Profesor Patrocinante

Dr. Bredford Kerr Fuentes

Centro de Estudios Científicos

Profesor Co-Patrocinante

Dra. Claudia Torres Farfán

Instituto de Anatomía, Histología y Patología

Facultad de Medicina

LA AUSENCIA DE MECP2 PRODUCE UN AUMENTO DEL

PESO CORPORAL Y ALTERA LA EXPRESIÓN DE GENES

ASOCIADOS AL BALANCE ENERGÉTICO

Tesis de Grado presentada como parte de

los requisitos para optar al grado de

Licenciado en Bioquímica y Título

Profesional de Bioquímico

RODRIGO ALEXIS MOLDENHAUER VERA

VALDIVIA – CHILE

2013

“...Un hombre se levanta / Con una lupa / Busca en el mapa /

Un lugar en el que nunca ha estado...”

(Ai Qing, fragmento de “Cabo de Chile”).

Dedicado a mi padre, Jaime

A mi tía, Isolda

A la Patagonia libre e independiente

Con todo mi cariño y esfuerzo

AGRADECIMIENTOS

Ha sido un auténtico placer el haber recorrido este camino con todas las personas que de

una u otra forma participaron en mi crecimiento espiritual e intelectual. El desarrollo de este

trabajo es el cierre de una etapa de mi vida, quizás la más importante hasta ahora.

En primer lugar quisiera agradecer al Dr. Bredford Kerr, por confiar en mí y haberme

dado la oportunidad de formar parte de su grupo de trabajo. Sin duda ha sido una experiencia

muy enriquecedora, tanto en lo personal como en lo profesional. Agradezco su entrega, paciencia

y entusiasmo, siempre incentivándome a ir un poco más allá de lo que se nos pide. Gracias por tu

enorme disposición para la discusión de resultados, papers y temas que escapan a la ciencia.

Quiero agradecer también a mi padre, Jaime, y a mi tía, Isolda, quienes me han apoyado

de manera incondicional durante todas las etapas de mi vida. Gracias por valorar mis logros, y

por mostrarme siempre que la vida es hermosa y que vale la pena vivirla. Ustedes son el pilar

fundamental en el cual se afirma todo lo que soy. Agradezco sus enseñanzas y consejos, con todo

mi corazón.

Finalmente quisiera agradecer a mis grandes amigos y hermanos, sin distinción de

ninguno, por brindarme siempre una mano y apoyarme en todo. En especial, me gustaría

agradecer a Mirtha Rios, por su amistad incondicional, y por haberme soportado durante tantos

años de amistad.

Este trabajo fue realizado en el Centro de Estudios Científicos (CECs) y fue financiado

por el proyecto FONDECYT Nº 1100821.

i

ÍNDICE GENERAL

1. RESUMEN 1

1.1. SUMMARY 2

2. INTRODUCCIÓN 3

2.1. MECP2 3

2.2. Síndrome de Rett 7

2.3. Modelos murinos de Síndrome de Rett 11

2.4. Balance energético corporal 13

2.5. Planteamiento del problema, propuesta de trabajo 16

2.6. Hipótesis del trabajo 16

2.7. Objetivo general 17

2.8. Objetivos específicos 17

3. MATERIALES Y MÉTODOS 18

3.1. MATERIALES 18

3.1.1. Reactivos y kits utilizados 18

3.1.2. Partidores 19

3.1.3. Animales de experimentación 21

ii

3.2. MÉTODOS 22

3.2.1. Aislamiento de ADN genómico para genotipificación 22

3.2.2. Genotipificación de animales mediante PCR 22

3.2.3. Registro de peso corporal 25

3.2.4. Determinación de la ingesta de comida 25

3.2.5. Método de eutanasia y extracción de tejidos 26

3.2.6. Extracción de ARN total de hipotálamo y tejido adiposo 26

3.2.7. Síntesis de ADNc mediante RT-PCR (Transcripción reversa) 27

3.2.8. PCR en tiempo real 27

3.2.9. Análisis de expresión para Mecp2 en tejido adiposo por PCR convencional 29

3.2.10. Extracción de proteínas para Western blot 29

3.2.11. Análisis de Western blot para Mecp2 en tejido adiposo 30

3.2.12 Herramientas bioinformáticas y softwares utilizados 31

3.2.13. Análisis estadísticos 31

4. RESULTADOS 33

4.1. Obtención y genotipificación de ratones WT y KO para Mecp2. 33

iii

4.2. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en el peso corporal no asociado a una

mayor ingesta de comida. 35

4.3. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en la cantidad de tejido adiposo en

relación a sus hermanos WT. 39

4.4. Los niveles de expresión de leptina en tejido adiposo blanco se encuentran incrementados en

ratones KO para Mecp2. 41

4.5. La expresión relativa de los principales genes que controlan el balance energético corporal a

nivel central se encuentra desregulada en ratones KO para Mecp2. 43

4.6. Los ratones KO para Mecp2 fallan en responder adecuadamente a la administración exógena

de leptina. 47

4.7. La expresión relativa de genes asociados a termogénesis se encuentra incrementada en

ratones KO para Mecp2. 51

4.8. La proteína Mecp2 no es expresada en tejido adiposo blanco y tejido adiposo pardo 53

5. DISCUSIÓN 55

6. BIBLIOGRAFÍA 67

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura del gen MECP2 y sus productos proteicos. 4

Figura 2. Conjunto y progresión de características clínicas en pacientes con RTT. 8

Figura 3. Esquema de alineamiento de partidores para la reacción de genotipificación. 24

Figura 4. Detección de los alelos WT y KO para Mecp2 mediante PCR convencional. 34

Figura 5. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en el peso corporal en relación a

sus hermanos WT. 36

Figura 6. El aumento del peso corporal en los ratones KO para Mecp2 no es producto de una

mayor ingesta de comida. 38

Figura 7. La cantidad de tejido adiposo blanco y pardo se encuentra incrementada en ratones KO

para Mecp2. 40

Figura 8. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en los niveles de expresión de

leptina en relación a sus hermanos WT. 42

Figura 9. Los ratones KO para Mecp2 presentan una alteración en la expresión de genes claves

para la regulación central del balance energético corporal. 44

Figura 10. Los niveles de expresión de los principales receptores involucrados en la regulación

de la homeostasis energética se encuentran alterados en ratones KO para Mecp2. 46

Figura 11. Los ratones KO para Mecp2 no responden a leptina con una disminución en el

consumo de alimento. 48

v

Figura 12. Los ratones KO para Mecp2 no responden a leptina con un aumento en la expresión

hipotalámica de Pomc. 50

Figura 13. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en la expresión de los

principales genes que regulan el gasto energético en iBAT. 52

Figura 14. Mecp2 no se expresa en los tejidos adiposos blanco y pardo. 54

vi

LISTADO DE ABREVIATURAS

ADNc ADN complementario

AdrRβ3 Receptor adrenérgico β-3

AgRP Péptido relacionado a agouti

ARC Núcleo arcuato del hipotálamo

ARNm ARN mensajero

A / T Adenina / timina

ATG Codón de inicio de la traducción

BLAST Herramienta para la búsqueda de alineamiento de secuencias

CART Transcrito relacionado con cocaína y anfetamina

CpG Citosina fosfato guanina

CREB Elemento de unión en respuesta a cAMP

C-terminal Extremo carboxilo terminal

Cyc Ciclofilina 1

DNMT1 ADN metiltransferasa 1

dNTPs Desoxinucleótidos trifosfato

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

vii

EE Error estándar

HDAC Histona deacetilasa

Htl Hipotálamo

iBAT Tejido adiposo pardo interescapular

InsR Receptor de insulina

iWAT Tejido adiposo blanco inguinal

KO Ratón mutante nulo

LepR2 Isoforma larga del receptor de leptina

MBD Dominio de unión a ADN

MC3R Receptor de melanocortinas 3

MC4R Receptor de melanocortinas 4

MECP2 Proteína de unión a islas CpG metiladas 2

Mecp2+/-

Hembras heterocigotas para Mecp2

Mecp2308/y

Ratón que expresa una forma truncada de Mecp2

MSH Hormona melanocito estimulante

NLS Señal de localización nuclear

NPY Neuropéptido Y

viii

pb Pares de bases

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

POMC Proopiomelanocortina

PVN Núcleo paraventricular del hipotálamo

rpm Revoluciones por minuto

RTT Síndrome de Rett

SDS Dodesil sulfato de sodio

SPF Área libre de patógenos específicos

Tm Temperatura de alineamiento de partidores

TRD Dominio de represión transcripcional

UCP Proteína desacoplante mitocondrial

3`UTR Región no traducible 5`

UV Luz ultravioleta

XCI Inactivación del cromosoma X

WT Ratón silvestre

1

1. RESUMEN

MECP2 es una proteína nuclear que se une a secuencias de ADN metilado en CpG,

regulando de esta manera la actividad transcripcional de sus genes blanco. Mutaciones en

MECP2 son la principal causa del Síndrome de Rett (RTT), un desorden del neurodesarrollo

asociado a retardo mental y características autistas en mujeres. Las pacientes y los modelos

murinos de RTT presentan alteraciones asociadas a la homeostasis energética, principalmente a

nivel de la regulación del peso corporal, sugiriendo que MECP2 juega un rol esencial en el

mantenimiento del balance energético corporal. Sin embargo, la base molecular y fisiológica que

lleva a esta desregulación no ha sido descrita a la fecha.

Para determinar el impacto de la deleción de Mecp2 en el mecanismo central y periférico

que regula el balance energético corporal, analizamos el fenotipo y los patrones de expresión

exhibidos por ratones KO para Mecp2. Nosotros observamos que estos animales presentan un

incremento en el peso corporal en relación a sus hermanos WT, el cual no está asociado a una

mayor ingesta de comida. Además, la ausencia total de Mecp2 en este modelo de RTT alteró los

patrones de expresión de genes asociados a homeostasis energética, tanto a nivel central (Htl)

como periférico (tejido adiposo). Por otra parte, los ratones KO para Mecp2 presentaron un

aumento en la cantidad de iWAT e iBAT, lo que se correlacionó con un aumento en la expresión

de leptina y de genes que participan de la regulación de la termogénesis, respectivamente.

Nuestros resultados muestran las primeras evidencias de alteraciones moleculares y fisiológicas

que podrían dar cuenta del sobrepeso exhibido en ausencia de Mecp2, sugiriendo un rol de esta

proteína como un factor epigenético esencial para el control del peso corporal.

2

1.1. SUMMARY

MECP2 is a nuclear protein that binds to methylated DNA sequences in CpG, regulating

the transcriptional activity of their target genes. Mutations in MECP2 are the main cause of Rett

Syndrome, a neurodevelopmental disorder associated with mental retardation and autistic features

in women. Both patients and murine models of RTT exhibit alterations associated with energetic

homeostasis, mainly in the regulation of body weight, suggesting that MECP2 plays an essential

role in the maintenance of body energy balance. However, the molecular and physiological basis

leading to this deregulation has not been described to date.

In order to determine the impact of Mecp2 deletion in the central and peripheral

mechanism that regulates body energy balance, we analyzed the phenotype and gene expression

pattern exhibited by Mecp2 KO mice. We observed that these animals developed an increased

body weight compared with WT animals, which is not associated with an alteration in food

intake. In addition, the lacking of Mecp2 in this RTT model altered both central (Htl) and

peripheral (iWAT and iBAT) expression patterns of genes associated with energy homeostasis.

Moreover, Mecp2 KO mice showed an increased amount of iWAT and iBAT, which correlated

with a higher expression of leptin and genes involved in thermogenesis regulation, respectively.

Our results show the first evidences of molecular and physiological alterations that could account

for the overweight exhibited in the absence of Mecp2, supporting the role of this protein as an

essential epigenetic factor for the control of body weight.

3

2. INTRODUCCIÓN

2.1. MECP2

La proteína de unión a islas CpG metiladas 2 (MECP2) es una proteína nuclear que regula

la expresión de genes a través de la unión a secuencias de ADN metilado en residuos CpG (Lewis

et al., 1992; Nan et al., 1997). El gen que codifica para esta proteína está ubicado en el brazo

largo del cromosoma X y su secuencia consta de 4 exones y un 3´UTR inusualmente extenso con

4 señales de poliadenilación (Quaderi et al., 1994). Estructuralmente posee un dominio

conservado de unión al ADN (MBD) que permite la interacción con residuos CpG metilados

especialmente en regiones adyacentes a motivos ricos en A/T (Free et al., 2001; Hendrich y Bird,

1998; Wakefield et al., 1999), un dominio de represión transcripcional (TRD), un dominio C-

terminal y 2 señales de localización nuclear (NLS). El dominio TRD está involucrado en el

silenciamiento de la expresión génica a través del reclutamiento de co-represores y complejos de

remodelamiento de la cromatina, mientras que el dominio C-terminal facilita la unión de MECP2

al ADN desnudo y a las estructuras nucleosomales (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998).

