. nasturtii 1 A. oestlundi + A. sedi.

#edescripción de Aphis monardae Oestlund de 667

"iagn!stico: -ifGnculos de morfo pteros plido, oscuro distal. &uando viva, decolor amarillo claro a verde claro, el cuerpo cubierto de cera blanca %igura D=).En vivíparos aladosM rinarios secundarios en el segmento antenal ( presentes%igura <&). !a distancia desde la base del segmento antenal ((( a la primerasensorio secundario %0=(((), 9<*,$8 %9,9D).

#eotipo: Apterous hembra vivípara. EE.11.M 7innesota; &ondado de 0ouglas;en Monarda fstulosa !.; B.D$<9 L #, 4.5B58 L S; $4.viii.89$9; 0. !agos.

#eotipo hembra vivípara pteros %&olección de (nsectos (#- $6959).=ody$.B, 1C- 9,94, accesorio de setas 8, segmentos antenales (((M 9,$<, 9,9D(, 9.94, = 9.9D, 9.$D t, !((( 9.9$9, tibias posteriores 9.9, 9.9D ?8,anchura del tub"rculo en ?ergito abdominal ( 9.989, anchura de tub"rculo entergito abdominal (( 9.9$D, sifGnculo 9,$4, 9,$8 cauda, con setas, tergito (((abdominal con 8 setas, placa sub*genital con 6 pelos en la parte anterior.



er -uppl. 8 de material para las mediciones morfológicas de los cuatro morfosde A. monarda. (mgenes adicionales de A. monarda se pueden encontrar en!agos et al. %89$BA).

Aparato vivíparo %n W B9). &l color en la vida %igura D=)M cabe/a, tórax yabdomen varían de amarillo claro a verde claro. El color de las muestras

despe:adas %igura BE)M Ca*e+a: oscuro. ?odos los segmentos de la antenaplida, excepto el sexto largo, que es oscura. Cinarios ausente secundaria. 1C-no llega a la tuberosidad posterior. ,!rax: coxas, trocnteres y todos losf"mures oscuros. ?odo tibias posteriores oscuro y oscuro distal. A*domen:&auda ligeramente oscuro, con forma de lengua. -ifGnculos oscuro y oscurodistal, imbricados con la brida. Escleritos marginales plido. ?ub"rculosmarginales sólo se encuentra en los segmentos abdominales ( y ((. 0orsalabdomen sin escleritos. re y post*Escleritos sifunculares. ?ergito abdominal((( con 8 setas. -ubgenital placa completa, un poco oscuro con 8*5 pelos enparte anterior. &utícula con la reticulación.

+igura 7" &uerpo de nales vivípara. A A. glycines . A. gossypii / A. gossypii 0 A. sedi1 A. monardae + A. nasturtii G A. oestlund.

-ivíparos alados %n W 4). &l color en la vida %igura D=)M cabe/a y tórax decolor marrón. Abdomen verde. &l color de las muestras despeado %igura 5E)M

Ca*e+aM segmentos oscuros de la antenaM en primer lugar y en segundo lugaroscuro, el resto oscuro. -ensoria secundarios presentes en y ((( y (. 0isposiciónde rinarios secundarios en una sola la en la mitad distal %igura <&). ,!rax:

?odo el f"mur oscuro excepto en la base. 'scuro coxa posterior. ?rocnterestraseras ms plido que coxa. ?ibia distal oscura. A*domen: &auda plido oligeramente oscuro. !a cauda de lados paralelos con constricción cerca de labase. -ifGnculos oscuro largo, imbricado con la brida. re*sifuncular Escleritosausente. ost*sifuncular Escleritos oscuro. Escleritos marginales plido.

?ub"rculos marginales sólo se encuentra en los segmentos abdominales ( y ((.



0orsal del abdomen con peque2os escleritos transversales en (, (( y (((. ?ergito abdominal ((( con 8 setas. -ubgenital completa placa, ligeramenteoscuro, con 8*5 pelos en parte anterior. &utícula sin reticulación.