MECP2 tiene 2 isoformas generadas por corte y empalme alternativo, MECP2e1 y

MECP2e2, las que se diferencian en su extremo amino terminal. Como se indica en la Figura 1,

la isoforma e1 contiene 496 aminoácidos, está codificada por los exones 1, 3 y 4, y el codón de

inicio de la traducción (ATG) se encuentra en el exón 1. Por otra parte, la isoforma e2 posee 486

aminoácidos, y utiliza el ATG presente en el exón 2 como sitio de inicio de la traducción

(Kriaucionis y Bird, 2004; Mnatzakanian et al., 2004).

4

Figura 1. Estructura del gen MECP2 y sus productos proteicos. A: Esquema simplificado del

gen que codifica para MECP2. Se indican los 4 exones y los sitios de poliadenilación. B: Proceso

de corte y empalme alternativo que origina las 2 isoformas de MECP2. La isoforma MECP2e1

excluye el exón 2, por lo tanto el inicio de la traducción toma lugar en la secuencia ATG del exón

1, mientras que para MECP2e2 el sitio de inicio de la traducción (ATG) es en el exón 2, aun

cuando el exón 1 está presente. (Modificado de Soto-Covasich, J.M. (2010)).

5

MECP2 se expresa en todos los tejidos humanos y murinos evaluados, pero en ratones

adultos su expresión se incrementa principalmente en cerebro –incluyendo neuronas y células

gliales- pulmón y bazo. Este aumento de la proteína a nivel cerebral se correlaciona con el

desarrollo del sistema nervioso central (Ballas et al., 2009; Lasalle et al., 2001; Shahbazian et al.,

2002a). En relación a esto, la isoforma e1 es la más abundante en cerebro, presentando una alta

expresión durante el desarrollo embrionario, seguido de una disminución postnatal y un posterior

incremento en la edad adulta (Pelka et al., 2005). Además, ha sido demostrado que en ratones las

isoformas e1 y e2 presentan distribución diferencial entre el tálamo dorsal y el hipotálamo

durante el desarrollo post natal del cerebro (Dragich et al., 2007). Sin embargo, a pesar de estas

diferencias en los patrones de distribución, experimentos de re-expresión transgénica han

mostrado que no existen diferencias funcionales entre las dos isoformas de MECP2 (Adkins y

Georgel, 2011; Kerr et al., 2012). Por otra parte, se ha visto que el aumento de la expresión de

MECP2 en la corteza cerebral se correlaciona con el desarrollo cortical, y además, que la

expresión de MECP2 en el epitelio olfatorio coincide con la maduración de las neuronas

receptoras del epitelio olfatorio (Cohen et al., 2003), sugiriendo que MECP2 juega un rol

importante tanto en la maduración neuronal como en el desarrollo del sistema nervioso central.

La función de MECP2 como un represor transcripcional fue sugerida inicialmente en base

a evidencias de experimentos in vitro, en los cuales MECP2 fue capaz de inhibir específicamente

la transcripción a partir de promotores metilados (Nan et al., 1997). El mecanismo involucra la

unión de MECP2 a dinucleotidos CpG metilados a través de su dominio MBD y posterior

reclutamiento del co-represor Sin3A y el complejo Histona deacetilasa (HDAC) 1 y 2 y la

compactación de la cromatina (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998). Además, ha sido demostrado

que MECP2 puede interactuar con otros complejos que modifican la cromatina, como SWI/SNF,

6

ADN metiltransferasas DNMT1, histona metiltransferasas, entre otros (Fuks et al., 2003;

Harikrishnan et al., 2005; Kimura y Shiota, 2003). Aunque las consecuencias funcionales de estas

interacciones aún no se conocen (Chahrour y Zoghbi, 2007), evidencias recientes muestran que

ratones mutantes nulos para Mecp2 presentan una disminución en la expresión de gran cantidad

de genes a nivel hipotalámico, y además, que la sobreexpresión de MECP2 genera el efecto

contrario, incrementando la expresión de estos genes, sugiriendo que MECP2 también podría

participar como un activador transcripcional. En esta misma línea, sólo existe un estudio en el

cual ha sido demostrado que MECP2 co-inmunoprecipita con CREB-1, y que ambos se unen al

promotor del gen que codifica para somatostatina activando su expresión (Chahrour et al., 2008).

Además de las funciones mencionadas, ha sido reportado que MECP2 participa en los procesos

de corte y empalme de los ARN, ya sea a través de una interacción directa con las moléculas de

ARN o mediante un complejo proteína-ARN (Jeffery y Nakielny, 2004; Young et al., 2005),

sugiriendo que MECP2 además juega un rol importante en el mecanismo que regula el

procesamiento post transcripcional de los ARN.

En resumen, todas estas evidencias muestran que MECP2 es una proteína multifuncional

capaz de actuar como un factor remodelador de la estructura de la cromatina, y como un

regulador de la transcripción y del procesamiento de los ARN (Adkins y Georgel, 2011; Hite et

al., 2009).

7

2.2. Síndrome de Rett

Mutaciones en el gen que codifica para MECP2 son la principal causa del síndrome de

Rett (RTT), un desorden del neurodesarrollo asociado a retardo mental y desarrollo de

características autistas principalmente en mujeres (Amir et al., 1999; Hagberg et al., 1983; Rett,

1966). Las pacientes con RTT presentan un desarrollo aparentemente normal durante los

primeros 6-18 meses de edad, pudiendo aprender a caminar e incluso decir algunas palabras.

Luego, entran en una etapa de cese del neurodesarrollo, caracterizada por la interrupción en la

adquisición de nuevas habilidades, llegando finalmente a una fase de regresión, en la cual se

pierden las habilidades adquiridas previamente. El más temprano indicador de compromiso

neurológico es la desaceleración en el crecimiento de la cabeza y microcefalia aproximadamente

a los 2 años de vida. Esta interrupción en el desarrollo continúa con retardo general del

crecimiento, pérdida de peso e hipotonía muscular. Otras complicaciones características que

presentan estas pacientes son problemas de interacción social (características autistas), trastornos

de ansiedad, anormalidades cardiacas y respiratorias, graves problemas motores y de aprendizaje,

desarrollo de movimientos estereotipados en las manos y pérdida del lenguaje, entre otros

(Chahrour y Zoghbi, 2007). En la Figura 2, se muestra un esquema de la progresión de la

enfermedad a lo largo de los años y el fenotipo asociado a cada etapa.

8

Figura 2. Conjunto y progresión de características clínicas en pacientes con RTT. Esquema

simplificado donde se indican los principales eventos que caracterizan el desarrollo de la

enfermedad a lo largo de los años. Luego de un aparente desarrollo normal, se observa un

estancamiento del neurodesarrollo, después comienzan a aparecer progresivamente distintas

alteraciones que llevan a un deterioro neurológico y motor gradual, dependiendo de la severidad

con la que se presente la enfermedad. (Modificado de Chahrour y Zoghbi, 2007).

9

El síndrome de Rett tiene una incidencia en la población de alrededor de 1:10.000 mujeres

nacidas vivas, y más del 95% de los casos clásicos de RTT son producidos por mutaciones en

MECP2. La severidad con que se puede presentar este síndrome depende del tipo de mutación

presente en la paciente, existiendo variantes atípicas de la enfermedad donde la aparición de los

síntomas resulta ser más tardía (Zapella et al., 2001). En base a este punto, ha sido reportado que

mutaciones que afectan las señales de localización nuclear causan un fenotipo mucho más severo

de la enfermedad, mientras que deleciones que afectan el extremo C-terminal de la proteína

generan manifestaciones más suaves y atenuadas de RTT (Smeets et al., 2005).

La variabilidad fenotípica observada entre las pacientes puede ser explicada, en parte, por

las diferentes mutaciones que pueden afectar al gen que codifica para MECP2, y por otra, debido

al patrón de inactivación del cromosoma X (XCI). En mujeres, sólo uno de los dos cromosomas

X se encuentra activo en cada célula, y la determinación de este es aparentemente un proceso

azaroso. Por lo tanto, una mujer que presenta una mutación en MECP2 tendrá mosaicismo,

debido a que algunas de sus células expresarán el alelo silvestre y otras el alelo mutado (Bourdon

et al., 2001). En pacientes hombres, la mayoría de las mutaciones son letales por ser hemicigotos

para la mutación. Sin embargo, evidencias recientes muestran que existe un fenotipo heterogéneo,

que va desde retardo mental hasta la muerte prematura del neonato debido a encefalopatía

congénita severa (Bienvenu y Chelly, 2006). En estos casos, la heterogeneidad fenotípica

observada, así como la severidad de la enfermedad, puede ser explicada a través de la existencia

de mosaicismo somático, o bien debido a la presencia de otros síndromes, como ha sido

observado en casos de pacientes con XXY (Síndrome de Klinefelter) y que a la vez presentan

mutaciones en MECP2. Además, existe un grupo importante de pacientes hombres que presentan

mutaciones puntuales en el gen que codifica para MECP2 que no ha sido reportadas en mujeres, y

10

que recapitulan algunas de las características clínicas clásicas de RTT, generando

manifestaciones de la enfermedad menos severas y que son compatibles con la vida dado que la

función de la proteína no es afectada mayormente. Sin embargo, es importante mencionar que la

mayoría de las mutaciones en MECP2 observadas en hombres son asociadas a retardo mental

más que a la generación de RTT propiamente tal (Villard, 2007).

Uno de los más intrigantes descubrimientos en cuanto a la relación de RTT con MECP2,

es el hecho de que un aumento en la dosis de MECP2 resulta en un desorden neurológico

clínicamente similar. La duplicación de Xq28 (locus donde se encuentra MECP2) también

conocida como síndrome de duplicación de MECP2, ha sido reportada en pacientes hombres con

fenotipos neurológicos similares a RTT, incluyendo retardo mental, desaceleración en el

crecimiento de la cabeza, movimientos estereotipados de las manos y muerte prematura (Friez et

al., 2006; Meins et al., 2005; Van Esch et al., 2005). Además, ratones transgénicos que expresan

el doble de la dosis normal de MECP2, desarrollan un fenotipo neurológico similar al observado

en pacientes con RTT (Collins et al., 2004), indicando que tanto la pérdida de función como un

aumento de la dosis de la proteína genera alteraciones asociadas a RTT (Chahrour y Zoghbi.,

2007).

11

2.3. Modelos murinos de Síndrome de Rett

En la actualidad, varios modelos murinos portadores de diferentes mutaciones en el gen

que codifica para Mecp2 han sido generados para el estudio del RTT. En el año 2001, dos grupos

independientes liderados por A. Bird y R. Jaenisch generaron ratones mutantes nulos (KO) para

Mecp2 mediante la utilización del sistema de recombinación Cre-LoxP (Sauer, 1998; Sauer,

2002; Smedley et al., 2011). Estos animales presentan una deleción del exón 3 (Chen et al.,

2001), o bien, de los exones 3 y 4 (Guy et al., 2001), que son los que codifican para los dominios

funcionales y la mayor parte de la proteína. En ambos modelos se observó signos característicos

de la enfermedad, comenzando con un periodo de desarrollo normal hasta las 3-6 semanas de

edad, seguido por problemas de hipoactividad, coordinación motora, temblores, entre otros, para

finalmente mostrar una disfunción neurológica severa y progresiva, con la consiguiente muerte de

los animales alrededor de las 8-10 semanas de edad. Si bien esta caracterización fue realizada en

ratones machos, hembras heterocigotas para la mutación también presentaron anormalidades en

el comportamiento asociadas a RTT, solo que de inicio más tardío (Chahrour y Zoghbi, 2007).

Además de los animales mutantes nulos, existe un modelo en el cual se introdujo un

codón de término prematuro en la secuencia codificante para Mecp2, generando una proteína

truncada en el aminoácido 308 (Mecp2308/y

), que por lo tanto carece del extremo C-terminal pero

conserva los dominios funcionales MBD, TRD y NLS (Shahbazian et al., 2002b). Estos ratones

se desarrollan normalmente hasta las 6 semanas de edad y muestran un deterioro neurológico

progresivo con características similares a las observadas a las pacientes con RTT.

12

Por otra parte, ha sido desarrollado un modelo en el cual se sobreexpresa la isoforma

humana de MECP2. Este ratón presenta características fenotípicas más severas pero de inicio más

tardío, apareciendo alrededor de las 10 semanas de edad (Collins et al., 2004).

Todos los modelos de la enfermedad generados a la fecha, así como las investigaciones

desarrolladas a partir de ellos, han recapitulado las características típicas observadas en pacientes

con RTT, demostrando ser herramientas experimentales muy útiles para el estudio de la

enfermedad. Además, han permitido avanzar en el entendimiento de las bases celulares y

moleculares del RTT, que sin duda apoyan la idea de que la presencia de Mecp2, principalmente

en la etapa post natal, es crítica y determinante para un adecuado desarrollo y una correcta

función neuronal (Bienvenu y Chelly, 2006; Calfa et al., 2011; Chahrour y Zoghbi, 2007).

Por otro lado, tanto las pacientes con RTT como los modelos murinos de esta enfermedad

desarrollan alteraciones asociadas a la homeostasis energética. Por ejemplo, ratones KO para

Mecp2 presentan una alteración del peso corporal, ya sea un aumento o disminución dependiendo

del background genético de los animales (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001; Pelka et al., 2006).

En esta misma línea, ratones KO condicionales que carecen de Mecp2 exclusivamente en

neuronas del núcleo paraventricular del hipotálamo desarrollan obesidad (Fyffe et al., 2008),

mientras que ratones hipomorfos para Mecp2 también exhiben un fenotipo de sobrepeso (Kerr et

al., 2008). Si bien la mayoría de las pacientes con RTT clásico presentan bajo peso corporal, las

pacientes portadoras de mutaciones que generan un fenotipo no invalidante, que les permite

mantener su autonomía pudiendo alimentarse por sí solas, desarrollan obesidad (Zapella et al.,

2001). En conjunto, todas las evidencias presentadas en relación a alteraciones en el control del

peso corporal, ya sea en pacientes o modelos murinos de RTT, sugieren un importante rol de

13

MECP2 en la regulación del balance energético corporal, como uno de los factores claves que

podría estar involucrado en la modulación de este proceso frente a cambios ambientales.

2.4. Balance energético corporal

La regulación de la homeostasis energética corporal se encuentra determinada por dos

procesos fisiológicos fundamentales: la ingesta de comida y el gasto energético. El balance

correcto entre estos dos parámetros es lo que finalmente lleva a un adecuado control del peso

corporal (Morton et al., 2006; Schwartz et al., 2000).

El principal circuito que regula la homeostasis energética a nivel cerebral es conocido

como sistema de las melanocortinas (Gantz y Fong, 2003; Garfield et al., 2009). Este circuito

neuronal parte en el núcleo arcuato del hipotálamo (ARC), donde existen dos poblaciones

neuronales, las neuronas que expresan proopiomelanocortina (POMC) y el transcrito relacionado

con cocaína y anfetamina (CART), y las neuronas que expresan el péptido relacionado con

Agouti (AgRP) y neuropéptido Y (NPY), cuya actividad genera un efecto antagónico sobre el

balance energético (Wynne et al., 2005). La activación de las neuronas POMC induce la

expresión del precursor proopiomelanocortina, el cual es post-traduccionalmente procesado a α-

MSH y -endorfina, para ser liberados en los terminales axónicos de estas neuronas en el núcleo

paraventricular del hipotálamo (PVN) (Bicknell, 2008; Zhou et al., 1993). Las neuronas POMC

proyectan al PVN donde contactan neuronas de segundo orden que expresan los receptores para

melanocortinas (MC4R y MC3R), siendo el MC4R el principal receptor involucrado en la

regulación del peso corporal (Coll y Loraine Tung, 2009). La activación de los receptores de

melanocortina a través de α-MSH induce una disminución en la ingesta de comida y un aumento

en el gasto energético. Este circuito neuroanatómico se denomina via anorexigénica.

14

En paralelo a la vía anorexigénica, existe la vía orexigénica compuesta por las neuronas

AgRP, las cuales también se ubican en el núcleo arcuato del hipotálamo y expresan y liberan la

hormona AgRP desde sus terminales axónicos en el PVN, la cual es un antagonista de los

receptores MC4R, disminuyendo la actividad del receptor por un mecanismo independiente de la

unión de α-MSH, y gatillando un aumento de la ingesta de comida y una disminución del gasto

energético (Nijenhuis et al., 2001; Tolle y Low, 2008).

Dentro de los efectores que llevan a la activación de las neuronas POMC hipotalámicas,

se encuentran señales producidas a nivel periférico como la insulina, glucosa y leptina, siendo los

efectos de esta última hormona los más conocidos por afectar y regular la expresión de POMC

(Belgardt et al., 2007). La leptina es una hormona peptídica producida principalmente por el

tejido adiposo blanco (white adipose tissue, WAT), y en menor cantidad por la glándula pituitaria

(Crane et al., 2007). La expresión y posterior liberación de leptina es proporcional a la cantidad

de tejido graso existente. Las neuronas POMC expresan la isoforma larga del receptor de leptina

(LepR2), el cual a través de una cascada de transducción de señales activa la vía JAK2-STAT3 e

induce un aumento en la expresión de POMC a nivel hipotalámico. Esta preprohormona es

procesada a α-MSH, y liberada en el PVN, desencadenando una disminución de la ingesta de

comida y un aumento en el gasto energético. Por otra parte, la leptina es capaz de inhibir a las

neuronas AgRP/NPY y por ende el tono orexigénico, lo que impacta aún más sobre el efecto

anorexigénico mediado por esta hormona (Cowley et al., 2001; Sahu, 2011; Varela y Horvath,

2012).

Hasta hace algunos años, se creía que la regulación de la ingesta de comida y el gasto

energético estaba mediada por un mismo mecanismo paralelo dependiente del receptor de

15

melanocortina 4 (MC4R), lo que permitió plantear la idea que una disminución en la ingesta de

comida necesariamente inducía un aumento del gasto energético con el objetivo de mantener el

correcto equilibrio en el balance energético corporal. Sin embargo, estudios de re-expresión

condicional del receptor en un modelo murino mutante nulo para Mc4R, específicamente a nivel

del PVN y amígdala, mostraron que si bien la re-expresión del receptor era capaz de rescatar el

fenotipo de obesidad a través de la disminución de la ingesta de comida, fallaba en desencadenar

un aumento en el gasto energético, lo que llevó a proponer que existe una divergencia en la vía de

las melanocortinas, que lleva finalmente a regular de manera diferencial la ingesta de comida y el

gasto energético (Balthasar et al., 2005).

En lo que respecta al gasto energético, el tejido adiposo pardo (BAT, brown adipose

tissue) es uno de los principales determinantes de la termogénesis adaptativa en mamíferos

pequeños y en recién nacidos. Su función fisiológica es el mantenimiento de la temperatura

corporal, por lo que está directamente relacionado con el gasto energético, siendo uno de los

principales tejidos involucrados en su regulación. El BAT se encuentra ubicado principalmente

en la cavidad interescapular. Este tejido graso expresa el receptor adrenérgico β3 (AdrRβ3) y es

inervado por el sistema nervioso simpático. La liberación de catecolaminas y activación de

AdrRβ3 aumentan la expresión de la proteína desacoplante 1 (UCP-1, uncoupling protein 1), la

que forma un poro en la membrana mitocondrial interna a través del cual se movilizan protones a

favor de gradiente, lo que se traduce en generación de calor y reducción de la síntesis de ATP, y

por lo tanto, en un aumento del gasto energético (Cannon y Nedergaard, 2004).

16

2.5. Planteamiento del problema, propuesta de trabajo

Estudios previos acerca del Síndrome de Rett y su relación con MECP2 han mostrado que

los pacientes y los modelos murinos de la enfermedad presentan una alteración en los

mecanismos que regulan el balance energético, principalmente asociada al control del peso

corporal. En esta misma línea, ha sido reportado que ratones hipomorfos para Mecp2 desarrollan

sobrepeso en comparación a sus respectivos controles (Kerr et al., 2008). Además, se ha

demostrado que ratones mutantes nulos para Mecp2 presentan una alteración en el control del

peso corporal (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001; Pelka et al., 2006), y que la deleción

condicional de Mecp2 en neuronas del PVN expresando Sim1 induce un incremento en el peso

corporal (Fyffe et al., 2008), sugiriendo un importante rol de Mecp2 en la regulación del balance

energético corporal. Sin embargo, el mecanismo molecular y fisiológico que lleva a esta

regulación defectuosa del peso corporal producto de la ausencia total o parcial de Mecp2 no ha

sido dilucidado a la fecha.

2.6. Hipótesis del trabajo

En base a los antecedentes antes mencionados, se planteó la siguiente hipótesis:

“El aumento del peso corporal exhibido por ratones mutantes nulos para Mecp2 está asociado a

un desbalance en el patrón de expresión de genes asociados al control del peso corporal.”.

17

Para contrastar la hipótesis propuesta, se plantearon los siguientes objetivos:

2.7. Objetivo general

Analizar el efecto de la deleción de Mecp2 en el mecanismo central y periférico que

regula el balance energético corporal.

2.8. Objetivos específicos

a) Evaluar el fenotipo de sobrepeso corporal en los ratones KO para Mecp2, y determinar si

este es producto de una mayor ingesta de comida.

b) Determinar si existe un desbalance en la expresión de genes asociados al control del

balance energético en hipotálamo, iBAT e iWAT de ratones KO para Mecp2.

c) Determinar la expresión de Mecp2 en tejido adiposo (iBAT e iWAT).

18

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIALES

3.1.1. Reactivos y kits utilizados

Gene Ruler 100 pb DNA ladder (Fermentas), Gene Ruler 1 Kb DNA ladder (Fermentas),

Taq DNA polimerasa (elaboración casera), dNTPs (Promega), 5X Green Go Taq Reaction Buffer

(Promega), Proteinase K (Bioline), Agarosa grado analítico (Lafken), 6X DNA Loading Dye

(Fermentas), Etanol (Merck), Tris-HCl (Sigma), Tris-Base (Sigma), SDS (Sigma), EDTA

(Sigma), NaCl (Winkler), MgCl2 25 mM (Promega), Bromuro de Etidio (Sigma), Trizol

(Invitrogen), Cloroformo (Merck), Glyco BlueTM

(Ambion, Inc), Isopropanol (Merck), Agua libre

de Nucleasas (Ambion, Inc), Turbo DNA-freeTM

Kit (Ambion, Inc), Improm-IITM

Reverse

Transcription System (Promega), Random Primers (Promega), KAPA SYBR®

FAST Universal

2X qPCR Master Mix (Kapabiosystems), Leptin Mouse Recombinant E. coli (Calbiochem),

Cloruro de guanidina (Sigma), β-mercaptoetanol (Winkler), Coctel Inhibidor de Proteasas

(Calbiochem), Inhibidor de Fosfatasas NaF y NaVO3 (Sigma), Azul de Bromofenol (Sigma),

Glicerol (Merck), Precision Plus Protein dual color Estándar (BioRad), Inmuno-Blot PVDF

membrane (BioRad), Acrylamide/ bis Acrylamide 30% (BioRad), TEMED (BioRad), Persulfato

de Amonio (Sigma), Coomasie Brilliant Blue G-250 (BioRad), Tween 20 (Sigma), Super Signal

West Femto Maximum Sensitivity (Pierce), Kodak Processing Chemicals for Autoradiography

Film, Developer (Sigma), Film Clear Blue X-Ray Film (Thermo Scientific), Kodak GBX*Fixer

(Sigma).

19

3.1.2. Partidores

Partidores diseñados para la genotipificación de los animales:

1.- Mecp2 WT (sentido) 5` CCACCCTCCAGTTTGGTTTA 3`

Mecp2 WT (antisentido) 5` GACCCCTTGGGACTGAAGTT 3`

Mecp2 KO (antisentido) 5` CCATGCGATAAGCTTGATGA 3`

Partidores diseñados para PCR en tiempo real:

2.- Pomc (sentido) 5` AAGAGCAGTGACTAAGAGAGGCCA 3`

Pomc (antisentido) 5` TGCAGAGGCAAACAAGATTGGAGG 3`

3.- Agrp (sentido) 5` CTGTGTAAGGCTGCACGAGT 3`

Agrp (antisentido) 5` AGCTTGCGGCAGTAGCAAAA 3`

4.- LepR2 (sentido) 5` TGGGGACGTTACTAAAAAGGAGAG 3`

LepR2 (antisentido) 5` CGCCGAGGGAATTGACAGCCAGAA 3`

5.- InsR (sentido) 5` TGGCCTGTCGCAACTTCTAT 3`

InsR (antisentido) 5` AGACATGGGGTGCACATCAA 3`

6.- Mc4R (sentido) 5` AGCTCCTTGCTCGCATCCATTT 3`

Mc4R (antisentido) 5` AGTGCAAGCTGCCCAGATACAA 3`

Tm = 62ºC

Tm = 61ºC

Tm = 58ºC

Tm = 58ºC

Tm = 61ºC

Tm = 61ºC

20

7.- Leptina (sentido) 5` AAAATGTGCTGGAGACCCCTGTGT 3`

Leptina (antisentido) 5` GTGACCCTCTGCTTGGCGGATAC 3`

8.- β3AdR (sentido) 5` GCTATGCCAACTCCGCCTTCAACC 3`

β3AdR (antisentido) 5` GACGCGCACCTTCATAGCCATCAA 3`

9.- Ucp1 (sentido) 5` CGCTACACGGGGACCTACAATG 3`

Ucp1 (antisentido) 5` GCAAAACCCGGCAACAAGAGC 3`

10.- Ucp2 (sentido) 5` TCTGTCTCGTCTTGCCGATTG 3`

Ucp2 (antisentido) 5` GTGGCCTTGAAACCAACCATGA 3`

11.- Ucp3 (sentido) 5’ TGGCCCAACATCACAAGAAAT 3`

Ucp3 (antisentido) 5` CACCGGGGAGGCCACCACTG 3`

12.- Cyc (sentido) 5` GGCAATGCTGGACCAAACACAA 3`

Cyc (antisentido) 5` GTAAAATGCCCGCAAGTCAAAAG 3`

* (La temperatura para Ciclofilina (Cyc) varió dependiendo el ARNm amplificado)