+igura 6" Aphis especies del comple:o A. gossypii. A 1n vivípara Apterous de A.gossypii en Rhamnus cathartica . ninfas, pteros y alados vivíparos de A. monardae enMonarda fstulosa / Apterous ovipara de A. monardae 0 y ninfas macho pteros%pardu/co en el centro de la imagen) de A. monardae 1 ninfas y vivípara aladas de A.gossypii en Cucur*ita pepo + ninfas y vivípara pteros de A. oestlundi de /enothera*iennis G Apterous vivípara %arriba) y ovípara pteros %parte inferior) de A. sedi en(ylotelephium telephium.

/víparas %n W 8<). El color en la vida %igura D&)M Ca*e+a: varía de marrón claroa verde oscuro. -egmentos de la antenaM primero, segundo y tercero de Y, elresto oscuro amarillento plido. ,!rax: coxas y trocnteres plido u oscuro."mures delanteras oscuro largo, midfemora oscuro, excepto en la base,oscuro f"mures posteriores, excepto en la base. ?ibias y tarsos oscuro distaloscuro. A*domen: &auda de color verde oscuro. -ifGnculos ms ligero que elabdomen de color verde oscuro. &l color de la diapositiva y caracteresmorol!gicos %igura BA)M Ca*e+a: oscuros y sin pelos frontal. ?ub"rculo antenalsin desarrollar. Antenas metro sesenta y cinco segmentado, ms corto que elcuerpo. -egmentos antenalesM primero, segundo, tercero y cuatro plido, el

resto oscuro. ?ribuna alcan/a 7esocoxas. ,!rax: coxas y trocnteres oscuro. ?odos los f"mures oscuro largo. ?ibias y tarsos oscuro largo. A*domen: &audaoscuro, en paralelo del lado de punta roma y teniendo <*D setas. -ifGnculosplido, suave y con brida. re y post*Escleritos sifunculares ausentes.

?ub"rculos marginales sólo se encuentra en los segmentos abdominales ( y ((.0orso del abdomen sin escleritos. ?ergito abdominal ((( con B*D setas.-ubgenital placa oscura, con B*$5 pelos en la parte anterior. &utícula sinreticulación.



Alados masculinos %n W $5). &l color en la vida %igura D0)M Ca*e+a: pardu/co. Antenas: negru/ca. ,!rax: verdoso. atas de color marrón claro y las tibiasdistales oscuras, así como tarsos. A*domenM &auda de color verde oscuro.-ifGnculos ms ligero que el abdomen de color verde oscuro. Color encaracteres morol!gicos y de desli+amiento %igura B=)M Ca*e+a: oscuro.Antenas oscuro con rinarios secundarios dispersos en los segmentos (((, ( y .

A*domen: &auda plido u oscuro, de lados paralelos con punta roma yteniendo 6*< setas. ?ub"rculos marginales presentes en los segmentosabdominales ( y ((. 0orso del abdomen sin grandes escleritos transversales.Henitales masculinos con 8 abra/aderas cortas anterior y aedeagus el centro.

La comparación de Aphis sedi y Aphis gossypii "

!a distinción de A. sedi de A. gossypii se apoya en caracteres fenotípicos deespecímenes en colecciones de los &uadros -$ y -8. Adems, los caracteresmorfológicos tales como la relación de las longitudes de la terminalis processusy la base del segmento antenal sexto %-uppl material de 8, igura =M Celación

W B4D,$, df W $, X 9,99$) y la relación de las longitudes de la sifGnculo y lacauda %-uppl 8 de material, igura &M. cociente W $<D,, df W $, p X9,99$)de vivíparos pteros pueden ser Gtiles para discriminar estas especies.&uriosamente, sólo ovíparas de A. sedi criados en (ylotelephium telephium serecogieron en condiciones de laboratorio %iguras B& y DH). En contraste conlas diferencias morfológicas, las divergencias gen"ticas interespecícasutili/ando secuencias de &'( y E$*alfa de A. gossypii y A. sedi son de menosde $K %?ablas $ y 8). -& mostró una mayor divergencia gen"tica entre estasdos especies, a saber 9,DB a $,DBK %?abla 8).