Partidores diseñados para detección de Mecp2 en Tejido Adiposo:

14.- Mecp2 (sentido) 5` CTCCATAAAAATACAGACTCACCA 3`

Mecp2 (antisentido) 5` CTTAAACTTCAGTGGCTTGTCT 3`

Tm = 61ºC

Tm = 61ºC

Tm = 58ºC

*

Tm = 58ºC

Tm = 61ºC

Tm = 58ºC

21

3.1.3. Animales de experimentación

Todos los procedimientos con animales de experimentación fueron realizados de acuerdo

al reglamento del Comité de Cuidado y Uso de Animales de Experimentación del Centro de

Estudios Científicos (CECs). En este estudio, se utilizaron animales silvestres para Mecp2 (WT) y

animales mutantes nulos para esta proteína (KO), ambos en un background genético mixto

129/B6, predominantemente 129S1/Sv1mJ. Es importante mencionar que el modelo murino de

RTT utilizado corresponde al generado y caracterizado por el grupo de Adrian Bird en el año

2001 (Guy et al., 2001). Todos los ratones fueron mantenidos en racks ventilados en el área SPF

(Specific Pathogen Free) del bioterio del CECs, a temperatura ambiente promedio de 21ºC, con

ciclos diarios de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y con comida y agua ad libitum. Los

animales KO fueron generados a partir del cruzamiento de hembras heterocigotas para Mecp2

(Mecp2+/-

) y machos WT. De este cruzamiento, se obtuvieron tanto ratones KO para Mecp2 como

crías silvestres. Estas últimas fueron utilizadas como control. El destete de las crías se realizó

aproximadamente a las 3 semanas de edad, y estas fueron mantenidas en las mismas condiciones

descritas anteriormente. Los genotipos de todos los animales utilizados en este estudio fueron

determinados mediante PCR. De todas las crías obtenidas en este estudio, sólo machos fueron

utilizados, debido a la gran variabilidad fenotípica presente en las hembras producto de la

inactivación al azar del cromosoma X.

22

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Aislamiento de ADN genómico para genotipificación

La obtención del ADN genómico se hizo a partir de biopsias de cola de los ratones a las 2

semanas de edad. El tejido se incubó con 500 µL de buffer TEL (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, EDTA

50 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, SDS 0,5%) y 10 µL de proteinasa K (10 mg/mL) durante 12 horas

a 55ºC con agitación constante para la disgregación completa del tejido. Luego, el

homogeneizado se centrifugó por 10 minutos a 12.000 rpm para eliminar restos de tejido, se

separó el sobrenadante y el ADN genómico se precipitó con etanol 100% centrifugando

nuevamente en las mismas condiciones. El precipitado se lavó con etanol 70%, se centrifugó

nuevamente a 12.000 rpm por 10 minutos, y el pellet se dejó secar a temperatura ambiente.

Finalmente, el ADN purificado se resuspendió en buffer TE (Tris-Hcl 100 mM pH 8,0, EDTA 1

mM pH 8,0), se agitó a 50ºC por 2 horas con agitación constante y se almacenó a 4ºC hasta su

utilización.

3.2.2. Genotipificación de animales mediante PCR

La determinación de los genotipos de los animales utilizados en este estudio fue realizada

mediante PCR convencional, usando partidores específicos para la secuencia a amplificar. Para

ello, se utilizaron 3 partidores, los cuales permitieron la identificación tanto de los animales WT

como KO en una misma reacción de amplificación. Las secuencias de los partidores diseñados

aparecen detalladas en la sección Materiales y Métodos. Para los animales WT se obtuvo una

banda de 411 pb, mientras que para los animales KO el tamaño del amplicón fue 440 pb. La

detección simultánea fue posible debido a que si bien el partidor sentido reconoce tanto la

secuencia WT como la KO (alinea en el intrón 2), los partidores antisentido diseñados para el

23

alelo WT y KO alinean y amplifican exclusivamente su respectiva secuencia, producto del

tiempo de extensión utilizado y del tamaño de la región a amplificar. En la Figura 3 se muestra un

esquema simplificado de la estrategia de detección del alelo WT y KO.

La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 µL conteniendo 0,5 µL de

templado, dNTPs 0,2 mM c/u, MgCl2 0,5 mM, partidores 0,5 µM c/u y Taq DNA polimerasa.

Las muestras fueron amplificadas en un termociclador (PTC-200, MJ Research) utilizando el

siguiente programa: denaturación inicial del ADN a 95ºC por 4 minutos y 30 segundos, seguido

de 32 ciclos de denaturación a 95ºC por 30 segundos, alineamiento de partidores a 62ºC por 30

segundos y etapa de extensión a 72ºC por 30 segundos. Terminados los ciclos, se incluyó una

etapa de extensión final por 5 minutos a 72ºC. Luego, los productos de PCR fueron cargados en

gel de agarosa al 1,5 % en buffer TAE 1X (Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0)

conteniendo bromuro de etidio, y separados electroforéticamente a 85 V por 1 hora. Para la

visualización del tamaño de los amplicones, se utilizó un transiluminador UV (Gel Doc-it

Imaging System).

24

Figura 3. Esquema de alineamiento de partidores para la reacción de genotipificación. El

animal mutante nulo para Mecp2 carece del exón 3 y la secuencia codificante del exón 4. La

flecha azul corresponde al partidor sentido que alínea con Mecp2 tanto en animales silvestres y

mutantes. La flecha verde corresponde al partidor antisentido que alínea sólo con la secuencia

silvestre, y la flecha naranja corresponde al partidor antisentido que alínea tanto con la secuencia

silvestre como con la mutante, pero que sólo amplifica la secuencia mutante debido al tiempo de

extensión utilizado en el programa de amplificación diseñado. El tamaño del amplicón para el

alelo silvestre es 411 pb, mientras que para el alelo mutante es de 440 pb.

25

3.2.3. Registro de peso corporal

Para la construcción de la curva de peso corporal, los animales WT y KO para Mecp2

fueron pesados semanalmente, iniciando el registro entre las 3 y 4 semanas de edad. La

determinación se llevó a cabo en el área SPF del bioterio del Centro de Estudios Científicos,

utilizando una balanza convencional para llevar a cabo las mediciones y manteniendo las

condiciones de vida normales de los ratones. Los datos obtenidos son presentados como el

promedio de las mediciones ± Error Estándar (EE) y fueron analizados estadísticamente

utilizando análisis de varianza de dos vías (ANOVA) y posterior ajuste de Bonferroni para

determinar diferencias específicas.

3.2.4. Determinación de la ingesta de comida

El consumo de alimento de los animales en las distintas semanas de edad se determinó

mediante el uso de una jaula metabólica (Ugo Basile, Italia), de acuerdo a las instrucciones del

proveedor. Antes de realizar las mediciones, los ratones fueron alimentados normalmente (ad

libitum) toda la noche, y luego colocados en las jaulas metabólicas sin comida durante las horas

de luz. Luego de este periodo, las jaulas fueron cargadas con alimento y agua (previamente

pesado como control interno) y se analizó la ingesta de comida durante las 12 horas del ciclo de

oscuridad utilizando el software Feed – Drink Monitoring System 1.3 (Ugo Basile), siguiendo las

indicaciones de la manufactura. Terminado el registro, los animales fueron cambiados a su jaula

original. Los datos registrados son presentados como el promedio de las mediciones normalizadas

± EE, y fueron comparados estadísticamente utilizando ANOVA de dos vías.

Para la determinación del consumo de alimento en respuesta a leptina, animales de 6

semanas de edad fueron sometidos al mismo protocolo de habituación del entorno mencionado

26

anteriormente. Luego, se administró leptina a una concentración de 6 mg/kg ó solución salina vía

intraperitoneal, y se mantuvo a los animales en un periodo ventana de algunos minutos con el fin

de que la hormona sea incorporada eficazmente. Finalmente, se cargó la comida en las jaulas, y el

consumo de alimento fue analizado durante las primeras 4 horas del ciclo de oscuridad. Una

semana después, los mismos animales recibieron el tratamiento inverso (ya sea control o leptina),

siendo así cada animal control de sí mismo. Los datos registrados fueron analizados

estadísticamente utilizando t-test pareado.

3.2.5. Método de eutanasia y extracción de tejidos

Los animales WT y KO para Mecp2 utilizados para extracción de tejidos y análisis

posteriores fueron sacrificados a las 8 semanas de edad por la técnica de dislocación cervical.

Previo al sacrificio, los animales fueron mantenidos en ayuno durante 16 horas con el fin de

estandarizar la expresión de los genes de interés en forma independiente al nivel de alimento

ingerido. La extracción de tejidos (Htl, iBAT e iWAT) se llevó a cabo mediante disección

utilizando pinzas quirúrgicas previamente esterilizadas. Una vez que los tejidos fueron retirados

del animal, fueron pesados y se les agregó inmediatamente trizol, manteniéndolos en hielo

durante todo el proceso, para la posterior extracción de ARN y proteínas.

3.2.6. Extracción de ARN total de hipotálamo y tejido adiposo

Como se mencionó anteriormente, los animales fueron mantenidos en ayuna durante 16

horas previo a ser utilizados y realizar la extracción de los tejidos de interés. El ARN total de

hipotálamo, iBAT e iWAT fue extraído con trizol de acuerdo al método indicado por el

fabricante. Brevemente, el tejido fue homogeneizado en trizol hasta su total disgregación, se

centrifugó, y el sobrenadante fue recolectado. Luego, se agregó cloroformo y la fase acuosa

27

conteniendo el ARN fue separada (la fase orgánica fue almacenada a -20ºC para la posterior

extracción de proteínas). El ARN fue precipitado con isopropanol frío toda la noche y el

precipitado se lavó con etanol frío 75%. Posteriormente, se dejó secar a temperatura ambiente por

algunos minutos y se resuspendió en agua libre de nucleasas. Para eliminar posibles restos de

ADN genómico remanente de la separación, el ARN fue tratado con DNAasa I por 30 minutos a

37ºC. Finalmente, el ARN fue cuantificado por medición de su absorbancia a 260 nm y se

almacenó a -80ºC hasta su utilización.

3.2.7. Síntesis de ADNc mediante RT-PCR (Transcripción reversa)

La retrotranscripción se llevó a cabo conteniendo 2 o 5 ug de ARN total previamente

purificado y cuantificado, utilizando el kit ImProm-IITM

Reverse Transcription System de acuerdo

a las indicaciones de la manufactura. En todas las reacciones se usó random primers y la mezcla

de reacción se incubó por 90 minutos a 45ºC. Finalmente, el ADNc total fue almacenado a -20ºC

hasta su utilización. Una vez finalizada la retrotranscripción, cada una de las muestras fue

amplificada por PCR convencional utilizando partidores específicos para ciclofilina I como

control de la reacción (secuencia en sección Materiales y Métodos), mediante el mismo protocolo

usado para la genotipificación de los animales.

3.2.8. PCR en Tiempo Real

A partir del ADNc obtenido de los animales WT y KO para Mecp2, se preparó un pool

conteniendo una pequeña alícuota de cada una de las muestras. A partir del pool, se preparó una

serie de diluciones del ADNc en agua libre de nucleasas, con el fin de poder determinar la

dilución óptima de templado a utilizar. Todas las reacciones de amplificación fueron preparadas

utilizando el kit KAPA SYBR®

FAST Universal 2X qPCR Master Mix de acuerdo a lo indicado

28

por el fabricante, y fueron realizadas en triplicado llevando 1 µL de ADNc diluido en un volumen

final de 10 µL. A partir de las diluciones, se generó además una curva estándar para la posterior

cuantificación, incluyendo los siguientes puntos: pool sin diluir, dilución 1:5, dilución 1:10,

dilución 1:50, y muestra control sin templado. La curva estándar se hizo para cada uno de los

genes analizados, y todos los valores obtenidos fueron normalizados en relación a los niveles de

ciclofilina I. Los ARNm analizados, los partidores utilizados y sus temperaturas de alineamiento

aparecen detallados en la sección Materiales y Métodos. Es importante mencionar, que previo a

la amplificación por PCR en tiempo real, la especificidad de los partidores diseñados para cada

gen de interés fue analizada por PCR convencional a partir del ADNc de los tejidos

correspondientes, en base al tamaño del amplicón obtenido. Todas las reacciones fueron

realizadas en un termociclador Rotor-Gene 6200 (Corbett, Australia), y el programa de

amplificación utilizado fue el siguiente: denaturación inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido por

40 ciclos de 95ºC por 15 segundos, 58 o 61ºC por 20 segundos (dependiendo el transcrito

analizado, ver 3.1.2.) y 72ºC por 20 segundos. Finalmente, todos los resultados fueron analizados

utilizando el Rotor-Gene 6000 Series Software 1.7 (Corbett, Australia) y los niveles de expresión

cuantificados mediante el método del ∆∆Ct previamente reportado y ampliamente utilizado

(Livak y Schmittgen, 2001).

Para analizar cambios en los niveles de expresión génica en respuesta a leptina, los

animales fueron mantenidos en ayuna por 16 horas, inyectados intraperitonealmente con la

hormona a una concentración 6 mg/kg o con solución salina, y sacrificados por dislocación

cervical. El resto del procedimiento fue llevado a cabo de manera idéntica a lo mencionado

anteriormente.

29

3.2.9. Análisis de expresión de Mecp2 en tejido adiposo por PCR convencional

La expresión de Mecp2 en tejido adiposo se analizó preliminarmente por PCR

convencional, utilizando como templado muestras de ADNc sintetizado a partir de ARN de tejido

adiposo (iBAT e iWAT) de animales WT y KO para Mecp2. Se utilizaron muestras de ADNc de

3 animales WT y 3 animales KO para cada tejido, además de una muestra de ADNc de

hipotálamo de un animal silvestre como control positivo de expresión. De manera similar al PCR

de genotipificación, la reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen de 20 µl

conteniendo 1 µl de templado, dNTPs 0,2 µM, MgCl2 0,5 mM, partidores 0,5 µM c/u y Taq DNA

polimerasa. Las secuencias de los primers aparecen detalladas en la sección Materiales y

Métodos (3.1.2.). La reacción se llevó a cabo en un termociclador (PTC-200, MJ Research) y el

programa de amplificación fue el siguiente: denaturación inicial a 95ºC por 5 minutos, seguido de

32 ciclos incluyendo denaturación a 95ºC por 30 segundos, alineamiento de partidores a 58ºC por

30 segundos y extensión de la polimerasa a 72ºC por 1 minuto. Concluidos los ciclos, se incluyó

una etapa de extensión final por 10 minutos a 72ºC. Finalmente, la presencia de Mecp2 en tejido

adiposo se determinó analizando el tamaño del amplicón obtenido mediante electroforesis en gel

de agarosa.

3.2.10. Extracción de proteínas para Western blot

A partir de la fase orgánica almacenada desde la extracción de ARN con trizol, las

proteínas de iBAT e iWAT fueron extraídas de acuerdo a las indicaciones de la manufactura.

Brevemente, la fase orgánica conteniendo ADN genómico y proteínas fue tratada con 0,3 ml de

etanol 100%, y el ADN fue precipitado centrifugando las muestras a 2.000 x g por 5 minutos a

4ºC. A partir del sobrenadante obtenido, las proteínas fueron precipitadas con isopropanol y

30

centrifugadas a 12.000 x g por 10 minutos a 4ºC. Luego, el pellet proteico fue lavado 3 veces con

una solución conteniendo cloruro de guanidina 0,3 M en etanol 95%. Después del último lavado,

se agregó 2 ml de etanol 100%, se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó

a 7.500 x g por 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue descartado y el pellet proteico secado a

temperatura ambiente. Finalmente, las proteínas se resuspendieron en buffer Tris-HCl 0,125 M

pH 6,8 conteniendo SDS 1%, inhibidor de fosfatasas 1X (NaF y NaVO3) e inhibidor de proteasas

1X, y centrifugadas a 10.000 x g para sedimentar cualquier material insoluble.

3.2.11. Análisis de Western blot para Mecp2 en tejido adiposo

Las proteínas de iBAT e iWAT extraídas previamente fueron cargadas en SDS-PAGE

usando gel Separador al 10% y gel espaciador al 5%, preparados de acuerdo a las instrucciones

de la manufactura. Por carril se cargaron 50 µl de proteína conteniendo β-mercaptoetanol al 1%,

SDS 1 % y buffer de carga (Tris-HCl 0,187 M pH 6,8, SDS 9%, glicerol 15%, y azul de

bromofenol 0,1%), y fueron separadas electroforéticamente a 90 V por 3 horas, incluyendo un

estándar de peso molecular. Es importante mencionar que las proteínas no fueron cuantificadas.

Una vez finalizada la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF

por 2 horas a 330 mA en hielo. Posterior a la transferencia, la membrana fue bloqueada por 1

hora en solución de bloqueo (buffer TBS 1X, tween 20 0,05% y leche descremada al 5%). Luego

se incubó con anticuerpo primario conejo anti-Mecp2 (Upstate) en dilución 1:1000 en solución de

bloqueo por 2 horas a temperatura ambiente, o bien con conejo anti β-Tubulina (Santa Cruz) en

dilución 1:3000 bajo las mismas condiciones. Posteriormente, se lavó las membranas 4 veces por

10 minutos con solución de lavado (buffer TBS 1X, tween 20 0,05%), y fueron incubadas por 1

hora con el anticuerpo secundario cabra anti Conejo conjugado a peroxidasa (Pierce) 1:4000 en

31

solución de bloqueo. Para finalizar, se lavó nuevamente las membranas con solución de lavado y

se procedió a revelar utilizando el kit Super Signal West Femto Maximum Sensitivity, de acuerdo

a las indicaciones del proveedor.

3.2.12. Herramientas bioinformáticas y softwares utilizados.

Las secuencias nucleotídicas, ya sea genómicas o de los ARNm de interés analizados en

esta tesis fueron obtenidas desde la base de datos de National Center for Biotechnology

Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Los primers utilizados en este trabajo fueron diseñados y

evaluados utilizando el software Lasergene® (DNAstar) Los análisis de especificidad de los

primers fueron llevados a cabo utilizando la herramienta online BLAST (Basic Local Alignment

Search Tool), disponible en www.ncbi.nlm.nih.gov. En los experimentos de PCR en tiempo real,

todos los resultados fueron cuantificados y analizados utilizando el Rotor-Gene 6000 Series

Software 1.7 (Corbett, Australia). Los datos de ingesta de comida fueron registrados utilizando el

software Feed – Drink Monitoring System 1.3 (Ugo Basile, Italia). Todos los gráficos presentados

en esta tesis fueron diseñados con el software GraphPad Prism versión 6.01, mientras que los

análisis estadísticos fueron realizados con el software SigmaPlot versión 12.3.

3.2.13. Análisis estadísticos

Todos los resultados de esta tesis están presentados como el promedio de las mediciones ±

error estándar (EE). La curva de peso corporal fue analizada utilizando el test estadístico

ANOVA de dos vías y posterior ajuste de Bonferroni para el análisis de diferencias significativas.

Las determinaciones de ingesta de comida y cantidad de grasa corporal fueron analizadas

estadísticamente utilizando t-test o t-test pareado según sea el caso. Los experimentos de PCR en

32

tiempo real fueron analizados estadísticamente utilizando el test no paramétrico Mann-Whitney

Rank Sum Test para la determinación de diferencias significativas.

33

4. RESULTADOS

4.1. Obtención y genotipificación de ratones WT y KO para Mecp2.

Se generaron animales WT y KO para Mecp2 mediante el cruzamiento de hembras

heterocigotas (Mecp2+/-

) y machos WT (Mecp2+/y

). De los 4 posibles genotipos obtenidos de esta

cruza, en este estudio sólo se utilizaron los ratones machos, tanto WT como KO para Mecp2. Con

el objetivo de determinar el genotipo de los animales, se extrajo ADN genómico a partir de una

biopsia de cola y se amplificó por PCR utilizando partidores específicos para detectar el alelo WT

y KO para Mecp2. Si bien el partidor antisentido para el alelo mutante es complementario tanto a

la secuencia WT como KO, debido al programa de amplificación diseñado no amplifica la

secuencia WT debido a su tamaño, obteniéndose sólo la secuencia KO (véase sección Materiales

y Métodos). La determinación de los genotipos fue posible debido a la diferencia en el tamaño de

los amplicones obtenidos, siendo de 411 pb para el animal WT y 440 pb para el KO (Figura 4).

Una vez genotipificados, los animales siguieron siendo mantenidos en jaulas convencionales para

los análisis posteriores.

34

Figura 4. Detección de los alelos WT y KO para Mecp2 mediante PCR convencional. La

reacción de amplificación se realizó utilizando partidores diseñados específicamente para el alelo

silvestre y mutante nulo, y conteniendo ADN genómico como templado. Los productos de PCR

fueron separados electroforéticamente y visualizados en geles de agarosa al 2%, donde se obtuvo

una banda de 411 pb para los ratones WT y 440 pb para los ratones KO. (-): control sin templado;

(+) WT: control positivo WT; (+) KO: control positivo KO; Std: estándar de peso molecular (100

pb).

35

4.2. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en el peso corporal no

asociado a una mayor ingesta de comida.

De acuerdo a la literatura y resultados de nuestro laboratorio, existe amplia evidencia que

sugiere un importante rol de Mecp2 en la regulación del balance energético (Chen et al., 2001;

Fyffe et al., 2008; Guy et al., 2001; Kerr et al., 2008; Pelka et al., 2006). Como una primera

aproximación, para determinar si Mecp2 es requerido para regular el balance energético se

registró semanalmente el peso corporal de los animales WT y KO para Mecp2. Es importante

mencionar que aquellos animales KO que exhibieron un fenotipo neurológico prematuro y severo

(excesivo retardo en el crecimiento, problemas motores, etc.) fueron descartados y no se

consideraron en este estudio. Como se observa en la Figura 5, los ratones WT aumentaron de

peso significativamente hasta las 6 semanas de edad y no se observaron variaciones significativas

en las semanas posteriores, mientras que los ratones KO para Mecp2 mantuvieron el incremento

significativo del peso hasta las 8 semanas de edad. Al comparar ambas curvas, el análisis

estadístico mostró que existe una diferencia significativa en las curvas de crecimiento entre los

animales de ambos genotipos (p < 0,05). Esta diferencia se hizo evidente a las 8 y a las 9 semanas

de edad, donde los ratones KO para Mecp2 presentaron un incremento significativo del peso

corporal en relación a los WT.

36

Figura 5. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en el peso corporal en

relación a sus hermanos WT. El peso corporal de los ratones fue registrado desde las 4 semanas

de edad. El número de animales reclutados en cada semana fue variable para ambos genotipos,

oscilando entre los 5 y 42 ratones. Los resultados están expresados como el promedio de las

mediciones ± EE en cada semana. Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando

ANOVA de dos vías, p < 0,05, y un post-test de Bonferroni para determinar diferencias

individuales. +++ y ### p < 0,001 para curva de animales WT y KO, respectivamente; ++ y ## p

< 0,01 para curva de animales WT y KO, respectivamente; ** p < 0,01 y * p < 0,05 para la

comparación de los pesos de los ratones entre ambas curvas a las 8 y 9 semanas de vida,

respectivamente.

37

El aumento de peso observado en los ratones KO para Mecp2 sugiere una posible

alteración en la cantidad de alimento consumido por estos animales. Para determinar si el

aumento de peso corporal era debido a una mayor ingesta de comida, animales WT y KO para

Mecp2 de 5, 6 y 7 semanas de edad fueron mantenidos en ayuna durante las horas de luz, luego

colocados en jaulas metabólicas, y se analizó la ingesta de comida durante las 12 horas de

oscuridad. El análisis estadístico mostró que los animales KO para Mecp2 presentan una

disminución significativa en el consumo de alimento en comparación con sus hermanos WT

(Figura 6), la cual resultó ser independiente de la edad en la que se llevaron a cabo los registros

(p < 0,05). Estos resultados indican que el aumento del peso corporal en los ratones KO para

Mecp2 no es producto de una mayor ingesta de comida.

38

Figura 6. El aumento del peso corporal en los ratones KO para Mecp2 no es producto de

una mayor ingesta de comida. El consumo basal de alimento fue registrado a las 5, 6 y 7

semanas de edad mediante la utilización de jaulas metabólicas. Los datos presentados

corresponden a la ingesta de comida (% del control) de los animales a la edad señalada durante

las 12 horas de oscuridad. El número de ratones WT reclutados semana a semana fue variable,

siendo entre 6-9 animales, mientras que el número de ratones KO fue 9 animales. Los resultados

están expresados como el promedio semanal de las mediciones normalizadas ± EE. El análisis

estadístico mostró una disminución significativa de la ingesta de comida en los ratones KO para

Mecp2 independiente de la edad a la cual se realizó el registro, según test de ANOVA de dos vías

(p < 0,05).

39

4.3. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en la cantidad de tejido

adiposo en relación a sus hermanos WT.