/omparación de Aphis gossypii con Aphis forbesi , Aphis glycines y Aphis nasturtii.

Estas especies son a menudo identicadas erróneamente, ya que compartenalgunos caracteres morfológicos en cualquiera de morfos pteros o alados.Adems, la secuencia de pares divergencias usando secuencias &'( entre A.gossypii y A. or*esi Seed, A. glycines y A. nasturtii son de hasta K %?abla $).Aquí presentamos algunos caracteres que pueden ser Gtiles para sudiscriminación. ivíparos Apterous de A. gossypii se puede diferenciar de los deA. or*esi por la anchura de los tub"rculos marginales en los segmentosabdominales ( y (( %mximo 9.9$$ en A. gossypii y mínimamente 9.98 en A.or*esi; se da rango para A. gossypii en -upl. de material 8), el nGmero desegmentos de la antena y el patrón de color de los sifones. Zpteros de A.gossypii se diferencian de las de A. glycines por la forma de las guras cauda%, ) y el nGmero de setas caudal, y de los de A. nasturtii por la ausencia detub"rculos marginales en los segmentos abdominales (( y ( %igura BJ).ivíparos alados E:emplares de Aphis gossypii se puede diferenciar de los de A.or*esi por el nGmero de rinarios secundarios en el ((( y el 0=((( %-uppl. 8 dematerial), de los de A. glycines por el color de la tuberosidad posterior yescleritos marginales %gura 5A) y de los de A. nasturtii por el nGmero derinarios secundarios en los segmentos antenales (((, ( y , la ausencia detub"rculos marginales en los segmentos abdominales (( y (, y la forma de la



cauda %igura 5). 7s cifras y caracteres morfológicos se han subido en !agoset al. 89$BA.

/laves dicotómicas para 'pteros y alados hem%ras viv8paras del Aphisgossypii comple9o en el Medio Oeste"

7uchos claves dicotómicas a subcon:untos de Aphis se han escrito %ottes yrison $46$, almer $48, Co:anavongse y Cobinson $455, &oo> $4DB, -troyan$4DB, eie $4D<, =ro3n $4D4, Harcía rieto et al., 899, =lac>man y Eastop899<) cuando los caracteres morfológicos no eran Gtiles para discriminar entreespecies, se han utili/ado las asociaciones de plantas hu"sped. or desgracia,en el 7edio 'este A. gossypii se ha encontrado en la mayoría de las plantashospederas de otras especies de Aphis incluidos en este comple:o %A. gossypii,A. monardae stat. #ov., A. oestlundi y A. sedi). !a clave alternativa que sepresenta a continuación se basa en muestras procedentes de coleccioneshechas en el 7edio 'este, y los datos moleculares para especímenes de estascolecciones %?ablas $ y 8) es compatible con nuestras identicaciones basadasen la morfología. !os datos morfológicos de estas especies se muestran en-upl. 8. ara algunos materiales datos morfo m"tricos comparativos demuestras europeos de A. gossypii y A. sedi ver -troyan %$4DB), eie %$4D<),=ro3n %$4D4) y Harcía rieto y otros. %899). !a clave es especíca de 7id3estrecogió muestras y puede no ser able en otras regiones geogrcas. ?ambi"ndemuestra la dicultad de separar estas especies estrechamente relacionadasusando sólo caracteres morfológicos.

0e%ate"

El anlisis de las diferentes especies incluidas en este estudio corrobora engran medida los resultados obtenidos por &oeur dFAcier et al. %8995), @im y !ee%899D), @im et al. %89$9a), @im et al. %89$9b), @im et al. %89$$) y !agos et al.%89$Bb). El comple:o gossypii en el 7edio 'este estadounidense del #orte