Un parámetro importante que podría dar cuenta del aumento de peso observado en los

animales KO es la cantidad de grasa corporal. Para analizar si el sobrepeso de los ratones KO

para Mecp2 era producto de una acumulación excesiva de grasa, animales WT y KO fueron

sacrificados a las 8 semanas de edad, y el tejido adiposo pardo y blanco inguinal (iBAT e iWAT)

fue extraído y pesado. Como se observa en la Figura 7, los ratones KO para Mecp2 presentaron

un incremento cercano al 400% en la cantidad de tejido adiposo pardo y al 300% en la cantidad

de tejido adiposo blanco (p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente), sugiriendo que el fenotipo de

sobrepeso observado en los ratones KO para Mecp2 está asociado a una excesiva acumulación de

grasa corporal, posiblemente debida a una alteración en los mecanismos que controlan el

almacenamiento y/o metabolismo lipídico.

40

Figura 7. La cantidad de tejido adiposo blanco y pardo se encuentra incrementada en

ratones KO para Mecp2. El tejido adiposo blanco y pardo fue extraído de animales de 8

semanas de edad sacrificados por dislocación cervical y mantenidos en ayuna la noche previa. A.

Comparación del peso del tejido adiposo blanco inguinal (iWAT). B. Comparación del peso del

tejido adiposo pardo interescapular (iBAT). n WT = 5 y n KO = 7. Los valores están expresados

como el promedio de las mediciones normalizadas a los valores registrados en los WT y se

muestran como el promedio normalizado ± EE. ** p < 0,01 y *** p < 0,001, analizados por test

de T de Student.

41

4.4. Los niveles de expresión de leptina en tejido adiposo blanco se encuentran

incrementados en ratones KO para Mecp2.

El incremento en la cantidad de tejido adiposo observado en los ratones KO para Mecp2

sugiere además una mayor producción de leptina, una de las hormonas claves encargada de

regular el balance energético a nivel central. La leptina es producida principalmente por el tejido

adiposo blanco (Friedman y Halaas, 1998), el cual es capaz de responder al estado energético

corporal, secretando la hormona al torrente sanguíneo y llevando a una disminución en la ingesta

de comida a través de la activación de las neuronas POMC, y a un aumento del gasto energético,

en parte, debido a la respuesta del tejido adiposo pardo el cual incrementa la generación de calor.

Para determinar si el aumento en la cantidad de iWAT en los animales KO para Mecp2 se

correlacionaba con un incremento en la cantidad de leptina, evaluamos los niveles de expresión

de la hormona a través de PCR en tiempo real a partir de ADNc de iWAT de ratones WT y KO

para Mecp2 a las 8 semanas de edad. Como se muestra en la Figura 8, el tejido adiposo blanco de

los ratones KO mostró un incremento significativo de más de 10 veces en los niveles de leptina

en comparación con los ratones control (p < 0,01, según Rank Sum Test), indicando que los

ratones KO responden adecuadamente al incremento en la cantidad de iWAT, estimulando la

producción de la hormona.

42

Figura 8. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en los niveles de expresión

de leptina en relación a sus hermanos WT. El análisis se llevó a cabo mediante PCR en tiempo

real utilizando muestras de ADNc de iWAT inguinal de ratones WT y KO de 8 semanas de edad.

Los ratones fueron mantenidos en ayuno la noche anterior a su utilización. n WT y n KO = 7

animales. Los resultados fueron normalizados a los niveles de ciclofilina 1 por el método ΔΔCt y

se presentan como el promedio de las mediciones normalizadas ± EE. ** p < 0,01 analizado por

Mann-Whitney Rank Sum Test.

43

4.5. La expresión relativa de los principales genes que controlan el balance energético

corporal a nivel central se encuentra desregulada en ratones KO para Mecp2.

El fenotipo de sobrepeso exhibido por los animales KO para Mecp2 sugiere una alteración

en el mecanismo central que regula el balance energético corporal. Para poder determinar si el

aumento de peso es producto de un desbalance en la expresión de genes asociados a homeostasis

energética, llevamos a cabo experimentos de PCR en tiempo real a partir de ADNc de hipotálamo

medio basal de ratones de 8 semanas de edad, y evaluamos los niveles de expresión de genes

claves en la regulación del peso corporal a nivel central. El análisis de los principales

componentes involucrados en esta vía mostró que no existen diferencias significativas en la

expresión de Pomc entre animales WT y KO para Mecp2 (Figura 9A). Por otra parte, a pesar de

que no encontramos diferencias significativas, observamos que los ratones KO presentaron una

fuerte tendencia a la disminución en los niveles de expresión de Agrp en comparación a sus

hermanos WT (Figura 9B). Estos resultados sugieren que si bien las neuronas AgRP de los

ratones KO para Mecp2 responden al incremento en la cantidad de leptina disminuyendo la

expresión de Agrp, las neuronas POMC fallan en responder al aumento de la concentración de la

hormona, a pesar de la leve disminución observada en la ingesta de comida de estos animales.

44

Figura 9. Los ratones KO para Mecp2 presentan una alteración en la expresión de genes

claves para la regulación central del balance energético corporal. La expresión génica fue

analizada por PCR en tiempo real a partir de muestras de ADNc de Htl medio basal de ratones de

8 semanas de edad, mantenidos en ayuno la noche previa a su utilización. A. Expresión relativa

de Pomc. B. Expresión relativa de Agrp. n WT = 6 y n KO = 9. Los resultados obtenidos fueron

normalizados a los niveles de ciclofilina 1 por el método ΔΔCt y están expresados como el

promedio de las mediciones normalizadas ± EE. No se encontraron diferencias estadísticamente

significativas según Mann-Whitney Rank Sum Test.

45

Debido a que tanto las neuronas POMC como AgRP responden a señales periféricas y su

actividad es fuertemente estimulada por hormonas metabólicas como leptina e insulina, nos

propusimos determinar si es que existían diferencias en los niveles de expresión de los receptores

para estas hormonas a nivel hipotalámico entre ambos genotipos, como un parámetro que pudiera

explicar la alteración observada en la expresión de Pomc y Agrp en los ratones KO para Mecp2.

Para esto, evaluamos los niveles de expresión de los receptores de leptina, insulina y

melanocortinas (LepR2, InsR y Mc4R) mediante PCR en tiempo real utilizando ADNc de Htl

medio basal de ratones de 8 semanas de edad. Si bien el análisis estadístico no mostró diferencias

significativas, observamos que los niveles de expresión de los receptores de leptina e insulina

tienden fuertemente al aumento en los ratones KO para Mecp2. (Figuras 10A y 10B), sugiriendo

que la recepción de estas señales metabólicas (leptina e insulina) a nivel hipotalámico se

encuentra incrementada, acorde con la mayor cantidad de leptina que presentan estos animales.

Por otra parte, la expresión relativa del receptor de melanocortina-4 (Mc4R) no mostró variación

entre los animales WT y KO para Mecp2 (Figura 10C), sugiriendo que la activación de las

neuronas de segundo orden ubicadas en el PVN, al menos a través del sistema de las

melanocortinas vía este receptor, no se encuentra alterada.

46

Figura 10. Los niveles de expresión de los principales receptores involucrados en la

regulación de la homeostasis energética se encuentran alterados en ratones KO para Mecp2.

La expresión relativa fue analizada por PCR en tiempo real a partir de muestras de ADNc de Htl

medio basal de ratones de 8 semanas de edad, mantenidos en ayuno la noche previa a su

utilización. A. Expresión relativa del receptor de leptina-2. B. Expresión relativa del receptor de

insulina. C. Expresión relativa del receptor de melanocortina-4. n WT = 6 y n KO = 9 animales.

Los valores obtenidos fueron normalizados a los niveles de ciclofilina 1 por el método ΔΔCt y se

presentan como el promedio de las mediciones normalizadas ± EE. No se encontraron diferencias

significativas según Mann-Whitney Rank Sum Test.

47

4.6. Los ratones KO para Mecp2 fallan en responder adecuadamente a la administración

exógena de leptina.

Como se mostró anteriormente, los ratones KO para Mecp2 presentan una desregulación

en la expresión de genes asociados a la homeostasis energética corporal. A pesar de que estos

animales presentan una mayor cantidad de leptina y un importante aumento en la expresión de su

receptor a nivel hipotalámico, nosotros no observamos un aumento importante en los niveles

basales de expresión de Pomc. Por otra parte, y acorde con lo esperado, la expresión basal de

Agrp resultó estar levemente disminuida en los ratones KO para Mecp2. Este resultado sugiere

que las neuronas AgRP responden adecuadamente al incremento en los niveles de leptina,

mientras que las neuronas POMC son incapaces de integrar esta señal metabólica. Para

determinar si efectivamente los ratones KO para Mecp2 no son capaces de responder

adecuadamente a leptina, analizamos el efecto de la administración exógena de esta hormona en

el consumo de alimento de los animales. Para ello, animales WT y KO para Mecp2 de 6 semanas

de edad fueron mantenidos en ayuno durante las horas de luz, luego inyectados con leptina (6

mg/kg) y se analizó la ingesta de comida durante 4 horas post-tratamiento. A la semana siguiente,

los mismos animales fueron inyectados con solución salina (vehículo) como control del

experimento, y se analizó la ingesta de comida durante el mismo periodo. Como se observa en la

Figura 11, los ratones WT para Mecp2 disminuyeron significativamente la ingesta de comida en

respuesta a la inyección con leptina. Sin embargo, al tratar los ratones KO con esta hormona, no

se observó variación en la cantidad de alimento consumido con respecto a los ratones que

recibieron el tratamiento control. Estos resultados muestran que los animales KO para Mecp2 son

incapaces de responder de manera adecuada a leptina, a pesar del incremento en la expresión de

esta hormona.

48

Figura 11. Los ratones KO para Mecp2 no responden a leptina con una disminución en el

consumo de alimento. La ingesta de comida fue analizada durante 4 horas post tratamiento con

leptina (6 mg/kg) o solución salina (vehículo) en animales de 6-7 semanas de edad mantenidos en

ayuna previo a los registros en jaulas metabólicas. Los resultados presentados corresponden al

promedio de las mediciones ± EE. n WT = 3 y n KO = 5. * p < 0,05 analizado por test de T

pareado de Student.

49

El hecho que los animales KO para Mecp2 no posean una respuesta significativa a leptina

disminuyendo el consumo de alimento, sugiere una alteración en algunos de los componentes de

la vía de señalización que está bajo el control de esta hormona. El principal efecto de la leptina a

nivel central es estimular la expresión de Pomc en el núcleo arcuato del hipotálamo, lo que se

traduce en una disminución en la ingesta de comida y un aumento en el gasto energético. Para

evaluar si es que esta hormona es capaz de estimular la expresión de Pomc en los animales KO

para Mecp2, se extrajo ARN de hipotálamo medio basal de ratones WT y KO de 7 semanas de

edad tratados con leptina (6 mg/kg) o vehículo, y se cuantificó la expresión de Pomc mediante

PCR en tiempo real. Como se observa en la Figura 12, los ratones KO para Mecp2 no responden

a leptina con un aumento de Pomc como lo observado en los ratones WT, cuya expresión

aumentó casi 6 veces en respuesta a la hormona (p < 0,05, según Rank Sum Test). Estos

resultados muestran el desarrollo de leptino-resistencia en los animales KO para Mecp2,

sugiriendo que el desbalance energético observado en este modelo murino de RTT está asociado

con una alteración de la actividad transcripcional en respuesta a los niveles de leptina circulantes.

50

Figura 12. Los ratones KO para Mecp2 no responden a leptina con un aumento en la

expresión hipotalámica de Pomc. La expresión relativa de Pomc fue analizada por PCR en

tiempo real a partir de ADNc de Htl de ratones de 7 semanas de edad tratados con leptina (6

mg/kg) o vehículo previamente mantenidos en ayuna por toda la noche. nWT = 4 y nKO = 4. Los

resultados obtenidos fueron normalizados a los niveles de ciclofilina 1 por el método ΔΔCt y se

presentan como el promedio de las mediciones normalizadas ± EE. * p < 0,05 según Mann-

Whitney Rank Sum Test.

51

4.7. La expresión relativa de genes asociados a termogénesis se encuentra incrementada

en ratones KO para Mecp2.

Con el objetivo de evaluar si el fenotipo de sobrepeso observado en los animales KO para

Mecp2 estaba además asociado a una alteración en los mecanismos que regulan el gasto

energético, se extrajo ARN de iBAT interescapular de animales WT y KO de 8 semanas de edad

mantenidos en ayuno por 16 horas y se analizó los niveles de expresión relativa de genes claves

relacionados con termogénesis mediante PCR en tiempo real. Estos experimentos fueron

realizados como un indicador del gasto energético basal de estos animales. Como se muestra en

la Figura 13, la cuantificación de la expresión relativa de los principales componentes de esta vía

mostró que los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento significativo en la expresión del

receptor β-adrenérgico 3 (AdrRβ3), que es el principal receptor que responde a la inervación

simpática que posee este tejido (Figura 13A). Consecuentemente con este aumento en la

expresión de este importante receptor lipolítico, la expresión de los ARNm para las proteínas

desacoplantes mitocondriales (Ucp1, Ucp2 y Ucp3) también resultó estar aumentada

significativamente (Figura 13B). Estos resultados muestran que los animales KO para Mecp2 son

capaces de responder adecuadamente al aumento en la cantidad de tejido adiposo pardo,

incrementando la expresión de los componentes críticos que gatillan y mantienen la

termogénesis, sugiriendo la existencia de un mecanismo compensatorio en respuesta al

incremento de la cantidad de tejido graso a pesar de la leptino resistencia observada. Además,

estos resultados sugieren fuertemente una disociación de las vías de control de la ingesta de

alimento y gasto energético en algún punto previo al control del tono anorexigénico.

52

Figura 13. Los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en la expresión de los

principales genes que regulan el gasto energético en iBAT. La expresión relativa fue analizada

por PCR en tiempo real utilizando muestras de ADNc de iBAT de ratones de 8 semanas de edad

mantenidos en ayuno la noche anterior al sacrificio. A. Expresión relativa del ARNm para el

receptor β-adrenérgico 3 (AdrRβ3). B. Expresión relativa de los ARNm para las proteínas

desacoplantes mitocondriales (Ucp1, Ucp2 y Ucp3). n WT = 7 y n KO = 7-9 animales. Los

valores obtenidos fueron normalizados a los niveles de expresión de ciclofilina 1 por el método

ΔΔCt y se presentan como el promedio de las mediciones normalizadas ± EE. * p < 0,05 y ** p <

0,01 según Mann-Whitney Rank Sum Test.

53

4.8. La proteína Mecp2 no es expresada en tejido adiposo blanco y tejido adiposo pardo.

De acuerdo a lo descrito en la literatura, Mecp2 es una proteína ampliamente expresada a

nivel del sistema nervioso central y en la mayoría de los tejidos periféricos evaluados en el ratón

(Lasalle et al., 2001; Shahbazian et al., 2002a). Sin embargo, la presencia de esta proteína en

tejido adiposo no ha sido evaluada. Para determinar si el aumento en la expresión de leptina en

iWAT y de los genes asociados a gasto energético en iBAT es consecuencia de la alteración de

un mecanismo celular autónomo causado por la ausencia de Mecp2, evaluamos la expresión de

este factor de transcripción en tejido adiposo blanco y pardo. Como una primera aproximación, el

análisis se realizó por PCR convencional utilizando ADNc de iBAT e iWAT de ratones de 8

semanas de edad como templado, no detectándose expresión de Mecp2 en tejido adiposo blanco

(Figura 14A) ni en tejido adiposo pardo (Figura 14B). Este resultado fue confirmado analizando

la expresión proteica de Mecp2 mediante inmunodetección por Western blot, utilizando muestras

de proteínas de iBAT e iWAT de animales silvestres de 8 semanas de edad, no observándose

expresión de Mecp2 en ninguno de los 2 tejidos (Figura 14C). Estos resultados muestran que la

alteración en la expresión de genes asociados al balance energético corporal en adipocitos de los

ratones KO para Mecp2, es producto de un mecanismo celular no autónomo, debido a que esta

proteína no es expresada en tejido adiposo de ratones silvestres. Esto sugiere que la ausencia de

Mecp2 en otros tejidos (sistema nervioso central por ejemplo) podría desencadenar una alteración

en los tejidos periféricos que darían cuenta del incremento observado en la cantidad de tejido

adiposo y de la alteración en los patrones de expresión génica en los adipositos de este modelo

murino de RTT.

54

Figura 14. Mecp2 no se expresa en los tejidos adiposos blanco y pardo. La expresión fue

analizada preliminarmente por PCR convencional utilizando ADNc de (A) iWAT e (B) iBAT de

animales de 8 semanas de edad como templado, esperándose un fragmento de 184 pb. (-): control

negativo sin ADNc; (+): control positivo conteniendo ADNc de Htl de un animal WT para

Mecp2; Std: estándar de peso molecular (100 pb). C. Western blot para detectar la expresión de

Mecp2 en iBAT y iWAT de animales WT y KO a las 8 semanas de edad. Las proteínas fueron

extraídas con trizol, corridas en SDS-PAGE, transferidas a membrana de PVDF e incubadas con

anticuerpos específicos para Mecp2. Se utilizó β-tubulina como control de carga. (-) control

negativo corresponde a proteínas de Htl de un ratón KO para Mecp2; (+) control positivo

corresponde a proteínas de Htl de un ratón WT para Mecp2.

55

5. DISCUSIÓN

MECP2 forma parte de una familia de proteínas que se une específicamente a secuencias

de ADN metilado en CpG, regulando de esta manera la actividad transcripcional de sus genes

blanco (Chahrour et al., 2008). Mutaciones en el gen que codifica para MECP2 son la principal

causa del síndrome de Rett, un desorden del neurodesarrollo asociado a retardo mental y

características autistas en mujeres (Hagberg et al., 1983; Amir et al., 1999). Un punto importante

de este síndrome, es que tanto las pacientes como los modelos murinos de la enfermedad

presentan alteraciones asociadas al balance energético, principalmente relacionadas a problemas

con la regulación del peso corporal (Chahrour y Zoghbi, 2007; Zappella et al., 2001). Sin

embargo, la base molecular y fisiológica que lleva a esta desregulación no ha sido descrita a la

fecha.

En la presente tesis, analizamos el fenotipo de sobrepeso exhibido por ratones KO para

Mecp2, con el fin de poder determinar la participación de esta proteína en el mecanismo central y

periférico que regula el balance energético corporal. Para llevar a cabo este objetivo, nosotros

utilizamos un modelo murino de RTT el cual no expresa Mecp2 (Mecp2 KO), además de

animales silvestres (Mecp2 WT), y analizamos distintos parámetros que dan cuenta del estado

general del balance energético corporal. Los animales fueron genotipificados por PCR

convencional alrededor de las 3 semanas de edad utilizando partidores específicos para el alelo

WT y KO, siendo posible la identificación del genotipo de los ratones sólo por la diferencia en el

tamaño del producto de amplificación obtenido (Figura 4).

Una vez determinados los genotipos de los animales, estos fueron pesados semanalmente,

como una primera aproximación que nos pudiera dar cuenta de problemas asociados al balance

56

energético corporal en nuestro modelo de investigación. El análisis mostró que los ratones KO

para Mecp2 presentaron un incremento significativo en el peso corporal a partir de las 8 semanas

de edad en comparación a los ratones WT. Al analizar por separado las curvas de peso corporal,

se observó que tanto los animales WT como los KO aumentan su peso de manera significativa

entre las 4 y las 6 semanas de edad, lo que era esperado debido a la etapa de crecimiento en la

cual se encontraban los animales. Sin embargo, entre las 7 y 8 semanas de edad los ratones KO

siguieron aumentando su peso de manera significativa, mientras que los ratones WT no

experimentaron alzas de peso importantes después de las 6 semanas de edad. Estos resultados

muestran que este modelo mutante nulo para Mecp2 presenta, en términos generales, una

alteración en la regulación del balance energético corporal que provoca este aumento de peso a

partir de las 7 semanas de edad. Este incremento en el peso corporal se generó en una etapa más

temprana a lo observado en animales hipomorfos para Mecp2 (Kerr et al., 2008), y se

correlaciona con las observaciones reportadas en la literatura acerca del desarrollo de sobrepeso

en animales mutantes nulos para Mecp2 (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001). Es importante

mencionar que en este trabajo sólo se utilizaron ratones mantenidos en un background mixto

129/B6, ya que el desarrollo de sobrepeso exhibido por los ratones KO para Mecp2 es

dependiente del background genético en el cual se trabaje, habiendo sido reportado que sólo el

background mixto es el que desarrolla ganancia de peso (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001). En

conjunto, estos resultados indican la existencia de uno o más genes moduladores que median los

efectos de Mecp2 en la regulación del peso corporal, y sugieren que la presencia de esta proteína

en el desarrollo post-natal es de vital importancia para un adecuado control del balance

energético corporal.

57

Uno de los parámetros más importantes que explicaría el sobrepeso observado en los

ratones KO para Mecp2 es un incremento en la cantidad de alimento ingerido. Para contestar esta

interrogante, comparamos la ingesta de comida de ratones WT y KO para Mecp2 entre las 5 y 7

semanas de edad, que corresponde al periodo previo en el que se desencadena el aumento en el

peso corporal. Cabe mencionar que los registros fueron realizados durante el ciclo de oscuridad

de los animales (8 PM – 8 AM), que es el periodo en que los ratones presentan su mayor

actividad. Al contrario de lo esperado, nosotros observamos una disminución en el consumo de

alimento de los ratones KO para Mecp2 en relación a sus hermanos WT, la cual resultó ser

independiente de la edad de los animales, indicando que el aumento de peso observado en nuestro

modelo de investigación no puede ser explicado por una mayor ingesta de comida. Si bien es

probable que estos animales ingieran más alimento durante el ciclo de luz, la comida fue

restringida solo al ciclo de oscuridad durante los análisis, con el fin de poder eliminar esta

posibilidad. Este resultado sugiere la existencia de otras alteraciones que den cuenta del fenotipo

de sobrepeso observado en los ratones KO para Mecp2, ya sea a nivel central o periférico, como

por ejemplo alteraciones en los mecanismos que regulan el gasto energético, problemas con el

metabolismo lipídico, entre otros.

Si bien los animales KO para Mecp2 presentan un menor consumo de alimento en

relación a sus hermanos WT, aun así presentan sobrepeso. Con el fin de analizar otros factores

que pudieran explicar el aumento de peso en nuestro modelo de investigación, comparamos la

cantidad de tejido adiposo que presentaban ambos genotipos a las 8 semanas de edad. Nuestros

resultados mostraron un gran incremento en la cantidad de iWAT e iBAT en los ratones KO para

Mecp2, indicando que el sobrepeso exhibido por estos animales está determinado, al menos en

parte, por una excesiva acumulación de grasa corporal. Además, nosotros encontramos una

58

mayor producción de leptina en iWAT de los ratones KO, acorde con el aumento de la cantidad

de este tejido. Esta incrementada adiposidad se correlacionó con lo reportado en animales

hipomorfos para Mecp2 (Kerr et al., 2008), sugiriendo un importante rol de Mecp2 en la

modulación del metabolismo lipídico, ya sea en los mecanismos que regulan el almacenamiento

de grasas o bien en aquellos relacionados a su degradación para la obtención de energía. En esta

línea, resultados recientes de otro estudio realizado en nuestro grupo de investigación muestran

que los ratones KO para Mecp2 presentan un desbalance en la expresión de genes asociados a

metabolismo lipídico en iWAT, incluyendo una mayor concentración de leptina en plasma,

sugiriendo que la acumulación de grasa en este modelo murino es producto de una incapacidad de

metabolizar adecuadamente este tipo de reservas energéticas (Mancilla-Medina et al., 2012)1,

siendo esta alteración uno de los puntos claves que podrían explicar el incremento de peso que

presentan los ratones KO para Mecp2.

El aumento de peso no asociado a un mayor consumo de alimento sugiere fuertemente

una alteración en el mecanismo central que regula el balance energético corporal. Para analizar

esta premisa, mediante PCR en tiempo real evaluamos los niveles de expresión basal de Pomc,

Agrp, y de los principales receptores hormonales (LepR2, InsR y Mc4R) que participan en la

regulación central del balance energético, a partir de muestras de hipotálamo medio basal de

ratones WT y KO para Mecp2 de 8 semanas de edad. Nosotros encontramos una importante

tendencia a la disminución en la expresión de Agrp en los ratones KO para Mecp2, mientras que

no observamos diferencias en los niveles de expresión de Pomc. Además, estos animales

presentaron un importante incremento en la expresión del receptor de leptina en insulina (LepR2

1 Mancilla-Medina, C., Moldenhauer, R.A. y Kerr, B. (2012). Alteración en la expresión de genes asociados a

metabolismo lipídico en tejido adiposo blanco de ratones mutantes nulos para Mecp2. XXVII Reunión Anual de la

Sociedad Chilena de Ciencias Fisiológicas, Puerto Varas, Chile. P49.

59

e InsR), indicando que la activación de las vías de señalización comandadas por estas hormonas

se encuentra incrementada con el fin de estimular la respuesta anorexigénica por sobre la

orexigénica producto del sobrepeso que presentan los animales KO. Por otra parte, la expresión

de Mc4R no mostró diferencias entre ambos genotipos, lo que sugiere que la activación de las

neuronas de segundo orden (localizadas en el PVN) a través del sistema de las melanocortinas vía

MC4R no se encuentra alterada. Tomando en conjunto, estos resultados indican que las neuronas

AgRP de los ratones KO para Mecp2 son capaces de responder adecuadamente a las altas

concentraciones de leptina circulantes que presentan estos animales, disminuyendo los niveles de

expresión de Agrp, y no así las neuronas POMC, producto de que no observamos un aumento de

Pomc, lo que es consistente con la falta de respuesta a leptina. Más aún, la administración

exógena de leptina disminuyó significativamente la ingesta de comida e incremento la expresión

de Pomc a nivel hipotalámico en los ratones WT para Mecp2, no observándose esta respuesta en

los animales KO, sugiriendo fuertemente la generación de leptino resistencia hipotalámica (al

menos en las neuronas POMC) en nuestro modelo de investigación.