contiene las siguientes especies nativas, A. oestlundi y A. monardae, y laespecie invasora A. gossypii y A. sedi. Cegistros de host &olección de A.gossypii muestran que se ha recogido en /enothera y Monarda, las plantashu"spedes de la especie nativa Aphis mencionadas anteriormente %=lac>man yEastop 899<). !os registros de la colección para las especies nativas sugierenuna gama de hu"spedes muy limitado, en contraste con la muy polífago A.gossypii. #uestros resultados indican que estas especies pueden serdiferenciadas por caracteres morfológicos, así como asociación antriona. !osdatos de este estudio conrma el halla/go de !agos %8995) que A. monardae esuna especie vlida y no es un sinónimo de A. gossypii %Eastop y ille Cis!ambers, $45<). El carcter novedoso %distancia de la base del segmentoantenal ((( a su primera sensorio secundaria, 0=((() es Gtil para diferenciar

vivíparos alados de A. monardae y A. gossypii cuando se recogen :untos entrampas. !os morfos sexuales recogidos en Monarda en condiciones delaboratorio y de campo indican que A. monardae tiene un ciclo de vidaholocyclic monoica. 1n neotipo de A. monardae tiene que ser designado deacuerdo con el artículo 5.6 del &ódigo (nternacional de #omenclaturaRoológica %&omisión (nternacional de #omenclatura Roológica $444).&oncomitante con la re*descripción de la especie, que designan aquí neotipode A. monardae del estado de 7innesota el Monarda fstulosa. 0iapositivasdepositado por '. S. 'estlund en la colección de insectos de los datos de la



colección muestran 1niversidad de 7innesota no antes de $D4<. -in embargo,la primera descripción de Aphis monardae se publicó en $DD5 y la descripciónoriginal especicado ni un tipo ni la localidad tipo %'estlund $DD5). !acomparación de pteros, alados y ovíparos de las colecciones de 'estlundcoinciden con los caracteres morfológicos de las recogidas recientemente%-upl. $) material. Algunas diapositivas hechas por 'estlund se vuelven a

montar en $4<D por lo que fue posible ver me:or los persona:es. ara unaneotipo elegimos un esp"cimen recolectado ms recientemente tomada en7innesota, ya que muestra ms claramente el patrón de color y otroscaracteres utili/ados en la re*descripción.

!a discriminación de A. gossypii y A. sedi es claro cuando los dos estn vivos%igura D). El problema de identicación surge cuando examinamos muestrasque han perdido su color al ser almacenado en etanol. !os datos molecularestambi"n son Gtiles. !as secuencias por pares divergencias entre estas especiesutili/ando -& son mayores que para los países de origen y las secuencias deE$*alfa %?ablas $ y 8). Este marcador tambi"n diferenciarse con "xito elcríptico especie A. gossypii y A. 0rangulae %&arletto et al. 8994a). !os

resultados obtenidos en este estudio corroboran los halla/gos biológicos ymorfológicos de @ring %$4), quien encontró que A. sedi es monoica holocyclicen (ylotelephium. En este estudio, se recogieron sólo ovíparas pteros encondiciones de laboratorio propicias para la producción del sexuales %iguraB&). 'bservaciones morfológicas de @ring mostraron que la relación de laterminalis processus a la base del Gltimo segmento antenal %? I =), y larelación de la longitud de la sifGnculo a la longitud de la cola de %-( I &A), sonambas mayores que en A. gossypii que A. sedi para todos los morfos %-uppl. 8)de material. Aunque los caracteres anteriores son Gtiles para diferenciar estasespecies, su identicación %especialmente el vivíparos alados) sigue siendoproblemtica debido a su morfología similar y debido a que estas relaciones sesolapan %guras =*&).

!a inclusión de A. glycines$ A. gossypii y A. nasturtii en clados apoyarmemente %un clado, las iguras $ y 8) es consistente con los halla/gos deoottit et al. %899D), pero en desacuerdo con los de @im et al. %89$9a).&uriosamente, estos tres especies invasoras comparten una planta hu"spedinvierno, Rhamnus spp., ero esto no es el Gnico conocido antrión dehibernación para A. gossypii. Este comportamiento indiscriminado, adems demGltiples especies que comparten hosts de invierno, plantea la posibilidad dehibridación entre especies %7[ller $4D<, Ca>aus>as 8996). !a hibridaciónpuede o no puede tener "xito, pero debe ser detectable en los estudios de \u:ode genes y caracteri/ación fenotípica de los híbridos putativos. !as especiesconsideradas aquí como miembros del comple:o A. gossypii, A. gossypii, A.