Como se mencionó anteriormente, las alteraciones moleculares y fenotípicas observadas

en los ratones KO para Mecp2 se correlacionan con las evidencias previas reportadas que indican

la existencia de una desregulación en los mecanismos que controlan el balance energético

corporal producto de la ausencia total o parcial de Mecp2 (Chen et al., 2001; Guy et al., 2001;

Kerr et al., 2008; Pelka et al., 2006). Si bien la falta de respuesta de las neuronas POMC para

responder a leptina no explica por sí sola el aumento del peso corporal, esto sumado al hecho que

los ratones KO para Mecp2 presentan además una mayor cantidad de tejido adiposo, sugiere que

ambos factores intervienen y podrían dar cuenta del fenotipo de sobrepeso observado. A pesar

que los animales KO presentan una disminución en el consumo de alimento basal en relación a

60

sus respectivos controles, no disminuyeron de manera significativa la ingesta en respuesta a la

administración de leptina producto de la generación de leptino resistencia en las neuronas POMC

hipotalámicas. El menor consumo basal de alimento puede ser explicado debido a la tendencia a

disminuir que encontramos en los niveles de expresión de Agrp de los ratones KO para Mecp2,

como una manera de responder compensatoriamente al sobrepeso, y además, producto del

fenotipo neurológico y motor propio de estos animales. Por lo tanto, debido al sobrepeso que

presenta este modelo de investigación, lo que se esperaría es que los animales KO respondieran

disminuyendo enormemente el consumo de alimento con respecto a los WT, como un mecanismo

compensatorio que les permita controlar de manera adecuada el peso corporal, situación que no

ocurre producto de la resistencia a la leptina en las neuronas POMC que son las que gatillan la

disminución en la ingesta de comida. Debido a que estos animales además presentan alteraciones

a nivel del metabolismo lipídico que podrían impedir un correcto almacenamiento y/o

degradación de este tipo de reservas energéticas (Mancilla-Medina et al., 2012)1, el hecho de que

no exista una gran disminución en la ingesta de comida de los ratones KO para Mecp2 podría

estar favoreciendo la acumulación de ácidos grasos en el tejido adiposo, lo que explicaría el

aumento en la cantidad de este tejido, y por consiguiente el sobrepeso.

De acuerdo a nuestros resultados, la resistencia hipotalámica a la leptina en los ratones

KO para Mecp2 es producto de una inadecuada respuesta de las neuronas POMC a esta hormona,

lo que se traduce en que no se produzca un aumento en la expresión de Pomc que permita

disminuir en gran manera la ingesta de comida. Esta alteración en la respuesta de las neuronas

POMC puede ser explicada debido a evidencia de nuestro grupo de investigación que muestra

que si bien los ratones KO para Mecp2 presentan un incremento en la expresión y fosforilación

de STAT3 acorde con los mayores niveles de leptina circulantes y con la activación de esta vía de

61

señalización, también presentan un aumento en la expresión de FoxO1 a nivel hipotalámico, que

es un factor de transcripción que inhibe la expresión de Pomc producto de que se une al promotor

de este gen e impide la interacción de STAT3 fosforilado con esta misma región, que es el

mecanismo que activa la expresión de Pomc en las neuronas del mismo nombre. Más aun, este

mismo trabajo muestra que la translocación de FOXO1 desde el núcleo al citoplasma está

disminuida en los ratones KO para Mecp2, lo que explicaría el hecho de que no se gatille un

aumento en la expresión de Pomc a pesar de los altos niveles de leptina circulantes (Torres-

Andrade et al., 2012)2. Por otra parte, experimentos de inmunofluorescencia realizados en este

estudio indican que Mecp2 se expresa ampliamente en hipotálamo, y específicamente en el

núcleo arcuato, sugiriendo que la presencia de Mecp2 en estas áreas cerebrales es esencial para la

regulación transcripcional de la expresión de Pomc, y por consiguiente, para mantener un

adecuado control del balance energético y del peso corporal. Estos resultados además proponen

un mecanismo que explicaría la generación de leptino resistencia en este modelo murino de RTT

asociado a una disminución en la vía anorexigénica central comandada por las neuronas POMC.

Es importante mencionar que a la fecha han sido propuestos varios mecanismos para explicar la

generación de leptino resistencia hipotalámica, entre los que se incluyen alteraciones en las vías

de señalización de esta hormona en las neuronas hipotalámicas, inflamación hipotalámica, estrés

de retículo endoplásmico, y defectos en los procesos de autofagia (Jung y Kim, 2013; Sahu,

2003). Sin embargo, la alteración en la translocación de FOXO1 en los ratones KO para Mecp2,

que de acuerdo a los resultados presentados causaría la resistencia a la hormona en nuestro

modelo de investigación, no había sido descrita a la fecha, proporcionando nuevas evidencias

2 Torres-Andrade, R., Moldenhauer, R., Soto-Covasich, J., Rios-Silva, M., Parada, F. and Kerr, B. (2012). Deletion

of MECP-2 increases body weight by altering the transcriptional control of the proopiomelanocortin gene. 15th

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62

para la investigación de los mecanismos involucrados en la generación de leptino resistencia bajo

condiciones de sobrepeso u obesidad.

Nosotros además analizamos molecularmente como se encontraba la respuesta

termogénica en los animales KO para Mecp2. La termogénesis es un mecanismo adaptativo

presente en mamíferos pequeños y recién nacidos, el cual se encarga del mantenimiento de la

temperatura corporal. En este contexto, el tejido adiposo pardo es uno de los principales

determinantes de esta respuesta, y por consiguiente, del gasto energético. Este tejido se encuentra

ampliamente inervado por el sistema nervioso simpático, cuyo principal receptor involucrado es

el AdrRβ3 (receptor β-adrenérgico 3), respondiendo a las concentraciones de catecolaminas

liberadas por las neuronas postganglionares (Cannon y Nedergaard, 2004). Nosotros encontramos

un incremento significativo de la expresión de este receptor en iBAT de ratones KO para Mecp2

a las 8 semanas de edad, sugiriendo que este tejido está respondiendo de manera adecuada al

incremento en el peso corporal, probablemente aumentando su sensibilidad a noradrenalina,

como un mecanismo compensatorio para aumentar el gasto energético. Además, estos animales

mostraron un aumento significativo en la expresión de los ARNm para las proteínas

desacoplantes mitocondriales Ucp1, 2 y 3 en este tejido, lo que avala la generación de este

mecanismo compensatorio, sugiriendo que la vía de señalización comandanda por la activación

del receptor AdrRβ3 también se encuentra incrementada, lo que finalmente llevaría a un aumento

en la generación de calor por parte de este tejido en estos animales, y por lo tanto, un aumento en

el gasto energético. Estudios recientes han demostrado que las neuronas del hipotálamo

dorsomedial (DMH) presentan una gran expresión de LepRb, las cuales proyectan directamente a

neuronas ubicadas en el PVN, y también a otras neuronas premotoras que tienen la capacidad de

incrementar la actividad simpática (Gautron et al., 2010), sugiriendo que las neuronas sensibles a

63

leptina en el DMH están involucradas en la estimulación de la termogénesis a través del sistema

nervioso simpático. Por otra parte, ha sido demostrado que la hiperleptinemia en ratones obesos

incrementa la actividad simpática en iBAT por un mecanismo independiente de la via de las

melanocortinas, a pesar de que estos animales fueron resistentes a los efectos anoréxigenicos de

la leptina (Enriori et al., 2011). Estas evidencias son consistentes con la tendencia al aumento que

nosotros observamos en la expresión hipotalámica de LepR2 y el incremento en la expresión y en

los niveles circulantes de leptina en los ratones KO para Mecp2, generando una mayor activación

del tono simpático, lo que se traduce en una mayor actividad termogénica del iBAT. Estos

resultados además indican que la ausencia de Mecp2 en nuestro modelo de investigación no

altera la función de las neuronas sensibles a leptina en el DMH, al menos en lo que respecta a su

participación en la regulación de la actividad termogénica del iBAT, y además apoyan la idea de

la generación de un mecanismo compensatorio para responder al aumento en el peso corporal.

Nosotros llevamos a cabo mediciones preliminares de la temperatura corporal en

animales WT y KO para Mecp2 mediante una sonda rectal, con el fin de poder determinar si es

que la respuesta molecular de este tejido generaba efectivamente un aumento de la temperatura

corporal. Sin embargo, debido a lo invasivo de esta determinación, no nos fue posible obtener

resultados fiables y representativos de este parámetro. Además, ha sido demostrado

recientemente que un aumento en la temperatura específica del iBAT producto de la activación

simpática no se correlaciona con un aumento de la temperatura corporal, sugiriendo que la

medición puntual de la temperatura en este tejido es un marcador más sensible de su activación

en comparación a las determinaciones de cuerpo completo (Enriori et al., 2011).

64

Finalmente, para determinar si la respuesta observada por parte del tejido adiposo blanco

y pardo aumentando la expresión de leptina y de los componentes claves que regulan el gasto

energético era producto de un mecanismo celular autónomo, analizamos si Mecp2 se expresa en

los tejidos adiposos de animales de 8 semanas de edad. No detectamos expresión de Mecp2

mediante RT-PCR y ensayos de western blot. Esto indica que esta proteína no se encuentra

presente en tejido adiposo (ya sea blanco o pardo), al menos durante la etapa adulta de los

ratones. Estos resultados muestran que el aumento en la cantidad de tejido adiposo observado en

los ratones KO para Mecp2, así como la alteración en los patrones de expresión de genes claves

en la regulación del balance energético corporal en este tejido, son producto de un mecanismo no

autónomo de este tipo celular, sugiriendo que las vías centrales que comandan estas respuestas

periféricas se encuentran alteradas debido a la ausencia de Mecp2, con el fin de generar un

mecanismo compensatorio para contrarrestar el aumento en el peso corporal.

Los resultados obtenidos muestran una alteración puntual de sólo uno de los grupos

neuronales encargados de la regulación central del balance energético corporal. Es por esto, que

actualmente en nuestro grupo de investigación se está generando un ratón KO condicional que no

expresa Mecp2 exclusivamente en las neuronas POMC del núcleo arcuato del hipotálamo, con el

fin de determinar de manera específica la contribución parcial de este grupo neuronal discreto al

fenotipo exhibido por este modelo de investigación. Paralelamente, se está trabajando en la

construcción del animal KO condicional para Mecp2 en las neuronas AgRP, de manera de poder

evaluar el impacto de la deleción de Mecp2 específicamente en cada uno de los grupos

neuronales de primer orden encargados de la regulación central del balance energético corporal

(datos no publicados). Es importante recalcar que las alteraciones fenotípicas y moleculares

presentadas en este trabajo son producto de la ausencia total de Mecp2, por lo que además de la

65

generación de los animales KO condicionales mencionados anteriormente, queda como

proyección el estudio específico del impacto de la deleción de Mecp2 en otras regiones

hipotalámicas que también participan en la regulación del balance energético, como son el PVN,

el hipotálamo lateral y el hipotálamo dorsomedial, así como también el análisis de otras zonas

cerebrales y periféricas que participan en el control de la ingesta de comida y el gasto energético.

La metilación del ADN es un mecanismo epigenético que participa en la regulación de la

expresión génica en respuesta a distintas señales ambientales. En relación a esto, Mecp2 es capaz

de unirse al ADN metilado y regular la expresión de sus genes blancos a través de esta unión.

Resultados recientes de otro trabajo de tesis realizado en nuestro grupo de investigación muestran

que existe una hipermetilación de las islas CpG del promotor de Pomc en los ratones KO para

Mecp2 (Rios-Silva, 2013), indicando que esta modificación epigenética producto de la ausencia

de Mecp2, sumada a las alteraciones moleculares presentadas anteriormente que llevan a una

disminución del tono anorexigénico a nivel central en estos animales, son las que en conjunto

desancadenan el desarrollo de sobrepeso en nuestro modelo de investigación, y además, apoyan

la idea de la existencia de un mecanismo regulatorio directo de la expresión de Pomc por Mecp2.

La importancia de este trabajo radica en mostrar las primeras evidencias de una serie de

alteraciones fenotípicas y moleculares que podrían dar cuenta de la inadecuada regulación del

balance energético en modelos mutantes nulos para Mecp2, ya que si bien ha sido reportado que

estos animales presentan problemas en el control del peso corporal, no existen estudios que

muestren la base fisiológica y molecular de este desbalance. El descubrimiento de la causa que

determina el aumento de peso en este modelo de RTT, puede contribuir enormemente al

entendimiento de la base molecular que lleva al desarrollo de obesidad en humanos, que

66

actualmente se ha transformado en unos de los problemas más investigados por las diversas áreas

de las ciencias biológicas, y además, puede llevar a la identificación de potenciales blancos

terapéuticos o al desarrollo de estrategias moleculares que permitan controlar y/o combatir esta

epidemia a nivel mundial.

67

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