sedi, A. oestlundi y A. monardae %&lade 0), muestran patrones biológicos,morfológicos y moleculares interesantes. Aphis gossypii se ha demostrado paracoloni/ar a numerosas plantas hu"spedes secundarios, incluyendo los detaxones estrechamente relacionados %-troyan $4DB, eie $4D<, =lac>man yEastop 899<). Adems, es una de las pocas especies de Aphis con mGltiplesplantas hu"sped primario %=lac>man y Eastop 899<). or el contrario, lostaxones nativos relacionado con "l y que se encuentra en la región centraltiene o se presume que tienen ciclos de vida holocyclic monoicas %v"ase -uppl.$ de material de información de la planta hu"sped). Aphis oestlundi, A.



monardae y A. sedi tienen machos sin alas, una característica que contribuiríaal aislamiento gen"tico de estas especies. Estas especies hermanas poseencaracteres morfológicos Gtiles para nes de diagnóstico %-uppl. 8) materiales ylos valores que apoyan divergencias secuencias interespecícas %?abla 8) sonsimilares a los encontrados por oottit et al. %899D) y avret y 7iller %89$$). !aidenticación de especies relacionadas con A. gossypii se hace ms difícil

porque se alimentan de plantas hu"sped, que tambi"n puede servir comoantrión de A. gossypii. &uriosamente, sin embargo, sus colores en la vida sondiferentes y pueden ser Gtiles para la identicación. or e:emplo, A. gossypii esde color marrón oscuro o la lu/ verde y sus sifones son oscuras a lo largo%iguras DA, E), aunque esto puede variar en muestras enanas verano. Aphisgossypii es sobre todo ms oscuro que A. monardae, que es de color amarilloclaro o verde %iguras D=, &), y A. oestlundi es de color amarillo claro %iguraD). El color de A. sedi de color verde oscuro %igura DH), al igual que A .gossypii, aunque tiene ms de cera blanca sobre su cuerpo %Harcía rieto et al.,899).

!os valores de divergencia de secuencias de &'( obtenidos en este estudio son

similares a los obtenidos en otros estudios %&ocu//a et al., 8994, &ognato de899<, &oeur dFAcier et al., 8995, oottit et al., 899D, avret y 7iller 89$$, Sangy Niao 8994). or otra parte, las divergencias por pares ba:os de secuenciasencontradas entre algunas especies, como A. gossypii y A. sedi %?abla $) sonconsistentes con los obtenidos por otros investigadores como iUaretti et al.%89$8). -i bien los datos de &'( se han encontrado Gtiles para discernir lasrelaciones logen"ticas de muchos taxones, el uso de la &'( secuenciadivergencias para establecer puntos de corte que pueden diferenciar especiesde Aphis debe utili/arse con precaución, ya que puede conducir a laidenticación errónea de nuevas especies, una conclusión extraída por otrosestudios de varios órdenes de insectos %=laxter de 899B, ebert et al., 899B,8998 #adler, Sill y CubinoU de 899B, -mith et al., 899D).

#uestro traba:o sugiere la posible existencia de tres especies no descritas delmedio oeste % Aphis spp. $, 8, y 6) dentro del comple:o gossypii. #uevosestudios deben hacerse para validar su estado. Es probable que las nuevasespecies adicionales se encuentran dentro de este grupo como material seobtiene de una /ona geogrca ms amplia y combina los datos moleculares,morfológicos y biológicos se utili/an para anali/ar los nuevos taxa. El uso demGltiples hosts primarios es inusual para cualquier especie, por lo tanto lina:esdentro del comple:o gossypii que seleccionan y se limitan a determinados hostspueden impulsando el proceso de especiación dentro de este grupo %eccoudet al., 89$9, @im et al. 89$$).

La Diferenciación Molecular y Morfológica Entre Aphis Gossypii Glover

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